淋球菌mtrR启动子区域回文序列基因突变与多重耐药关系的研究

淋球菌mtrR启动子区域回文序列基因突变与多重耐药关系的研究 淋球菌mtrR启动子区域回文序列基因突变 与多重耐药关系的研究 ? 278? 【文章编号】1672-3619(2006)03-0278-03 JournalofTropicalMedicineVo1.6No.3Mar.2006 ? 论着? 淋球菌mtrR启动子区域回文序列基因突变与多重耐药关系的研究 彭运生,袁建辉,徐立中,潘春燕,钟素霞,汪小娟 (1.深圳市宝安人民医院,深圳518101;2.深圳市疾病预防控制中心,深圳518020) 【摘要】目的探讨淋球菌mtrR启动子区域回文序列基因突变与多重耐药之间的关系.方法采用纸片 扩散法检测56株淋球菌对五种抗生素的敏感性.以PCR扩增mtrR启动子区域中包含有13个碱基回文序列在 内的157个碱基.并进行SSCP(单链构象多态性).根据SSCP的结果,选取12株标本进行测序分析,将其核 苷酸序列与标准敏感株ATCC19424进行比较.结果56株细菌中有5株对五种抗生素都敏感,对一种抗生素 耐药的有22株.对两种抗生素耐药的有19株,其中有2株mtrR启动子区域中回文序列基因发生了突变;对三 种抗生素,四种抗生素和五种抗生素耐药的株菌分别是7株,2株和1株,它们的mtrR启动子区域中回文序列 基因均发生了突变.并且这12株标本突变的类型一致,在13个碱基的回文序列中发生了单个A/T碱基的缺 失.结论mtrR启动子区域中回文序列基因突变介导淋球菌的多重耐药,回文序列单个A/T碱基的缺失与淋 球菌多重耐药有密切的关系. 【关键词】淋球菌;多重耐药;点突变 中图分类号:R378.16文献标识码:A CorrelationbetweenMultipleResistanceofNeisseriagonorrhoeaeand MutationsintheInvertedSequenceWithinthemtrRPromoterRegiOn PENGYun-sheng,YUANJian—hui,XULi—zhong,PANChun—yan,ZHONGSu—xia,WANGXiao-jua (BaoanPeople’sHospitalofShenzhenCity,Guangdong,Shenzhen518101,China) 【Abstract】ObjectiveToevaluatethecorrelationbetweenmultipleresistanceofNeisseriagonorrhoeaeand mutationsintheinvertedsequencewithinthemtrRpromoterregion.MethodsThesusceptibilityof56cli nical isolatesofNelsseriagonorrhoeaeto5differentantibioticswasexaminedbydiscdiffusionmethod.A13bpinverted sequencepositionedwithinthemtrRpromoterregionwasamplifiedbyPCRandexaminedbySSCP(singlestrand confomlationpolymo~hism)technology.Accordingtotheres~mofSSCP,DNAfrom12bacterialstrainswerethen selectedandsequenced.ResultsAmongthe56strains,5weresusceptibletoallantibiotics.Twenty-twowere r~istanttoonlyoneantibiotic.Nineteenisolateswereresistanttotwoantibiotics.Amongthese19strains,twoof themhavemutationsinthe13bpinvertedsequencepositionedwithinthemtrRpromoterregion.Thenumberof bacterialstrainsshowingresistanceto3,4,andallofthe5typesofantibioticsWas7,2and1,respectively.AU0f theseresistantcellshadthesanledeletionmutationsinthe13bpinvertedsequencepositionedwithinthemtrR promoterregion.ConclusionDeletioninthe13bpinvertedsequencepositionedwithinthemtrRpromoterregion appearstoberesponsibleformultipleantibioticresistanceinNelsseriagonorrhoeae.DeletionofA/Tbpinthe13bp invertedsequencepositionedwithinthemtrRpromoterregionisassociatedwiththemultipleantibioticresistance. 【Keywords】N.gonorrhoeae;multipleresistance;pointmutation 近年来淋球菌多重耐药现象日益严重.并呈现出由低 水平向高水平耐药的趋势.以致临床上很多淋病病人需要 反复治疗.为探讨淋球菌多重耐药.本实验采用纸片 扩散法检测56株临床分离菌株对五种抗生素的敏感性, 以PCR技术扩增mtrR启动子区域中含13bp回文序列 基金项目:深圳市科技和信息局科技计划资助项目(No.2005150). 作者简介:彭运生(1967,),男,大学本科,副主任技师,主要从事 临床医学检验工作. 的片段,然后进行SSCP分析,发现差异后测序,将其核苷 酸序列与标准菌株序列进行比较.从分子水平探讨mtrR 启动子区域回文序列基因突变与淋球菌多重耐药的关系. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株来源56株临床分离菌来自深圳市宝安人民 医院检验科,淋球菌药敏质控菌株ATCC492264和野生型 淋球菌标准株ATCC19424为香港中文大学医学院微生物 热带医学杂志2006年3月第6卷第3期 系惠赠.所有菌株均经形态学榆查,氧化酶试验和糖发酵 试验鉴定证实,以脱脂牛奶一70’C保存 1.1.2主要试剂GC培养基和T—M培养基购自英国 OXOID公司:药敏纸片购门北京天坛药物生物技术开发公 司;基因扩增引物南大连宝生物公司合成;pfu高保真酶, dNTP购自上海生物技术服务公司:丙稀酰胺为BBI 进l_J分装;甲叉双阿稀酰胺购门萸国Aldrich公司. 1.1.3主要仪器荧光定量PCR分析仪为美产ABI一 7000型;凝胶成像分析系统为英国Syngene公司产品: DYY—IU28B垂直电泳槽为北京六一仪器厂产品 1.2方法 1.21细菌培养取可疑淋病患者泌尿生殖道分泌物后,赢 即接种于T—M培养基,37’C,5%CO:条件下培养24—48h 后,经形态学检查,氧化酶试验,糖发酵试验鉴定将纯菌 转种于Gc培养基J一2次传代后.洗入脱脂牛奶保存于一 7O?冰箱中待用. 1.2.2约敏试验采J}={j纸片扩散法.按NCCIS标准 (1999)进行具体操作如下:取培养24h的菌落数个,混 悬于肉汤增菌液巾,在530i~l[n波K比色.调整浊度.使其 OI)值为0.1(相当于1.5X10scfu/m1),取无菌棉试子卡占取 菌液从二个方向均匀涂布于顶温的GC琼脂平板上(GC琼 脂平板加1%生长补充剂作为药敏培养基).室温干燥5n 后,用无菌镊子将药敏纸片(红霉素,氧氟沙早,诺氟沙早, 观霉素,头孢美唑)贴丁琼脂而.37%培养24h.以淋 球菌ATCC49226作为药敏质控株观察结果 1.2.3模板DNA制备取培养24r一36h的淋球菌菌落 2O,3O个于3Ol双蒸水巾,煮沸10lIlill,2000r/min离 心8,10rain,取上清液做模板. 1.2.4PCR反应条什引物参照PAN等…的序列.由大 连韦牛物公司合成.上游引物:5GCITFGAFACCCGA ATG’ITCG3,F游弓I物5ccTTTcGGGTcGGITrTGAcG3. 总反也体系为5Ol,包括10xbuft~r,2mmol/L dNTPs,2~mol/I上游引物,2~umol/l下游引物,模板各 5l,25mmol/LMgcl23l,2U/pApfu高保真酶1l, 九菌蒸水21ILl30l蜡油覆盖扩增条件为94(?预 变件5tnln,94?变件60S,59%退火45s,72延伸6O S,32个循环后,72?延伸6rain.不加模板的扩增体系作 为阴性对照.野生型淋球菌标准株ATCC19424作为忡 对照.扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳紫外反射透射仪 下观察结果,SyngeneI*-I像分析系统扫描并照相. 1.2.5SSCP分析参照义献.制备8%t13变性聚阿烯酰 胺凝胶,于4冰箱聚合过夜,用1xTBE缓冲液冲洗上样 孔取8t.ulPCR扩增产物,加入等量的2×变性缓冲液,煮 沸10rain后冰浴2min,加样于预电泳10min的8%非变件 聚丙烯酰胺凝胶,300400V电泳5h,结束电泳,银染观察 试验结果.以标准菌株ATCC19424作为正常对照观察带型 1.2.6[u1文序列核苷酸序列测定及分析根据SSCP的 带型选取12株II床分离株以及标『伟侏ATCC19424的 PCR片段大连宝生物公司做测序分析. ? 279? 2结果 2.1药敏试验结果 从临床分离的56株淋球菌中,有5株敏感菌,时一种 抗生素耐药的有22株.对两种抗生素耐药的有l9株,对 ==种抗生索,四种抗牛素和五种抗牛素耐药的株菌分别是 7株,2株和1株. 2.2PCR检测 56株细菌和ATCC9424均能扩增出mtrR,PCR产物 经1.5%琼脂糖凝胶电泳后均呈现一条清晰的特异性带, 处于100—200bp间.与预期结果相符(图1). 51)0 400 300 200 l00 图1mtrR基因250bp片段凝胶电泳图 Fig.1Electrophoreticpatternsof157bpproductsfrom mtrRgene Lane1:Arcc19424:I&1he2-4:Clinicisolates157bpproducts Lane5:DNAmarker;Lane6:Negativecontrol 2.3SSCP检测 5株敏感菌带型与标准株ATCC19424相,对两种抗 生素耐药的有19株,其中有2株带型与标准菌株不同;埘 三种抗生素耐药有7株,四种抗,卜素耐药有2株和时五种 抗生素耐药的有1株,其带型均也与标准菌株不同,且这 12株的带型一致(图2) 123456789bp ——40n 00一100 图2mtrRt片段SSCP分析图 Fig.2mtrRpromotergenePCR-SSCPpatternsof157bp products Lane1:157IIpdsDNAcontrol;l,ane2:ATCC19424;Lane3: Clinic[1OIS.mutationisolatespatter’n:Lane4—8:Clinicintlla[hill isolatespattern;I,ane9:DNAmarker 2.4测序验证 标准菌株以及经过SSCP检测无突变的菌株的mtrR 瑚 一一 _耄 黼 “ ? 280? 回文序列碱基序列与genebank登录的序列相一致.而经 SSCP检测分析有突变的菌株均发生了碱基突变,突变为 mtrR启动子区域13bp回文序列5AAAAAGTcrITITrr35 端一个T/A碱基的缺失(图3) 图3mtrR基因157片段部分测序图 (其中箭头所指为突变碱基,a:标准株.b:耐药株) Fig.3Partlynucleotidessequencingof157bpprosucts,the lettersinthefigindicatethecorrespondingsequencing— illustratiion(a:Standardstain;b:Resistantstain) 3讨论 淋球菌产生耐药的原斟除由质粒介导产生的一内酰胺 酶外,主要足由染色体控制通过膜蛋白机制及膜通透性改 变产生耐药性ril.1973年MANESS等提m存在淋球菌染 色体上的mtr系统,该系统的位点突变可引起淋球菌对疏 水性抗生素非特异性的低水平耐药,同时可提高对某些染 料去污剂的抵抗.mtr系统是能量依赖的细胞膜外排泵, 由mtrR调控基因,mtrCDE结构基组成的一个操纵子调 控,新近研究发现在mtrCDE的下游有一个被命名为mtrF 的新基因,参与淋球菌高水平耐药….mtr系统对淋球菌多 重耐药的调节机制在转录水平上分为两种:一种是 mtrR依赖调节,此类研究在国内外均有报道.另一种是 非nitrR依赖调节,在mtrR调控基因和结构基之间有一 段250bp的片段,其中包含了mtrR肩动区13bp捅人重 复序列,该序列一对碱基的缺失,将引起mtrR阻遏蛋白合 成减少或作用减弱.mtr操纵子的转录加强,使得mttCDE 基因的表达增加.淋球菌细胞膜外排泵蛋白作用增强,从 而提高对抗生素的耐受性[5,9=12].但后者抑制引起淋球菌 对抗生素的耐受水平明显高于前者rJ,国内尚未见此类报 道本实验采用PCR—SSCP银染技术来筛盎突变的基, 然后进行DNA序列分析.对淋球菌mtrR启动了域巾回 文序列基因突变进行研究.SSCP分析足依据不同构象单链 DNA或RNA在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳行为的差 异来签定DNA序列改变的一项技术,口『检测出基因单个碱 基置换和微缺失与插人突变.为SSCP分析的敏感性取决 于I)NA片段的长短,通常100,300bp的单链DNA检出 率可达97%,300450bp的单链DNA检}}I率为67%.随 着长度的增加检测敏感性降低.此本实验扩增包含回史 序列在内的157bp进行SSCP筛查突变基因,根据SSCP结 果,选取带型与野牛株带型不一致的菌株进行测序分析.结 果显示,PCR—SSCPjDNA测序分析符合率达到100%. JournalofTroloicalMedicineVo1.6No.3Mar.2006 本实验中的56株细菌,对两种以上抗生索耐药的细 菌均可以检测到mtrR肩动子区域中回文序列基因的突 变.存mtrR与mtrC基因问肩动子区域13bp同文序列5 AAAAAGTC3T1TF3.该序列5端一个T/A的缺失,突变 的类型与国外文献报道一致[$,9-12].所以在一定程度上认 为mtrR启动子区域中回文序列基因的突变和淋球菌多重 耐药性具有密切的相关性.这种回文序列缺失引起淋球菌 mtr系统改变,具体机制搜意义不是很明确,目前有两种说 法I….一是回文序列作为MtrR蛋白的识别位点,单个碱基 的缺失导致蛋白一DNA的结合力降低.二是一个碱基的缺 失.缩短了肩动子35,10之间的空间距离,转录的保真性 受到影响.确切的机制有待证实,但13bp嘲文序列在mtr 系统调控中起着十分重要的作用. [参考文献] [1]PANW.SPRATTBG,Regulationofthepermeabilityof thegonococalcellenvelopebythemtrsystem【J].Mol Mierobiol,1994,11(4):769=775. [2]邹明祥,夏忠弟,唐银,等.聚合酶链反应一单链构象多态 性检测淋球菌gyrA基因突变的研究[J].中华检验医学杂 志.2003,26(3):175—176. 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