血管内皮细胞的分离和培养

血管内皮细胞的分离和培养 穆杨, 张彦明 ()西北农林科技大学 动物科学与动物医学学院, 陕西 杨凌 712100 摘 要: 血管内皮细胞位于循环血液与血管壁内皮下组织之间, 是一种多功能的细胞。 本文综述了血管 内皮细胞分离和培养的, 并对内皮细胞的鉴定及分离和培养中常见因素进行了介绍, 阐明了血管内 皮细胞分离和培养方法的完善具有广阔的应用前景。 关键词: 血管内皮细胞; 分离; 培养 () 文章编号: 1008- 9381 200005- 0033- 04 中图分类号: 852. 2 文献标识码: SA (), 固定两端后, 从未结扎的一端注入 0. 25% 的管一端血管内皮细胞 , V a scu la r E n do th e lia l C e llV EC 位于循环血液与血管壁内皮下组织之间, 裱衬于整个 胰 酶 或 0.1% 的 胶 原 酶 或 500 ƒ的 , 37 U mL d isp a se 心血管系统的内表面, 为单层扁平上皮, 是血管壁与 ?温浴 15, 20 后, 就可以收集消化下来的内皮m in 血液之间的分界细胞, 形成心血管封闭系统的形态基 细胞了。 这一过程说起来简单, 但实际操作中困难却 很多。 首先是采集标本时无菌条件要严格, 如果此步 础。 它不仅是一机械屏障, 而且是一种多功能的细 1 已经污染, 则后面的实验就谈不上了, 因此采集标本 , 除了活跃地参与血小板功能调节、血浆促凝因胞 时 要特别强调无菌概念。 其次是标本保存的时间,子的激活、活化的凝血因子的清除及纤溶过程外, 还 4, 8 ( )最初强调保存时间不得超过 3 , 后来培养条 通过 产 生 的 内 皮 素 、内 皮 细 胞 衍 生 舒 张 因 子 J affe h E T 9 () 等血管活性物质来调节血管张力, 维持正常 ED R F 件改进, 保存的时间也随之延长。 张宝庚等的经验 的血液流动性。 一旦 受损, 必然影响甚至破坏是保存时间最好不超过 V EC 24 。 目前大多数文献报道 h 正常的生物学功能, 一方面会增加它的通透性 均以不超过 12 为准。血管可以保存在 4?灭菌的磷V EC h () 而失去屏障功能, 另一方面会产生较多的促栓物质及 酸盐缓冲液 中。 如果条件许可, 血管取下后立 PB S 减少抗凝物质的产生, 导致出血及血栓性疾病的发即培养最好, 既利于细胞贴壁, 也利于细胞生长。第三 2 是消化酶, 分离血管内皮细胞, 除了操作以外, 酶液的 生。 性质是影响分离效果的决定性因素。自从用胶原酶成 的重要功能使得它的体外培养研究日益受 V EC ( ) 到重视。首次报道了人 的培功分离脐静脉血管内皮细胞以来, 现已得到广泛应 1963M a ru gam a V EC 用, 从分离细胞数量、保持细胞活性和细胞结构完整 养, 但有两个问题未得到解决: ?维持内皮细胞的纯 10 3 性来看 , 胶原酶是理想的血管内皮细胞分离酶。但 培养, ?鉴定所培养的细胞是内皮细胞。后来, J affe 45 胶原酶价格昂贵, 所以许多学者又研究用胰酶代替胶 等 和 等解决了上述问题, 使得人 G im b ro n e V EC11, 12 原酶分离血管内皮细胞, 目前已有许多的报道。 培 养能够应用于多方面的研究工作中。 目前, 体外 13 分离血管内皮细胞的。 张宝 也 有报道用 d isp a se 的培养技术已为阐明许多疾病的病理生理机制 V EC 96 庚 研究表明胰蛋白酶对内皮细胞损伤大, 影响细胞提供了良好的手段。 1 的分离贴壁和生长, 胶原酶和 d isp a se 均可以, 但 d isp a se 在 V EC 最 早 是 从 人 脐 静 脉 中 分 离 出 来 的, 由 于 收集的细胞数目上不如胶原酶多, 细胞的贴壁和生长V EC 10 在动脉粥样硬化中起着重要的作用, 所以关于 同胶原酶相似。孙继虎等研究比较了用单纯胰酶、 V EC ( ) 人 分 离 培 养 的 报 道 很 多, 主 要 以 脐 静 脉 为 来V EC 全胶原酶和胰酶胶原酶 5?1混合液消化牛主动脉 7 内皮细胞的能力, 结果表明, 单纯胰酶分离 的 源。王瑞锦等报道了人脐动脉内皮细胞的生长和增V EC 殖。 也有不少关于动物 培养的报道。 到目前为 数量比全胶原酶少得多, 而采用胰酶2胶原酶混合液 V EC 消化的方法, 收获量基本接近全胶原酶 的 止, 虽然各研究者所采用的分离 的方法在操作V EC V EC V EC 收获量, 在混合液中胶原酶仅占有 16, 这种方法既 ƒ上有差异, 但基本上用的都是酶消化法。具体操作时, 无菌剪取血管标本, 要求长度在 10 以上, 若有分 经济效果又好。 第四是酶消化的时间和温度, 大多数cm 文献中报道的均为 37?消化 10, 30 , 但也有其 支, 需在剪断前进行结扎。 先用预先温热的 2m in D H an k s 11 液或 PB S 液中冲洗干净血管内的残血, 然后结扎血它温度和时间, 如蔡晓莉等消化牛胸主动脉和肺 动脉内皮细胞采用的是 39?温浴 8, 15 ; 于景翠功能的表达。关于内皮细胞无血清培养基已有多篇报m in 14 道, 适 用 于 内 皮 细 胞 的 无 血 清 培 养 基 为等 报 道 消 化 人 脐 静 脉 内 皮 细 胞 用 22?保 温 25 1515130; 鄂征 报道消化人脐静脉内皮细胞用 37? 3,, 无血清培养基可有效地支持牛、猪、犬M CDB m in 10 , 这均为各研究者自已的经验。首次做时, 应做和羊的大血管内皮细胞的增长并维持正常的生理功m in 14 预实验, 找出最佳消化时间, 以防消化不足细胞未脱 还报道了适于人脐静脉内皮细胞的 能。 于景翠等 落, 也要避免因消化过度使内皮细胞底层的成纤维细 无血清培养基, 可有效支持人脐静脉内皮细胞的长期 17 胞混入。第五是所用酶的浓度, 一般无大的差异, 胶原培养。 梅丹等也报道了人内皮细胞无血清培养方 酶常用浓度为 0. 1% 或 200 胰酶常用浓度为法, 效果很好。为了提高内皮细胞的贴壁率, 有人提倡 ƒ, U mL 0. 25% , 为 500 。ƒ用纤维粘连蛋白、鼠尾胶原或明胶涂布培养面来培养 d isp a se U mL 18 、19 20 20 2 V EC 的培养 内 皮 细 胞, 但 等及 等N o r r is U n de rw oo d 报道, 血清中所含的纤维粘连蛋白和亲源性物质可共 将含有细胞的酶液收集在尖头离心管中, 并用 同介导细胞与玻璃之间的粘附。培养基中加入内皮细 或 2冲洗血管 2, 3 次, 洗液合并入离心 PB S D H an k s ( ) 管中, 1000, 2000 , 10 , 弃去上清液, 加 ƒ5 rm in m in 胞 生 长 因 子 , 可 促 进 内 皮 细 胞 的 生 长, 但EC GF 细胞生长液, 制成细胞悬液, 转入细胞培养瓶中, 即可 价格十分昂贵。胰岛素具有促进内皮细胞增殖 EC GF 在 37?、5% 的培养箱中培养。 在这一操作过程 的作用。体外可培养的内皮细胞还可以自分泌方式释 CO 2 22 23 放成纤维细胞生长因子、钙调素样蛋白等促进 中培养基质及血清的选择与搭配对于内皮细胞的体 外培养至关重要。培养基质提供细胞在体外生存代谢 自身的增殖。 所需的基本营养物质, 血清中的多种因子是内皮细胞 3 的鉴定V EC 体外生存和增殖的必要条件。合成培养基是在研究和 体外培养的内皮细胞, 不管是人或动物的内皮细 了解细胞所需成分基础上配制而成的, 目的在于创造 胞, 酶刚消化下来的为圆形或椭圆形, 单个或成小团 出与体内相似的生存环境。 它们具有固定的组成成 存在, 形成单层后, 细胞间存在典型的接触抑制。在相 分, 利 于 控 制 实 验 条 件 标 准 化, 从 营 养 要 求 上 讲, 差显微镜下观察, 细胞呈多角形, 互不重叠, 呈典型的 、21640、等合成培养基均可用于培 199 铺路石状镶嵌排列。人脐静脉内皮细胞接种后 2, 7 M EM R PM IM d3 、9、12 养血管内皮细胞, 其中以 和 21640 用的 融合成单层; 牛主动脉内皮细胞 3, 5 汇合成199 M R PM Id 10最多, 而且以的营养价值高。 这些培养基均含 ; 大鼠主动脉内皮细胞 14 才基本形成单层199 单层M d 9 铺石状。 有至少 13 种氨基酸, 即精氨酸、组氨酸、亮氨 酸、异 2小体为内皮细胞的特征结构, 培 亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、W e ib e lP a lade 只含有这养 2, 4 的内皮细胞在透射电镜下观察, 除一般细 酪氨酸、缬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。M EM d 13 种氨基酸, 维生素种类也较少; 而含有的氨胞器外, 饮液小泡、微丝, 特别是 2小体199 M W e ib e lP a lade 基酸种类多达 21 种, 维生素种类也很多; 21640均能看到。细胞融合后, 细胞间有部分连接存在, 相邻R PM I 16 介于与之间。 但合成培养基只能维 199 细胞膜的密度增厚。 胞浆内的微丝有二型; 一为较粗 M EM M 微丝, 直径约 12 , 有时位于核膜附近形成粗大的持细胞不死, 不能促进细胞增殖和生长, 使用时还需 nm 添加天然培养基, 目前培养血管内皮细胞使用的主要 微丝束; 另一型为较细的微丝, 直径约 6, 7 也成 nm 为牛血清。血管内皮细胞对血清质量和浓度要求均较 束存在。 () 高, 有条件的用 5% 胎牛血清加 10% 小牛血清效果很 第 因子相关抗原 2 是血管内皮细胞 ? ?F RA g 24 好, 无胎牛血清时可将小牛血清含量增至 20% , 进口 一个可靠的标记物。 培养的内皮细胞可用荧光标 6 记的抗 2 抗体进行免疫荧光检测或免疫组化 ?血清培养的效果远高于国产血清。王建民等培养大 F RA g () 染色, 只要证明有 2 的存在就可以确定为内?鼠血管内皮细胞要求胎牛血清 和新生小牛 F RA g G IBCO 血清的含量均为 10% 。需要注意的是, 血清在提供细 皮细胞。 胞增值所必需的生长因子的同时, 由于它的成分十分 在常规内皮细胞培养中, 主要是与来自血管壁的 复杂, 特别是对于基础理论研究, 因用血清也可能影 平滑肌细胞和成纤维细胞相区别, 只要能确定: ?铺 路石状排列的单层多角形细胞, ?接触抑制, 就可以 响实验结果, 此外血清中也含有一定量的有毒物质和 抑制物及对细胞有去分化作用的成分, 可能影响细胞 准确地加以区别。 王1 旬, 王克强, 赵子琴等 1 切应力对培养人脐静脉内皮细胞的影响艾 验和准备时也要考虑这些因素。 ( ) [] 1 解剖学杂志, 1997, 20 1: 81, 85 J 供体的年龄是影响内皮细胞增殖和分化能力的 2 陈云波, 何燕飞 1 血管内皮细胞的生物学功能 [ . 生物学通报,J 因素之一。 原则上讲所有个体均可作为供体, 但幼年 ( ) 1994, 29 11: 11, 13 个体比老年者易于培养, 而且增殖分化能力强。因此,3 陈铁镇, 张宝庚, 王速等 1 培养人内皮细胞的研究 [. 中华病理学 J ( ) 杂志, 1987, 16 2: 136, 139 除人内皮细胞外, 多取材于幼年动物或胚胎。 取材的 . 4 J affe E AC u ltu re o f h um an endo th e lia l ce lls de r ived f rom 部位由于受操作的影响, 多数研究者取的 . um b ilica l ve in sIden t if ica t io n by m o rp ho lo g ic and imm uno lo g ic 均为主动脉、肺动脉等较粗的血管, 这些血管粗, 容易[. , 1973, 52: 2745c r ite r ia J J C l in In ve st 灌注。而关于微血管内皮细胞的分离和培养与大血管 . . G im b ro ne M AH um an va scu la r endo th e lia l ce lls in cu ltu re5 的操作方法完全不同, 将另有叙述。 [. , 1974, 60: 673G row th and N DA syn th e sis J J Ce ll B io l 王建民, 施永德, 步燕芳等 1 大鼠脑血管内皮细胞的分离培养与形 6 培养液的 值也是影响内皮细胞生长的重要 pH ( ) 态学观察[. 解剖学杂志, 1998, 21 6: 495, 498J 因素之一。 内皮细胞生长的最适 值为 7. 2, 7. 4。pH 王瑞绵, 严四新, 孟杨等 1 原代培养人脐动脉内皮 的生长与增 ce ll 7 9 张宝庚等用酸度计和石蕊试纸对比测定发现, 如开( ) 值[] 1 解剖学报, 1995, 26 3: 294, 298J ( ) 始时培养液的 只稍低一些 7. 0 左右, 则更有利 pH . [. ,J affe E AC u ltu re o f h um an endo th e lia l ce lls J Tran splan t proc 8 ( ) 1980, 12 3 Supp l 1: 52, 54 于细胞贴壁和生长。 张宝庚, 陈铁镇, 张晶范等 1 人脐静脉及大鼠主动脉内皮细胞的培 9 培养瓶的性质也很重要, 使用国产的玻璃培养 ( ) 养[J . 中华心血管病杂志, 1985, 13 1: 52, 54 瓶, 细胞不易贴壁和生长, 经多次使用后才可逐渐贴 张继虎, 汪洋, 于彦铮等 1 血管内皮细胞的体外培养及形态学观10 壁、生长。 而使用 塑料培养皿, 细胞易于贴壁 F a lco n ( ) 察[J ] 1 解剖学杂志, 1996, 19 3: 261, 253和生长。 蔡晓莉, 周传农, 王秀琴等. 缺氧培养主动脉和肺动脉内皮细胞的11 4 2 细 胞 的 接 种 密 度 一 般 均 要 求 在 10个ƒ以 cm 形态改变 及 对 川 芎 嗪 芪 的 影 响 [ .中 华 病 理 学 杂 志, 1995, 24 J ( ) 1: 50 上。 12 阮秋蓉, 邓仲端, 徐增缓等 1 培养人脐静内皮细胞产生单核细胞 杂细胞的污染是内皮细胞培养中常见的问题, 以 ( ) 趋化因子的研究[. 中华病理学杂志, 1991, 20 3: 205, 207J 成纤维细胞的混入常见, 由于成纤维细胞生长迅速, 陈铁镇, 宋继谒, 杨向红等 1 脂质过氧化对培养人内皮细胞的细 13 ( ) 胞的损伤作用[] 1 中华病理学杂志, 1989, 18 1: 15, 17 于景翠随着传代次数的增加, 在培养细胞中成纤维细胞所占 J 译. 培养人脐静脉内皮细胞的一种无血清培养基 [ . 国外 J 医学遗比例日渐增加。 清除成纤维细胞可用机械刮除法、胶 14 ( ) 传学分册, 1995, 18 5: 333, 334 () 原酶消化法 成纤维细胞对胶原酶较为敏感等。王毅 2515 鄂征主编. 组织培养和分子细胞学技术 [M . 北京: 北京出版社, 等 比 较 了 0. 25% 柠 檬 酸 胰 酶、0. 25% 胰 酶 和 1997. 2胰酶三种消化剂的效果, 结果表明, 用 0. 25% ED TA 16 殷震, 刘景华主编. 动物病毒学, 第 2 版. 北京: 科学出版社 柠檬酸胰酶消化清除成纤维细胞为较满意的方法, 主 梅丹译. 针对白细胞粘附应用提供的人内皮细胞无血清培养方法17 要具有以下几个优点: ?作用温和, 对内皮细胞无损 ( ) [. 国外医学遗传学分册, 1995, 18 5: 335, 336J , , , . M ac iag T H oo ve r G A S tem e rm an M B e t a l Se r ia l 18 伤, ?对成纤维细胞的消化能力强于对内皮细胞, ? [ . ,p rop aga t io n o f h um an endo th e lia l ce lls in v it ro J J Ce ll B io l 作用后内皮细胞贴壁、复苏和繁殖速度快, ?试剂便 ( ) 1981, 91 2: 420 宜, 比传统的胶原酶法经济得多。 王珙, 吴中立, 郑尊等. 肺动脉内皮细胞的分离、培养和鉴定 [ .J 19 自从血管内皮细胞成功地分离和培养以来, 对于 ( ) 细胞生物学杂志 1991, 13 1: 31 , , , . N o r r is W D S tee le J C Jo h n so n Ge t a l Se rum enh ancem en t o f 阐明许多疾病的病理机制提供了良好的手段, 特别是 20 h um an endo th e lia l ce lls a t tachm en t to and sp read ing o n co llagen s 在人医中对于动脉粥样硬化形成机理的研究打下了 I K [ . and do e s no t req ire se rum f ib ro nec t in o r v it ro nec t in J J 坚实的基础, 但在兽医中的应用未见报道。 若将体外 () , 1990, 95 2: 255Ce ll Sc ip t 培养的血管内皮细胞应用于兽医中许多病毒引起的 , . U nde rw oo d P A B enne t F AT h e effec t o f ex t race llu la r m a t r ix 21 出血性疾病的研究, 将会成为一种很好的实验材料。 [. m o lecu le s o n th e in v it ro beh av io r o f bo v ine edno th e lia l ce lls J ( ) , 1993, 205 2: 311.Exp Ce ll Re s 然而, 各种研究都离不开内皮细胞的分离和培养环 , , , . E guch i K M iga ta K N ak a sh im a M e t a lF ib ro b la st g row th 22 节。 如何在保持高纯度的前提下提高内皮细胞的产 沈士亮, 徐玉会, 武忠弼. 葡萄球菌 A 蛋白胶体金银法对血管内 24 fac to r s re lea sed by w o und endo th e lia l ce lls st im u la te ( ) [ ., 1992, 19 12 :皮细胞第 因子相关抗原的研究 [ . 中华病理学杂志, 1989, 18 ?p ro life ra t io n o f syno v ia l ce ll J J Rheuma to l J ( ) 1952 1: 69, 70 23 25 D aw so n R A , M acne i S. M ito gen ic ro le fo r ex t race llu la r 王毅, 朱佩芳, 王正国. 内皮细胞培养中清除成纤维细胞的新方法 2( ) ca lm o du lin lik e ac t iv ity in no rm a l h um an um b ilica l ve in [. 细胞生物学杂志, 1991, 13 1: 47J ( ) endo th e lia l ce lls [J . Br J Haema to l, 1992, 82 1: 151 Iso la t ion an d Culture of Va scular En do the l ia l Ce ll M u Y an g, Zh an g Y anm in g (2T h e Co llege o f A n im a l Sc ience and V e te r ina ry M ed ic ine N o r thw e stSc iT ech ), , 712100U n ive r sity o f A g r icu ltu re and fo re st ryYang lingSh anx i () 2: . A bstrac tV a scu la r E ndo th e lia l C e ll V EC lo ca te s be tw een th e c ircu la t ing b loo d and th e t issue unde r V ECIt is a po lyfunc t io na l . , , ce llT h e p ap e r sta ted th e m e tho d s o f iso la t ingcu ltu r ing and iden t ify ing o f V EC and d iscu ssed th e fac to r s w h ich affec ted . .iso la t io n and cu ltu reIt w a s show n th a t th e re w a s a g rea t advan tage o f iso la t ing and cu ltu r ing V EC : ; ; Keywordsva scu la r endo th e lia l ce lliso la t io ncu ltu re ()收稿日期: 2000206226 环境因素对大、小鼠及其动物实验的影响 1 2 刘宗传, 杨俊杰 () 11 湖南省寄生虫病防治研究所, 湖南岳阳 414000; 21 湖南省岳阳市云溪区畜牧局 () 文章编号: 1008- 9381 200005- 0036- 03 中图分类号: 865. 1 文献标识码: SA 实验动物生活在一定的环境中, 不同的环境条件22 ?条件相比, 发现两者均下降, 同时数及初生重与 雌性增多; 高温下影响更明显, 小鼠在 28 ?以上对动物本身及实验结果将产生不同程度的影响。本文 ICR 3时平均产仔数、离乳率减少 就环境因素对大、小鼠的生长发育与繁殖, 及其有关 ; 32 ?时, W ista r 大鼠 动物实验结果所产生的影响作了一简要概述, 以期能 初 产 率、产 仔 数、离 乳 率 均 下 降, 第 2 胎 不 孕; 34 ? 2 时, 4, 8 周内80% 、?20% 发生死亡; 35 ?、5, 6 Q引起相关动物工作者的关注。 1 温度的影响即对幼鼠生殖系统的发育和功能产生显著的影响,h 生 育 力 严 重 下 降, 而 且 对 雄 鼠 的 影 响 远 较 雌 鼠 敏 1. 1 温度对摄食、心跳、体温的影响 大、小鼠属于恒 6 温动物, 在一定的环境温度范围 感。 内可保持体温相对稳定的生理调节能力, 但当环境温 1. 3 温度对动物实验结果的影响 大、小鼠的心、肝、 (度超出该范围的临界温度 大鼠为210 ?与 32 ?, 小 肾等脏器重量与环境温度呈显 1 2 ) 鼠为 10 ?与 37 ?时, 则会表现为体温的上升或 著负相关。 将 ƒ小鼠从 22 ?环境移至 12BA L B cA ?或 32 ?饲养, 及 、细胞比率出现明显变下降。低温下摄食量增加, 高温下摄食量减少, 其摄食 W BC TB 2 7量与温度之间存在明显负相关。小鼠的心跳与呼吸 动 ; 9, 10 周龄 JCL 2ICR 小鼠臵于 10 ?, 30 ?下 随温度变化而出现变化, 在 15 ?, 25 ?之间急速增 观察其生理反应, 随着环境温度的升高小鼠的脉搏、 8 加, 恢复到 25 ?则回到原来的状态, 进而升高到 35 呼吸、发热量直线下降。 3 ?时, 又明显减少。大、小鼠药物急性毒理试验中, 环境温度不同, 21 () . 在 15. 5 ?时为 111. 0, 在 27. 0 ?时1. 2 温度对繁殖与育成的影响L D 50 m gk g 4 各种动物, 甚至同种动物不同品质间, 其最适温 则为 33. 2, 毒性增加 3 倍多; 戊巴比妥钠对W ista r4 21 度都有差别。 大、小鼠一般以 18 ?, 29 ?比较适 ( ) 大鼠的毒性 95 . 腹腔注射, 死亡率在 12 ?m gk g5 宜。等报告, 低温环境下小鼠阴道开口及性 B a rn e t t , 16 ?时为 100% , 32 ?时为 80% , 28 ?时则只有 周期的出现均较迟, 21 ?下能繁殖 3 代, 23 ?下则只 8 30% 。 可见环境温度不同, 常使动物实验出现不同 能繁殖 2 代; 等将 5?条件下繁殖大鼠的产仔M o r iya 的结果。