产胞外β-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选及其酶学性质的初步研究

产胞外β-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选及其酶学性质的初步研究 产胞外β-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选及其酶 学性质的初步研究 产胞外13一葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选及其酶学性质的初步研究 万振堂,杨丽杰 (东北农业大学,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨,150030) 摘要用荧光底物法从20种可利用纤维二糖的乳酸菌中筛选出10株产胞外B一葡萄糖苷酶 的乳酸菌,在MRS 培养基中筛选出粗酶液酶活较高的1株植物乳杆菌KLDS1.0320,进一步研究了其产酶的特 点,酶学性质,结果 明,植物乳杆菌KLDS1.0320产生的胞外B一葡萄糖苷酶受底物纤维二糖的诱导,但与底 物浓度有关.粗酶液 酶活的最适pH为4.8,最适温度为37?.在pH值为4.0,温度为48”C条件下仍具有酶活力. 关键词乳酸菌,B一葡萄糖苷酶,纤维二糖 B一葡萄糖苷酶(3-glucosidase)广泛存在于从微 生物到脊椎动物的各种生物中,它能够分解多种B. 葡萄糖苷,如水杨苷(salicin),纤维二糖(cellobio. se),纤维三糖(cellotriose),纤维四糖(cellotetrose) 和对硝基苯.B.D.葡萄糖苷(pNPG)等.在食品风味 物质的释放和纤维素降解中具有重要作用…. 资料表明,一些乳酸菌可以利用纤维二糖(或纤 维三糖)作为碳源,表明某些乳酸菌可能含有分解纤 维二糖的B一葡萄糖苷酶.另外乳酸菌可以将葡萄 糖进一步发酵成乳酸,实现糖化的同时进行发酵 (SSF).既解除了葡萄糖对B一葡萄糖苷酶的抑制作 用又可以将纤维素经纤维素酶降解产生的葡萄糖和 纤维二糖转化成乳酸.乳酸菌与纤维素酶的联合作 用在开发农作物植物纤维转化成一种稳定且可再生 的原料(例如乳酸,生物乙醇)工艺中有着很大的潜 力.在食品研究中,乳酸菌B.葡萄糖苷酶近来被 应用到大豆异黄酮植物雌激素的降解中,并取得较好 的效果.然而国内外B.葡萄糖苷酶的研究大多 集中于真菌.对于乳酸菌来源的B.葡萄糖苷酶研究 报道较少.国外曾经有报道研究植物乳杆菌,干酪乳 杆菌,德氏乳杆菌均可以产生具有相当酶活力的B. 葡萄糖苷酶,其中有的为胞外酶,有的为胞内酶,说法 不一.本研究从2O种乳酸菌中筛选到10株具有 胞外酶活性的乳酸菌,并进一步筛选出产酶量较高的 一 株乳酸菌,初步研究了其产酶性质和酶学活性. 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室菌种 库提供的20种乳酸菌,菌种来源为酸奶和青贮. 1.2培养基 培养基:MRS培养基组成:蛋白胨10.0g,牛肉 膏10.0g,酵母抽提物5.0g,葡萄糖20.0g,三水醋 酸钠晶体5.0g,吐温一80ImL,檬酸三铵2.0g, K2HPO42.0g,MgSO4?7H2O0.2g,MnSO4?2H2O 0.05g,蒸馏水1000mL.固体培养基加入琼脂15.0 g,121cI=高压蒸汽灭菌15min.将上述培养基中碳源 用10.0g纤维二糖替代即为纤维二糖MRS培养基 (以下称为CMRS). 1.3主要试剂 化学试剂:PNPG(对硝基苯一B.D.葡萄糖苷), MUGlc(4-甲基伞形酮.8.D.吡喃葡萄糖苷),纤维二 糖(cellobiose)均为Sigma公司产品,Bradford试剂盒 为北京百泰克公司产品,其余均为国产分析纯试剂. 1.4仪器 仪器设备:GL一21M冷冻离心机(上海市离心机 械研究所),Leica倒置荧光显微镜(德国Leica公 司),jY92—2D超声波破碎仪(宁波新芝生物科技股 份有限公司),680型全自动酶标仪(美国BIO— RAD),DU800紫外/可见光分光光度计(美国Beck— man公司),Delta320pH计. 2试验方法 1材料与仪器2.1乳酸菌生长曲线的绘制 1.1试验菌株对试验乳酸菌进行常规的MRS培养基生长曲线 第一作者:在读硕士研究生(杨丽杰为通讯作者) 国家自然科学基金(No.30771578) 收稿日期:2008—10—30,改回日期:2009—03—09 28I2—009Vo1.35No—.4(Total256 的绘制,以此确定各株乳酸菌的生长阶段. 2.2产胞外13-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选 采用MUGlc荧光底物法.用牙签挑取各株乳酸 菌涂印到另外的MRS平板上,待菌落长出后在其周 围涂上100L的10mmol/L的4一甲基伞形酮一p—D一 吡喃葡萄糖苷(用乙酸一乙酸钠缓冲液溶解,pH= 5.5),37~C继续培养5h,在紫外灯(波长300am)下 检测菌落荧光的产生. 2.3对硝基苯酚(pNP)曲线的制作 取0,0.025,0.05,0.075,0.10,0.125,0.15 mmol/L不同浓度的pNP(用乙酸一乙酸钠缓冲液溶 解,pH5.0)1mL,加入2mLlmmol/L的Na2CO3,充 分混匀后,在紫外分光光度计上于400llm条件下比 色,记录吸光度值. 2.4粗酶液的制备 将产酶乳酸菌进行MRS培养基培养,当培养到 稳定期时(OD..值估计),5000Xg,4~C条件下离心, 收集上清液S1和菌体,将上清液用0.2m的微孔 滤膜过滤后置一20%保存.用乙酸一乙酸钠缓冲液 (pH5.5)重悬菌体,5000×g,4?条件下离心,重复1 次.置超声波破碎仪上进行破壁,破壁条件为:400 W,问歇时间30s,破壁时间5min.离心收集上清液 S2,进一步定位B一葡萄糖苷酶产生的细胞部位. 2.5粗酶液酶活力(enzymeactivity,EA)的测定 取200txL上清液s1和S2,加入800LPNPG (溶于乙酸一乙酸钠缓冲液,pH5.5),置37?水浴锅 中反应4h.后加人2mL1mol/L的Na:CO,终止反 应,用紫外分光光度计400am条件下比色.每小时 催化生成1I~mol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活 力单位(1U). 2.6粗酶液蛋白浓度的测定(Bradford法) 按Bradford试剂盒说明,用酶标仪绘制标准蛋白 (牛血清蛋白)定量标准曲线,用酶标板于570llm条 件下测定上述粗酶液的蛋白浓度. 2.7培养时间对乳酸菌-葡萄糖苷酶产量的影响 按2%接种量将乳酸菌接人100mLCMRS培养 基中三角烧瓶37?条件下静止培养,分别在2,6,12, 18,24,30h时,取5mL菌液离心,测定酶活. 2.8碳源对乳酸菌产酶量的影响 选择上述试验后酶活较大的乳酸菌,分别用质量 浓度为1%的纤维二糖,2%纤维二糖,5%纤维二糖, 1%葡萄糖,2%葡萄糖,5%葡萄糖作为发酵培养基碳 源,绘制乳酸菌的生长曲线.并在稳定期取菌液离心 制作粗酶液,进行酶活测定. 2.9pH值对乳酸菌B-葡萄糖苷酶粗酶液酶活的影 响 将B.葡萄糖苷酶粗酶液用3mo1/,L醋酸溶液和 1mol/LNaOH溶液调节pH值至4.0,4.3,4.5,4.8, 5.0,5.2,5.5,5.8,6.0,6.3.并配制相同pH值的4 mmol/L的PNPG.在37?恒温条件下进行酶活反 应.确定最佳酶活pH值. 2.10温度对乳酸菌13-葡萄糖苷酶粗酶液酶活的影 响 将B.葡萄糖苷酶粗酶液和底物PNPG分别于 2O,25,30,32,34,37,40,42,45,48,50?反应4h,测 定不同温度条件下粗酶液的酶活,并确定粗酶液酶活 的最适温度. 2.1l几种金属离子对乳酸茵13-葡萄糖苷酶酶活的 影响 配制0.05mol/L的金属离子溶液,分别为Na, Mg”, Mn?, Ca?,K,取500IxL与等体积的粗酶液 混合,调节pH至4.8,后进行酶活测定.以相同条件 下的粗酶液酶活作为对照(设为100%),其他的金属 离子酶活与粗酶液酶活的比值,作为抑制或者激活的 参考. 3结果与分析 3.1乳酸菌在MRS培养基中的生长曲线(略) 3.2MUGlc法筛选胞外B-葡萄糖苷酶乳酸菌结果 MUGIc法筛选胞外B-葡萄糖苷酶乳酸菌的结果 见表1. 表1MUGIc法筛选产胞外B-葡萄糖苷酶的乳酸菌结果 2生笙曼曼鲞釜塑望釜曼鱼塑2I29 注:”+”代表阳性,紫外灯300nm波长下能够发出荧光;”一”,代表阴性. MUGIc荧光底物法广泛应用于B一葡萄糖苷酶的 检测,用该方法筛选产胞外B一葡萄糖苷酶的细菌,简 便快捷灵敏?.结果显示,所选的植物乳杆菌(L plantarum)都能产生胞外B.葡萄糖苷酶,大部分的嗜 酸乳杆菌(L.acidophilus)亦能产生胞外B一葡萄糖苷 酶.干酪乳杆菌(L.casei)虽能利用纤维二糖,但没 有检测到胞外B一葡萄糖苷酶,这与结果一致.本实 验室保存的德氏乳杆菌德氏亚种(L.delbrueckii. subsp.delbrueckii)不能利用纤维二糖,这可能与菌种 的特异性有关. 3.3对硝基苯酚标准曲线及Bradford蛋白浓度测 定标准曲线 唇 舌 岛 0 PNP浓度/~tmol-L- 图1对硝基苯酚(PNP)标准曲线 蛋白质浓度?L ‘图2Bradford蛋白浓度测牛血清标准曲线 3.4乳酸菌B.葡萄糖苷酶粗酶液酶活的测定结果 根据标准曲线,乳酸菌B-葡萄糖苷酶粗酶液酶 活酶活(EA)计算公式如下: EA=(A..+0.002)X54.3478X稀释倍数/反应时间 比活力=EA/粗酶液蛋白浓度 30l2009Vo1.35No.4(Total256 I 表2MRS培养基条件下产胞外酶乳酸菌粗酶液酶活 注:ND表示未测出. 表2结果显示,植物乳杆菌KLDS1.0320在MRS 培养基条件下胞外酶粗酶液的酶活较高,嗜酸乳杆菌 KLDS1.0380和植物乳杆菌KLDS1.0624,从青贮中 筛选的玉米乳杆菌KLDS1.0401产胞外p-葡萄糖苷 酶的能力较弱…J.而酶活力测定试验表明产胞外B一 葡萄糖苷酶的乳酸菌,其胞内似乎没有B-葡萄糖苷 酶.由于本试验用的是未经纯化的B-葡萄糖苷酶粗 酶液,所以在酶活力或者比活力上较其他真菌来源的 B.葡萄糖苷酶的酶活低,但乳酸菌KLDS1.0320属于 食品级的微生物,可以直接作为酶源用于发酵,生产 食用的B.葡萄糖苷酶,无需纯化. 3.5培养时间对植物乳杆菌KLDS1.0320产酶的 影响 结果显示,植物乳杆菌KLDS1.0320在MRs培 养基或者CMRS培养基中生长到稳定期前期时粗酶 液的酶活(pH5.0,37~C条件下)最大,表明在稳定期 前期B.葡萄糖苷酶的产量最高,p一葡萄糖苷酶的合 成与乳酸菌生长同步,属于同步合成型水解酶.但随 着培养时间的延长,B.葡萄糖苷酶可能被体系中的蛋 白水解酶水解,导致酶活下降.同时在本试验中随着 培养基中乳酸菌的生长,培养基中pH的下降,也可 0 一目80 能会影响L.plantarumKLDS1.03203-葡萄糖苷酶的 基因的表达’”. ? 鲁 藿 02612l82430 培养时间,h 图3培养时间对植物乳杆菌KLDS1.0320产酶的影响 3.6两种碳源对乳酸菌KLDS1.0320产酶量的影 响 藿 O2468J0l2l4l6】820 时间,I1 .-.~t--MRSpH,,.11-MRSOD(600nm) +CMRSpHCMRSOD(600nm) 图4植物乳杆菌KLDS1.0320在2种不同 碳源培养基中的生长曲线 -?- l%GlU2%Glu3%Glul%Cel2%Cel3%Cel 不同浓度碳源 图5不l司碳源浓度对植物乳杆菌KLDS1.0320 B一葡萄糖苷酶酶活的影响 作为植物乳杆菌KLDS!.0320生长的2种碳源, 在MRS培养基条件下,B一葡萄糖苷酶粗酶液的酶活 (pH5.0,37?)为54.74U/L,而在CMRS(1%纤维二 糖为唯一碳源)培养基条件下,p.葡萄糖苷酶粗酶液 的酶活(pH5.0,37oC)为702.51U/L,表明纤维二糖 作为B.葡萄糖苷酶的水解底物,对乳酸菌B一葡萄糖 苷酶的表达具有诱导作用,这与Adsul等?的研究 结果一致.但CMRS培养基中纤维二糖浓度达到 2%,3%时,乳酸菌KLDS1.032013.葡萄糖苷酶粗酶液 的酶活却下降至32.10,32.85U/L,说明底物浓度会 影响到乳酸菌KLDS1.032013.葡萄糖苷酶的分泌.用 葡萄糖作为碳源时,也出现类似的结果,关于底物浓 度与乳酸菌KLDS1.032013-葡萄糖苷酶产量的效应关 系值得进一步研究. 3.7温度对KLDS1.032013一葡萄糖苷酶粗酶液酶活 的影响 一 ? 蜒 避 图6温度对L.plantarumKLDS1.0320 B一葡萄糖苷酶酶活的影响 从CMRS培养基中获得的L.plantarum KLDS1.0320的B.葡萄糖苷酶粗酶液在pH为5.O 时,测得的不同温度条件下L.plantarumKLDS 1.0320的酶活变化,结果显示在20,45?,该酶粗酶 液具有较稳定的酶活力,最大酶活出现在37cI=时,而 温度超过50?该酶基本失去活性了,这与L.planta— rlzmKLDS1.0320的生长温度一致.而这种温度 适中性的B.葡萄糖苷酶在青贮纤维素降解的体系中 被认为有良好的效果?. 3.8pH值对KLDSI.032013-葡萄糖苷酶粗酶液酶 活的影响 图7pH值对KLDS1.032013一葡萄糖 苷酶粗酶液酶活的影响 从CMRS培养基中获得的L.plantarum KLDS1.0320的B.葡萄糖苷酶粗酶液在37?,测得不 同pH下KLDS1.032013.葡萄糖苷酶粗酶液酶活,结 果显示该酶在pH4.5,5.2酶活较稳定,其中在 pH4.8时达到最大酶活917.85U/L,表明该酶属于 酸性8.葡萄糖苷酶,在酸性环境条件下有着潜在的 应用价值. 3.9几种金属离子对乳酸菌p-葡萄糖苷酶酶活的 影响 QQ生苤曼曼鲞笠璺塑(望蔓曼鱼塑!l31 姗伽l毫 ——『.———l . n,螺谧溢翼 伽l善籼?0 FOODANDFERMENTATIONINDUSTRIES 表3几种金属离子对乳酸菌?葡萄糖苷酶酶活的影响 金属离子 Na Mg Mn Ca K 相对酶活% 73.O3 92.12 0 88.41 81.63 值. 注:表中的百分数均为金属离子粗酶液酶活与对照组酶活的比 结果显示,Na,Mg”,Mn”,Ca”,K对 L.plantarumKLDS1.0320的B一葡萄糖苷酶粗酶液均 有不同程度的抑制作用,该浓度的Mn更是能够使 粗酶液发生蛋白沉淀,失去活性. 4结论 本试验从20种可利用纤维二糖的乳酸菌中,利 用荧光底物法筛选出产胞外B.葡萄糖苷酶的乳酸 菌,结果表明乳酸菌产的胞外B.葡萄糖苷酶对底物 MUGlc,PNPG,纤维二糖均表现出酶活性,对 L.plantarumKLDS1.0320产的B-葡萄糖苷酶粗酶液 的酶学性质进行了初步研究,结果显示该酶粗酶液酶 活的最适pH为4.8,最适温度为37?.在pH值为 4.0,温度为48?条件下仍具有酶活力,且该菌株产 酶量与底物浓度存在诱导或者抑制关系,但具体还不 清楚. 5前景 产胞外B-葡萄糖苷酶的乳酸菌可直接应用到农 作物纤维素降解或食品风味物质的释放中,具有较大 的应用潜力.而该酶的基因又可用于基因菌的 构建,提高产酶量,用途更为深远.该工作目前正在 进行中. 1 2 3 4 参考文献 SesteloABF,PozaM,VillaTC.13一Glucosidaseactivityina LactobaciUusplantarumwinestrain『J1.WorldJournalofMi. crobiology&Biotechnology,2004,20:633—637 凌代文,东秀珠.乳酸菌分类学鉴定及实验方法[M].北 京:中国轻工业出版社,1998 HassanKSreenath.AnaBMoldes.RichardGKoege1.Lactic acidproductionfromagricultureresidues[J].Biotechnology Letters,2001.23:179一l84 YeChen,RatnaR,Sharma—Shivappa.EnsilingAgricultural ResiduesforBioethanolProduction[J].AppliedBiochemis— tryandBiotechnology,2007,143(1):80—92 2009Vo1.35No.4fTotal256 5DanielOOtieno,JohnFAshton,NagendraPShah.Evalua- tionofenzymicpotentialforbiotransformationofisoflavone phytoestrogeninsoymilkbyBifidobacteriumanimalis,Lacto— bacillusacidophilusandLactobacilluscasei[J].FoodRe- searchInternational,2006,39:394,407 6DanielOOtieno,JohnFAshton,NagendraPShah.Roleof microbialstrainandstoragetemperaturesinthedegradationof isoflavonephytoestrogensinfermentedsoymilkwithselected B—glucosidaseproducingLactobacilluscaseistrains[J].Food ResearchInternational,2007,40:371,380 7OtienoDO,AshtonJF,ShahNP.Isoflavonephytoestrogen degradationinfermentedsoymilkwithselected8一glucosidase producingL.acidophilusstrainsduringstorageatdifferent temperatures[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology, 2007.115:79,88 8CoulonS,ChemardinP,GueguenY,eta1.Purificationand characterizationofanintracellular13-glueosidasefromLactoba— ciUuscaseiATCC393[J].AppliedBiochemistryandBiotech— nology,1998,74:105,l14 9王冬梅,李多川,孟军.嗜热子囊菌光孢变种B一葡萄糖苷 酶的分离纯化及特性研究[J].农业环境科学学报,2005, 24(5):1007,1012 10Kazuhiro1washita,TatsuyaNiagara,HitoshiKimura,eta1. ThebglAGeneofAspergilluskawachiiEncodesBothExtra- cellularandCellWall—BoundIS-Glucosidases[J].Applied andEnvironmentalMicrobiology,1999,65(12):5546— 5553 l1刘飞,杨丽杰,侯俊财.青贮饲料中优良乳酸菌的分离鉴 定[J].饲料工业,2005,26(24):22,25 12SpanoG,RinaldiA,UglianoM,eta1.AB—glucosidasegene isolatedfromwineLactobacillusplantarumisregulatedby abinticstresses[J].JournalofAppliedMicrobiology2005, 98:855—861 13MarisaSGain,LauraAguirre,GracielaSavoydeGiori,et a1.BiologicalactivityofBifidbacteriumlonguminresponseto environmentalpH[J].AppliedMicrobiologyBiotechnology, 2006,70:612,617 14MukundAdsul,JayantKhire,KulbhushanBastawde,eta1. ProductionofLacticAcidfromCellobioseandCellotrioseby LactobacillusdelbrueckiiMutantUc一3[J].Appliedand EnvironmentalMicrobiology,2007,73(15):5055,5057 15DarioColombano,FergusLMould,MahalingeshwaraK Bhat,eta1.Invitroevaluationoffibrolyticenzymesasaddi— fivesformaize(ZeamaysL.)silageI.Effectsofensiling temperature,enzymesourceandadditionlevel[J].Animal FeedScienceandTechnology,2004,1ll:111—128 (下转第37页) acids,andemendeddescriptionofthegenusAlicyclobacillus [J].InternationalJournalofSystematicandEvolutionary icrobiology,2003,53:1537,l544 9王德斌.快速制备抗原一佐剂乳化液新方法[J].细胞与分 子免疫学杂志,2001,17(6):596—598 10王延华,李官成,ZhouXiafu.抗体理论与技术[M].北京: 科学出版社.2005.203—224 11GuoFen,LiShiqian,ChuYanhui.High—levelexpression, PreparationandPurification Aliyclobacillusacidoterrestris polyclonalantibodypreparationandsub?cellularlocalization analysisofmouseRhox5protein[J].ProteinExpressionand Purification,2007,54(2):247,252 12KouGeng,ShiShu,WangHao.ProteinExpressionand Purification,2007,52(1):131,138 13XuLihui,ChiXiaoyun,LiFengyao.PreparationandIdenti— ficationofHumanSolublesPD—L1andItsAntibodies『J]. ChineseJournalofBiotechnology,2007,23(1):106—111 ofPolyclonalAntibodyAgainst fromAppleJuiceConcentrate WangFeng,LiJianKe,LiuHaixia,JiangKai (CollegeofFoodEngineeringandNutritionalScience,ShaanxiNormalUniversity,ShaanxiXihn710062,China) ABSTRACTInordertobuildtherapiddetectionmethodofA.acidoterrestrisfromtheAppleJuiceConcentrate (AJC)usingtheenzyme—linkedimmunoassayfollowing,thepolyclonalantibodyagainstA.acidoterrestriswaspre— paredinthispaperfirstly.Weusedthepropaguleandbrood—gemmaofthethermotolerantbacteriaasthei mmune antigen,whichwereseparatedfromtheAJC.Immunetestswereperformedo1’1eightlargeearwhiterab bitswithear veinintravenousandintramuscularinjectionwayrespectivelyandthepolyclonalantibodieswereobtained.Titersand specificitiesoftheantibodiesweredetectedbytubeagglutinationtest.Thepolyclonalantibodieswerepurifiedbysatu- ratedammoniumsulfateandDEAEionexchangechromat0graphy,andverifiedbySDS—PAGEelectro phoresis.The titersofpolyclonalantibodyobtainedwithearveinintravenousandintramuscularinjectionwaywere1:2560and 1:640,respectively.Theresultsshowedtheantibodyobtainedbyearveinintravenousinjectionhadhighertiterand shorterimmunizationperiodthanthatobtainedbyintramuscularinjection.Thespecificityandpurificationeffectofan- tibodywerewel1.TheimmunizationprocedureofrabbitwithA.acidoterrestrisfromtheAJCwasbuiltanditspolyclonal antibodywasobtainedforthefirsttime. Keywordsapplejuieeconcentrate,A.acidoterrestris,immunizationprocedure,polyclonalantibody (上接第32页) ScreeningLacticAcidBacteriatoProduceExtracellular 13一glucosidaseandthePreliminaryStudiesoftheEnzymeProperties WanZhentang,YangLijie (KeyLabofDairyScience,MinistryofEducation,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China) ABSTRACTFluorescentsubstratemethodwasusedtoscreen1acticacidbacteriatoproduceextracellularB.gluco. sidasefrom20strainswhichcanutilizecellobiose.Tenstrainswereselected.InMRSculture,highercrudeenzyme activitywasfoundintheLactobacillusplantarumKLDS1.0320.Furtherstudieswerecarriedouttoexaminethechar- acteristicsofitsproductionandproperties.TheproductionofextracellularB-glucosidasebytheKLDS1.0320wasin- ducedbycellobiose,anddependedontheconcentration.TheoptimumpHofcrudeenzymeactivityis4.8andthe optimumtemperatureis37?.TheenzymestillhadactivityinPHvalueof4.0andatthetemperatureof48c I=. KeywordsLacticacidbacterium,p—glucosidase,cellobiose 生蔓曼曼鲞篁璺塑!堕蔓曼鱼塑!I37