蛋白质的性质实验

蛋白质的性质实验 【目的和要求】1. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。2. 了解蛋白质的两性解离性质。初步学会测定蛋白质等电点的方法。3. 加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。【实验原理】(一) 蛋白质及氨基酸的呈色反应蛋白… 【目的和要求】 1. 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。 2. 了解蛋白质的两性解离性质。初步学会测定蛋白质等电点的方法。 3. 加深对蛋白质胶体分子稳定因素的认识，了解蛋白质的沉淀反应、变性作用的原理及其相互关系。 【实验原理】 (一) 蛋白质及氨基酸的呈色反应 蛋白质所含有的某些氨基酸具有特殊结构，可以与某些试剂反应，生成有色物质。 1. 双缩脲反应 尿素被加热至 180?左右时，两分子尿素缩合放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性 2+条件下可与Cu结合生成复杂的紫红色化合物。此反应称为双缩脲反应。 所有含有两个或两个以上肽键的化合物均有此反应。 蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应，可用此法鉴定蛋白质的存在或测定其含量。 2. 茚三酮反应 蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无α-氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外，其他氨基酸生成紫红色，最终为蓝色化合物。 除蛋白质、多肽和各种氨基酸能进行茚三酮反应外，氨、β-丙氨酸和许多一级胺化合物都有此反应。该反应灵敏度达1:1500 000(pH5-7)。现已广泛地用于氨基酸定量测定。 3. 黄色反应 凡是含有苯基的化合物都可与浓硝酸反应产生黄色化合物。芳香族氨基酸及含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质分子具有此反应。苯丙氨酸很难反应，需加少量浓硫酸才有黄色反应。 (二) 蛋白质的两性反应及等电点的测定 蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，of work enthusiasm and forward-looking. The difficulties and problems of individual cadres indifferent masses as the buck passing, long, make some simple complex problems. Some cadres general talk about pay, do not take the initiative to undertake for the bitter and tired of the work, the lack of courage to play a positive attitude." corrective measures: (LED Leadership: Luo Mingjun, rectification time: before September 25th, insist for a long time) 1, effectively solve the enterprise less, help is not enough. In order to "turn style, solve problems, and do practical things, heart to heart" as the core, in accordance with the provisions of division of Labor Bureau, by the Bureau of Party members and cadres room composition the working group , to help enterprises solve problems, promote the construction of major projects; close ties with the masses, to ask for the people, ask for people to know the people, public opinion, the people, improve people's livelihood. 也不向阳极移动，这时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点(pI)。当溶液的pH值低于蛋白 + 质等电点时，即在 H较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子，当溶液的pH值大 —于等电点时，即在OH较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。 本实验采用蛋白质在不同 pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，在等电点时蛋白质溶解度最小，最容易沉淀析出。 食品检验—氨基酸总量测定 蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的pro成分，如水解后的产物经胨，肽等最后成为氨基酸，氨基酸是构成pro最基本的物质。 水解后的pro和水解前的pro在物理特性，化学结构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以评价食品的营养价值。 氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸(仪器价格昂贵，不能普遍使用)，对于食品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量，它们不能以氨基酸百分率来示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸态氮)的百分率表示，当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。 食品在评价蛋白质的营养价值时，除了测定pro的含量，氨基酸氮含量，还需要对各种氨基酸进行分离，鉴定，尤其对8种人体必需氨基酸进行定量定性分析。 一(单指示剂甲醛滴定法: 1原理:氨基酸具有酸，碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基，而-COOH基显示酸性，又含有-NH，-NH则显示碱性，由于-COOH基和-NH2的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐，22 当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式以三种形式存在。 用碱完全中和-COOH基时的PH值为8.4~9.2。 2试剂: (1)40%中性甲醛溶液:以百里酚酞作指示剂，将甲醛用1N NaOH溶液中和(淡兰色)。(2)0.1%百里酚酞乙醇溶液。 (3)0.100N NaOH标准溶液。 3操作步骤: 称约含20mg左右的氨基酸?于烧杯中(如为固体样加水50ml)?加两滴指示剂?用0.1N of work enthusiasm and forward-looking. The difficulties and problems of individual cadres indifferent masses as the buck passing, long, make some simple complex problems. Some cadres general talk about pay, do not take the initiative to undertake for the bitter and tired of the work, the lack of courage to play a positive attitude." corrective measures: (LED Leadership: Luo Mingjun, rectification time: before September 25th, insist for a long time) 1, effectively solve the enterprise less, help is not enough. In order to "turn style, solve problems, and do practical things, heart to heart" as the core, in accordance with the provisions of division of Labor Bureau, by the Bureau of Party members and cadres room composition the working group , to help enterprises solve problems, promote the construction of major projects; close ties with the masses, to ask for the people, ask for people to know the people, public opinion, the people, improve people's livelihood. NaOH溶液滴定到淡兰色?加中性甲醛20ml?摇匀?静置1分钟?此时兰色应消失?再用0.1N NaOH溶液滴定淡兰色，两次滴定所消耗的碱液毫升数。 计算:氨基酸态氮=(N×V×0.014×100)/W×100 二(双指示剂甲醛滴定法 1原理: 与单色法相同，只是在此法中使用了两种指示剂，从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与 亚硝酸氮气容量法(此法操作复杂，但准确，不作介绍)相近，单色滴定法稍偏低，主要 因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计 算看，双色滴定法比单色滴定法准确。 2试剂:同单指示剂一样，多一个0.1%中性红(50%乙醇溶液) 3操作步骤: 取相同两份样品?分别于100ml三角瓶?一份加中性红2滴?用0.1N NaOH滴定终点(由红 变琥珀色)，记录用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml?摇匀?用0.1N NaOH 滴至淡兰色。 计算: 氨基酸态氮=(N×(V2-V1)×0.014×100)/W×100 V1——用中性红为指示剂时，碱液所消耗的体积 V2——用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液消耗量 0.014——氮的毫克当量浓度 注意事项: (1)单色指示剂甲醛滴定法，用碱完全中和—COOH基时的pH为8.5—9.5 (2)测定样品的颜色较深，应加活性炭脱色之后再滴定 三(茚三酮比色法: 1原理:氨基酸在一定pH范围内，能与茚三酮生成兰紫色化合物。可以用比色法定量测定。 2试剂: (1)磷酸缓冲液(pH.8.04)制备方法如下: 称磷酸二氢钾4.5350g。定容500ml 称NAHPO?12HO 11.9380g分别溶解定容500ml 242 取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液 (2)2%茚三酮溶液: 称茚三酮1g?溶于35ml热水?加入40mg氯化亚锡(SnCl?HO)搅拌过滤(作防腐剂)? 22 于冷暗处过夜?定容50ml ? 氨基酸标液 称干燥氨基酸(如异亮氨酸)0.2000g?溶解定容100ml?摇匀?吸10ml于另外100ml容量瓶 定容100ml，即得200Ug/ml标液 3操作方法: (1)绘制标准曲线: 取7个25ml容量瓶，吸取标液 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于7个25ml容量瓶，加水补充 至容积为4ml，然后加茚三酮和缓冲液各1ml，于水浴加热15分钟，冷却后定容25ml，静置 15分钟，在570nm下测消光值，绘制标准曲线。 (2)样品测定: of work enthusiasm and forward-looking. The difficulties and problems of individual cadres indifferent masses as the buck passing, long, make some simple complex problems. Some cadres general talk about pay, do not take the initiative to undertake for the bitter and tired of the work, the lack of courage to play a positive attitude." corrective measures: (LED Leadership: Luo Mingjun, rectification time: before September 25th, insist for a long time) 1, effectively solve the enterprise less, help is not enough. In order to "turn style, solve problems, and do practical things, heart to heart" as the core, in accordance with the provisions of division of Labor Bureau, by the Bureau of Party members and cadres room composition the working group , to help enterprises solve problems, promote the construction of major projects; close ties with the masses, to ask for the people, ask for people to know the people, public opinion, the people, improve people's livelihood. 取样品5.00~10.0g(液体样5-10ml)?于烧杯中?加50ml水和活性碳约5g?加热过滤?用 30—40ml热水洗涤活性炭?吸澄清样液1~4ml?加茚三酮和缓冲液各1ml水浴加热15分钟， 冷却定容，静置15分钟于570nm下测定消光值，按下式计算氨基酸含量。 氨基酸含量(毫克/100克)=C/(W×1000)×100 C——从标准曲线上查得得氨基酸的量(Ug) W——测定得样品溶液相当于样品的量(g) 注意事项: 茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯 化，方法如下:、 取10g茚三酮容于40ml热水中，加一克活性炭，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中 过滤，即出现兰色结晶，过滤，用2ml冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。 思考: 1 试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中物颜色发生什么变化,为什么, 2 样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠,这时溶液发生什么变化,为什么,如果没有变化，说明什么问题,须采用什么措施, 3 硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用, 4 试述氨基酸态氮的测定原理。? 5 结果计算中为什么要乘上蛋白质系数, 实验:?水果中酸度的测定。 ?糕点中和脂肪的测定。 of work enthusiasm and forward-looking. The difficulties and problems of individual cadres indifferent masses as the buck passing, long, make some simple complex problems. Some cadres general talk about pay, do not take the initiative to undertake for the bitter and tired of the work, the lack of courage to play a positive attitude." corrective measures: (LED Leadership: Luo Mingjun, rectification time: before September 25th, insist for a long time) 1, effectively solve the enterprise less, help is not enough. In order to "turn style, solve problems, and do practical things, heart to heart" as the core, in accordance with the provisions of division of Labor Bureau, by the Bureau of Party members and cadres room composition the working group , to help enterprises solve problems, promote the construction of major projects; close ties with the masses, to ask for the people, ask for people to know the people, public opinion, the people, improve people's livelihood.