胰岛素基因增强结合蛋白诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化的研究

胰岛素基因增强结合蛋白诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化的研究 胰岛素基因增强结合蛋白诱导神经干细胞向胆碱能神 经元分化的研究 目录 分类号 R329.1 Q786 密级:内部 胰岛素基因增强结合蛋白诱导神经干细胞向胆碱能神经 元分化的研究 Study on neural stem cell differentiated into cholinergic neuron induced by insulin gene enhancer binding protein 刘 佳 梅 指导教师姓名: 陈 东职 称: 教 授 单 位: 吉林大学基础医学院 专 业 名 称: 病理学与病理生理学 论文答辩日期: 授予学位日期: 答辩委员会主席: 论 文 评 阅 人: 2004 年 4 月吉林大学博士学位论文II 目录 未经本论文作者的书面授权,依法收存和保管本 论文书面版本、电子版本的任何单位和个人,均不得 对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修 改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使 用(但纯学术性使用不在此限)。否则,应承担侵权的 法律责任。 吉林大学博士学位论文III 目录提 要 老年性痴呆与脊髓损伤SCI的患者主要都是由于运动神经元的变 性与丧失而导致神经退行性改变或者运动功能的丧失,神经干细胞的出 现为运动神经元的再生带来希望,使胆碱能运动神经元的获得成为可能。 本实验将分子生物学技术与形态学手段相结合,利用转基因技术在国内、 国外首次将在运动神经元发育中起关键作用的胰岛素基因增强结合蛋白 Isl-1基因通过携带增强型绿色荧光蛋白EGFP的逆转录病毒载体导入 大鼠的 NSC,在体内、体外观察转导 Isl-1基因的 NSC向胆碱能神经元 分化的情况。结果发现 Isl-1基因促进 NSC向胆碱能运动神经元的分化。 转导 Isl-1基因的 NSC立体定位移植入大鼠脑纹状体内,NSC可以存活 并在脑内迁移,且可分化成乙酰胆碱酯酶阳性细胞。同时发现 NGF可刺 激 NSC向胆碱能神经元分化,这为 NSC向胆碱能神经元分化提供新的 可能途径。 吉林大学博士学位论文IV 目录 目 录 前 言. 1 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望3 1.1 神经干细胞的定义及其特性3 1.2 神经干细胞分化的影响因素6 1.3 神经干细胞向胆碱能神经元的分化 15 1.4 神经干细胞分化的基因调控 18 1.5 神经干细胞的应用前景21 第二章 神经干细胞的分离、培养与鉴定 25 2.1 实验25 2.2 实验方法26 2.3 实验结果28 2.4 讨论. 30 2.5 小结. 32 第二章插图. 33 第三章 NGF对神经干细胞分化的影响35 3.1 实验材料35 3.2 实验方法35 3.3 实验结果36 3.4 讨论. 38 3.5 小结. 40 吉林大学博士学位论文V 目录 第三章插图. 41 第四章 体外培养骨骼肌细胞对神经干细胞分化的影响 42 4.1 实验材料42 4.2 实验方法42 4.3 实验结果43 4.4 讨论. 44 4.5 小结. 46 第四章插图. 47 第五章 胰岛素基因增强结合蛋白对 NSC的影响49 5.1 实验材料49 5.2 实验方法50 5.3 结果. 60 5.4 讨论. 71 5.5 小结. 74 第五章插图. 75 结 论78 本论文创新点 79 参考文献80 英文缩写词表 94 附件 中文摘要 附件 英文摘要吉林大学博士学位论文VI 前言 前 言 20世纪 90年代初期,Reyholds等先后在成鼠和胎鼠脑组织中分离出 能够不断分裂增殖、具有多分化潜能的细胞群落,提出神经干细胞neural stem cell, NSC的概念,因此彻底改变了以往认为中枢神经系统神经元不 能再生的认识。随着对神经干细胞研究的深入,人们已能利用无血清培养、 单克隆技术及免疫荧光化学技术对 NSC进行分离、培养和纯化。由于 NSC 能向神经元、神经胶质细胞、少突胶质细胞分化,并且在不同微环境有不 同的分化潜能,深入研究脑发育过程中的神经干细胞的增殖分化机制,可 以有目的地诱导成年脑内神经干细胞的增殖分化或通过体外 NSC培养后 再植入的方法代替退化和死亡的神经细胞,从而可为治疗神经退行性疾病 和中枢神经系统损伤提供条件。因此,如何诱导 NSC的定向分化及其分 化机制成为目前研究的热点与难点。 老年性痴呆与脊髓损伤的患者主要都是由于运动神经元的变性与丧 失而导致神经退行性改变或者运动功能的丧失,如果能向患者患病的相应 部位补充运动神经元,则患者就有治愈的希望。NSC的概念提出后,使 胆碱能运动神经元的获得成为可能。如果我们找到能诱导 NSC向胆碱能 神经元定向分化的因子或微环境,使 NSC向胆碱能神经元定向分化,将 定向分化的 NSC移植入所需的部位,形成新的突触联系,就有可能恢复 原有的信息传递,从而达到治疗的目的。 本实验的目的意在寻找诱导 NSC向胆碱能神经元分化的途径,在实 验中我们将分子生物学技术与形态学手段相结合,利用转基因技术将在运 动神经元发育中起关键作用的胰岛素增强结合蛋白Isl-1基因通过携带增 强型绿色荧光蛋白EGFP的逆转录病毒载体转导大鼠的 NSC,在体内、 吉林大学博士学位论文 1 前言 体外观察转入 Isl-1基因的 NSC是否能向运动神经元分化。同时利用体外 不同微环境,观察了与骨骼肌细胞共培养及不同浓度的 NGF诱导 NSC向 运动神经元分化情况。如果实验得到预期结果,将为神经干细胞向胆碱能 神经元分化提供新的可能途径。这将为胆碱能运动神经元缺失或损伤的患 者带来福音。 吉林大学博士学位论文 2 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 长期以来人们一直认为,成年哺乳类动物中枢神经系统神经元的分化 在出生后即停止,且神经元缺乏再生能力,一旦受到损伤,则只能由胶质 细胞所填充。随着神经生物学的飞速发展,不断有研究表明,不但在成年 哺乳动物而且在成年人脑中同样存在着具有多种分化潜能的 NSC,这一 研究成果不仅改变了成年动物的神经细胞不能分裂的传统观念,而且在研 究脑的发育及临床应用上具有重大价值。本文对神经干细胞的研究现状及 可能的应用前景作一综述。 1.1 神经干细胞的定义及其特性 1.1.1 神经干细胞的定义 [1] 1992年, Reynolds等 从成年鼠脑纹状体中首次分离出能在体外持续 增殖且具有向神经元及星形胶质细胞分化潜能的细胞群,表明在成年鼠脑 [2] 内存在着具有干细胞特性的细胞群;其后,脊髓、小脑 、隔区和纹状体 [3] 实质内也先后分离出了多潜能性质的干细胞。1998年,Eriksson等 证实 成年人脑同样存在神经干细胞,使人们对神经系统再生的机制和神经系统 [4] 疾病的治疗均有了新的认识。根据 Mckay 1997年在 Science杂志上发表 的文章定义神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质 细胞的能力,能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞群。 1.1.2 神经干细胞的特性 [5] Gage 2000年在 Science上发表文章指出,神经干细胞通常具有以下 特性:?来源于神经系统能产生神经组织;?有自我更新的能力:所谓自 我更新,指在分裂增殖过程中子代细胞仍然维持干细胞样特性,包括增殖 能力、多向分化潜能和表达神经上皮细胞蛋白;?具有对称分裂和不对称 吉林大学博士学位论文 3 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 分裂两种方式,在对称分裂时可以产生两个相同的子代干细胞,而在不对 称分裂的情况下由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配,使得一个子 细胞不可逆地走向分化的终端而成为功能专一的分化细胞,另一个子细胞 则保持亲代的特征,仍作为干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干 细胞的数目和分裂次数控制。总之,自我更新和多分化潜能是干细胞的两 个基本属性。 1.1.3 神经干细胞的鉴定 [6] Lendahl 等 通过实验证明中枢神经系统内多潜能干细胞或前体细胞 胞浆内表达一种被称为巢蛋白或巢素Nestin的特异性蛋白,现已证实其 属于中间丝intermediate filament蛋白家族, Nestin编码了一个中等纤 维骨 [6] 架蛋白,系 NSC的标志,已广泛应用于神经干细胞的鉴定 。Nestin只在 多潜能的神经上皮细胞表达,随着神经上皮细胞的分化成熟逐渐消失,其 功能现在尚未完全明确,可能与其它家族成员相似,同时具有结构和信息 传递的功能;通过检测巢蛋白的表达即可确定多潜能干细胞的存在。目前 认为 Nestin可能参与了神经干细胞向神经前体细胞的分化以及有丝分裂 后神经元间神经联系的建立。另外发现,在某些肿瘤细胞和反应性胶质细 胞中也可出现 Nestin的表达。 [7] 也有学者以 Musashi对 RNA结合蛋白进行鉴定 , Musashi广泛存在 于多种属动物中,故利用小白鼠的 Musashi抗体亦可对低等脊椎动物如 鸟类作神经干细胞或神经前体细胞的鉴定。由于在以 Neurosphere方法培 养的神经干细胞中,Nestin和 Musashi呈双阳性反应,而在分化了的神经 元中两者均消失,所以 Nestin和 Musashi一直作为鉴定神经干细胞或神经 前体细胞的标志物而广泛使用。但严格地讲,无论 Musashi还是 nestin都 只是对神经干细胞具有高选择性、而并非特异性。 1.1.4 神经干细胞的来源及分布 吉林大学博士学位论文 4 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 [8] 有关神经元和神经胶质细胞的起源,长期以来一直存在着争议 ,目 前被大多数神经生物学家接受的是“一元论”的发生机制,即神经元和胶 [9] 质细胞来源于共同的干细胞。早在 20世纪 60年代,Altman 用同位素标 记的胸腺嘧啶掺入脑中,发现在新皮层、海马、嗅球的细胞有同位素掺入, 证明这些区域有能分裂的细胞存在。但作为干细胞必须具备以下特征:? 能在动物的整个生命过程中持续分裂或保持分裂能力;?能通过分裂产生 相同的干细胞来维持自身的存在,同时也能产生子细胞并进一步分化成各 [10,11] 种成熟的细胞 。 现已证明,在哺乳类胚胎期 NSC集中在嗅球、侧脑室的脑室区、室 [12] 下区、海马、脊髓、后脑和脑皮层 ,已证实在成人脑中有 3个脑区具有 神经干细胞:即室管膜下层subventricular zone,SVZ和海马的齿状回、 嗅回。SVZ紧邻大脑的侧脑室壁,这是一个重要的神经发生区,它的神经 发生能力可保持终生。海马是与学习和记忆有关的重要脑区。哺乳动物的 大部分脑区,其细胞的发生和迁移只在各个胚胎发育期中进行。而在大鼠 的海马齿状回,超过 85%的神经元是在出生后产生的。在出生两周内,齿 状回颗粒细胞层的细胞来源于门区hilus,并沿着放射胶质细胞的纤维到 达颗粒细胞层,其新生神经元产生后不再迁移。而室管膜下层细胞则由胚 胎脑室腔表面的胚胎神经上皮细胞在胚胎发育过程中逐渐深入脑组织形 成室下带,并在成年脑室管膜进一步发育成熟。这种由胚胎早期室管膜上 皮细胞产生的干细胞具有多向分化的潜能,因此被称为多潜能神经干细胞 multipotential neural stem cell。成年哺乳类的 SVZ迁移细胞是沿着平 行 于 SVZ表面的切线方向以链式迁移方式到达嗅球。与胚胎时期神经细胞 的迁移不同,成体 SVZ细胞的迁移不需要放射状胶质细胞的引导,而相 互紧密联接形成一条首端迁移带rostral migration stream RMS,它在某种 [13] 神经粘合因子的作用下迁移到嗅球 ,此时部分细胞可能产生凋亡。 吉林大学博士学位论文 5 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 1.2 神经干细胞分化的影响因素 随着对干细胞研究的深入,人们已能利用无血清培养、单克隆技术及 免疫荧光化学技术对干细胞进行分离、培养和纯化。深入研究脑发育过程 中神经干细胞的增殖分化机制,研究神经干细胞在成年脑内增殖、分化的 影响因素,可以有目的地诱导成年脑内神经干细胞的增殖分化或通过体外 干细胞培养后再植入的方法代替退化和死亡的神经细胞,从而可为治疗神 经退行性疾病和中枢神经系统损伤提供条件。在多细胞有机体内,每一个 细胞的活动均受到极其复杂的内、外环境信号之间相互作用的调控,其中 细胞因子可能是涉及此过程中的主要信号分子。中枢神经系统中的各种因 子对发育期细胞的存活、增殖、迁移和分化,成年时期功能的维持,损伤 时细胞的可塑性改变,都有着非常重要的影响。现今对 NSC分化研究侧 重于两个方面:一是细胞因子的作用;再者是内环境信号的作用。 1.2.1 细胞因子的作用 细胞因子对干细胞生长和分化起着关键作用,目前可利用生长因子从 脑组织中分离干细胞,使干细胞在离体状态下进一步增殖分化,从而为研 究干细胞的生物学特性和干细胞移植提供大量的细胞来源。其中研究最多 的是成纤维细胞生长因子FGF和表皮细胞生长因子EGF。 1.2.1.1 FGF家族 现知 FGF家族至少有 15个成员,最早发现的是 aFGF,FGF-1和 bFGFFGF-2。两者均由单一多肽链组成,有 55%氨基酸序列相同。对 FGF 受体的研究,发现有 4个跨膜的高亲和受体,分别称 FGFRl、R2、R3和 R4。在中枢神经系统CNS,其中 aFGF和 bFGF发挥主要作用。神经元 和星形胶质细胞均能表达 aFGF、bFGF及其受体。FGF家族在胚胎期和 成年期的 CNS和周围神经系统PNS发育中都有表达,神经元表达的 FGF 受体主要是 FGFR1,胶质细胞表达的主要是 FGFR2。体外培养的星形胶 吉林大学博士学位论文 6 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 质细胞能合成 bFGF,并证明它定位在细胞核。 bFGF的主要受体是 FGFR1, bFGF除了通过 FGFR1传递有丝分裂信 [14] 号,还可以通过其它受体起作用 。bFGF是神经干细胞永生化的条件之 [15] [16,17] 一 ,是啮齿类动物分布在脑纹状体及脊髓等处 的神经干细胞的有丝 分裂原。同时,它在神经干细胞的增殖、分化方面也起着重要的调节作用 [18] 。给幼鼠皮下注射 bFGF,则能刺激包括海马和小脑的颗粒层在内的神 经生发区域神经干细胞增殖;若注入的是 bFGF的中和抗体,则神经生发 区域神经干细胞的增殖速度明显降低;若将 bFGF注入成年鼠的侧脑室内, 则可引起其室下区干细胞数量及神经元数量的增加以及从室下区迁移到 [19] 嗅球的神经元数量增加 。bFGF还可以和其它因子一起共同调节神经干 细胞的增殖与分化,如在胰岛素样生长因子insulin like growth factor, IGF 和血小板源性生长因子PDGF存在下,bFGF对少突胶质细胞 2型星形细 胞oligodendrocyte-type-2 astrocyte,O-2A的先祖细胞具有促增殖作用。 bFGF减少时,神经干细胞即可分化成神经元、胶质细胞和少突胶质细胞 [20] 。这些结果提示 bFGF能诱导神经干细胞的增殖。bFGF除了可以促进 神经干细胞的增殖外,还决定其分化方向。神经干细胞的增殖与分化同 [21] bFGF浓度有着直接的关系,Kilpatrick等 发现高浓度的 bFGF可以刺激 干细胞分化为神经元,但在血清存在时,高浓度 bFGF刺激的克隆产生较 少的神经元,而在无血清培养中 E10鼠前脑永生干细胞在 bFGF刺激下分 化成较多的神经元。此结果说明血清抑制神经元产生,而 bFGF的浓度决 定克隆的细胞类型组成。若再加入其他因子如胶质细胞成熟因子glia maturation factor,GMF、内皮素endothelin,ET等,皮质神经干细胞可分化 成星形胶质细胞。bFGF浓度决定它与不同受体的亲和力,从而引起信号 传导的通路不同,最终决定了它的不同分化途径。 1.2.1.2 EGF家族 吉林大学博士学位论文 7 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 EGF家族至少有 5个成员EGF,TGF α,AR-SGDF,HB-EGF,HRG α/NDF,而且它们都有共同的受体。神经元和星形胶质细胞表达的 EGF 主要是 TGFα。 EGF是促进有丝分裂的因子,能刺激人胶质细胞系 787CG 的繁殖,亦能刺激原代培养的成星形胶质细胞的增殖和分化。同时,EGF [22] 反应性细胞还可以由 FGF促发产生 。在脑的各个时期内神经元和星形 胶质细胞均可表达 EGF。EGF受体EGFR是酪氨酸激酶受体,由 ErbB基 因编码。与 FGFR表达相比,EGFR的表达较晚,分布不如 FGFR广泛。 敲除编码 EGFR的基因,鼠皮质神经发生区消失。这就提示 EGF在发育 [23] 较晚期起作用 ,而且在神经干细胞的增殖和分化中起作用。在体内实验 中,连续 6d注射 EGF于 Bromo deoxyuridine5-嗅尿嘧啶,Brdu标记的前 脑区细胞后发现标记细胞数量增加了 18倍,且分离到神经干细胞克隆的 [24] 数目增加了 3.7倍 。将 EGFR注射至成鼠齿状回,发现 EGF使 Brdu标 [25] 记的颗粒细胞前体神经元的数量增加一倍 。侧脑室长期在 EGF刺激下 虽不明显诱导齿状回或嗅球颗粒神经元产生,但却诱导室管膜下区星形胶 [19] 质细胞的产生 。以上报导说明 EGF能促进神经干细胞的增殖及其分化。 也有人推测,EGF的主要作用是维持神经干细胞的生存,而 bFGF对神经 [26] 干细胞的分化起重要作用 。关于 EGF和 FGF对神经干细胞增殖分化的 作用,有待进一步的研究。 1.2.1.3 胰岛素样生长因子 胰岛素样生长因子IGF家族由 IGF-l、IGF-2和胰岛素组成,大多数 组织和细胞都能合成 IGF-1及其受体,但在脑中只发现有截短型 IGF-1受 体和 IGF-2 mRNA。IGF-1在调节干细胞活性以及控制纹状体神经干细胞 增殖方面是一个关键性因子。有文献报道,将单个干细胞放置于 96孔板 内,在缺乏 IGF-1时,没有观察到神经球的出现,而 IGF-1无论与 EGF 还是 bFGF同时存在时,都有神经球产生,其数量呈 IGF-1剂量依赖性增 吉林大学博士学位论文 8 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 [27] 长 。另有研究表明, IGF-1在胚胎增殖以及新神经元存活中起重要作用, [28] 且在海马相关疾病中有治疗价值 。在体外培养,星形胶质细胞的存活需 要有高水平的 IGF-1或胰岛素。 1.2.1.4 β转化生长因子 体内外的星形胶质细胞均能表达三种β转化生长因子transforming growth factor type β,TGF β,即 TGF β l、TGFβ2、TGFβ3。TGFβl 能抑 制成星形胶质细胞的繁殖,对 O-2A先祖细胞的繁殖有较弱的刺激作用, 但与 bFGF联合应用时其作用是双相的,即低浓度时 TGF β l加强 bFGF 的促细胞分裂作用,高浓度时却抑制 bFGF的作用。 1.2.1.5 骨形态发生蛋白 骨形态发生蛋白bone morphogenetic protein,BMP在神经系统发育中 有多种作用,并对神经营养因子的作用产生影响。在皮质神经前体细胞中, 尽管 BMP2、4、5、6、7高水平表达,但 BMP4表达较晚。用 BMP2或 BMP7作用于神经前体细胞后,增强了神经前体细胞向星形胶质细胞的分 [29] 化并抑制其向少突胶质细胞分化,并且 BMP不依赖于 EGF受体的激活 。 [30] Lillien等 发现 BMP4可以在胚胎早期抑制 EGFR的表达,使早期皮质 细胞表达低水平的 EGFR,而晚期神经前体细胞则表达高水平的 EGFR。 在培养的神经细胞中,BMP9直接诱导编码乙酰胆碱转移酶和乙酰胆碱转 运囊基因的表达及上调乙酰胆碱的合成。脑室内注射 BMP9增加活体的乙 [31] 酰胆碱水平,说明 BMP9是胆碱能中枢神经系统的分化因子 。另有研 究表明 BMP通过 SmadI可联合 STAT3LIF受体以转录联合因子 P300为 [32] 桥梁,诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞 。 1.2.1.6 白血病抑制因子与血小板源性生长因子 [33] Carpenter 报道了白细胞抑制因子leukemiain hibitory factor,LIF对 人神经干细胞增殖的重要性,他们发现在培养液中加入 EGF、 bFGF和 LIF, 吉林大学博士学位论文 9 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 在培养 50天以内干细胞增殖的速度和不加 LIF没有差别,但 50天以后不 加 LIF的培养液中干细胞的增殖明显缓慢下来,而加 LIF的培养液中干细 胞的增殖速度每 7至 10天就增加一倍。 血小板源性生长因子PDGF是由两条多肽链组成,可分 PDGF-AA、 AB和 BB三种。体外培养的星形胶质细胞能表达和分泌 PDGF-AA,但在 体内,星形胶质细胞只略微表达 PDGF-AAmRNA。在体外培养,PDGF 能诱导成星形胶质细胞的增殖,伸出较短的突起和增加血小板结合蛋白的 合成,并对成星形胶质细胞具趋化性作用。PDGF亦能刺激 O-2A先祖细 胞繁殖和延缓其分化,但其作用较 FGF短暂,若联合应用 FGF和 PDGF, 则此作用大为加强。PDGF作用可能与提高向神经元方向分化的祖细胞的 [34] 生存率有关 。 [35] Galli等 对 LIF和 PDGF的研究表明在人胚间脑神经干细胞分化调 节中,PDGF可减少干细胞分化为成熟神经元的数量,而 LIF和睫状神 经营养因子则可促进干细胞的分化。在两种因子的协同作用下,神经干 细胞分化为成熟神经元的数量可增加 2倍,而且在活化素 A存在时, LIF 诱导神经干细胞分化速度加快。 1.2.1.7 脑源性神经营养因子 [36] Kirschenbaum 和 Goldman 报道脑源性神经营养因子brain derived neurotrophic factor,BDNF能促进成鼠前脑室下带神经元的存活。他们发 现 在培养液中加入 BDNF,培养 22天后新产生的神经元超过 35%能存活, 培养 42天后超过 25%能存活,如果培养液中不加 BDNF,则不久后所有 的神经元均不能存活。如果将培养的单个神经球置于 BDNF下,大量神 经元前体细胞就会从形态上和抗原特性上表现出已分化神经元的特性,特 别是 BDNF具有明显促进神经元突起生长的作用。 BDNF可对所有来源于 EGF反应性神经干细胞来的神经元前体细胞起作用,促使它们分化、成熟, 吉林大学博士学位论文 10 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 并可能维持其短期存活。维持更长时间的存活则需要另外的因子。 Bicario-Abejon 等发现 BDNF 可使 E16 海马 bFGF 受体干细胞分化为 GABA能神经元的比例达 70%。BDNF的效应可能与核转录因子 Brn 4相 [37] 关 。 1.2.1.8 睫状神经营养因子 睫状神经营养因子CNTF可以使 E16海马分离的 bFGF受体细胞最 终分化为星形胶质细胞比例从 6%上升到 98%;而对于新生大鼠小脑分离 的 EGF受体细胞,其主要效应则是使少突胶质细胞分化比例从 0上升到 [38] 20% 。 1.2.1.9 神经营养因子 3神经营养因子 3 Neurotrophin 3,NT3可刺激鸟 类神经管前体细胞分 [39] 化为运动神经元,但对分化的离体运动神经元存活总数无明显影响 。 [37] 而 NT 3使分化为谷氨酸能神经元的比例高达 96% 。 除上述细胞因子对神经干细胞的增殖分化发生影响外,其它的因子如 胶质细胞源神经营养因子GDNF、白细胞介素 1IL-1、神经细胞粘连分 [40,41] 子 等起着协同作用。 1.2.2 其它因素对 NSC分化的影响 1.2.2.1 甲状腺激素和维甲酸 甲状腺激素T3和维甲酸RA通过细胞内核受体家族发挥作用。T3 受体在胚鼠的海马区、小脑区和皮质脑室区域表达。配体受体混合物对靶 基因区域的 DNA 成分具有高亲和力并直接调节这些基因的表达。 [42] Nicholson等 发现 T3表达水平增加可诱导小脑区域前体神经元的分化, [43] 胚鼠在缺乏 T3情况下嗅球神经元产生的数量下降 33%。Takahashi等 对 RA影响海马源性神经干细胞克隆的分化结果表明 RA能够引起 NeuroD 和 P21表达水平的迅速上调,使之分化为未成熟神经元的数量增加 3倍, 吉林大学博士学位论文 11 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 同时促使 trkA、trkB、trkC和 p75NGFR表达增加,促使神经前体细胞分 [44] 化成熟。RA作用主要通过上调 trk受体 。 1.2.2.2 神经递质类 1 GABA GABA可以抑制皮质前体细胞增殖而促进细胞分化,其作用的发挥依 赖于 GABA受体。在体外实验中已证实了脑室区域和皮质区域有 GABA [45] 受体的存在,并影响细胞的增殖分化。Ma等 发现在室下区存在 GABA 合成酶,而在脑室区域未检出,因而推测有丝分裂后的分化神经元可能产 生 GABA能信号以减慢未成熟神经元的增殖速度。 2 阿片肽 [46] 体内实验证明阿片肽能够抑制 CNS细胞增殖。Zagon等 发现发育 鼠注射阿片肽受体拮抗剂 2h内增殖细胞的数量增加 15%~30%,且齿状 回和脑室区域神经元数量明显增加。 3 血管活性肠肽和垂体腺苷酸环化酶活性肽 血管活性肠肽VIP和垂体腺苷酸环化酶活性肽PACAP是肽类神经 递质,通过 G蛋白偶联受体家族发挥作用。体内外实验证明, VIP和 PACAP 具有促进细胞增殖作用,在神经嵴源性的颈神经节前体细胞,PACAP受 体可促进其增殖。在神经前体细胞培养液中,65%的皮质前体细胞具有 PACAP免疫活性和细胞内 PACAP反应性。在体内试验,缓慢注射 VIP 拮抗剂至 E9~E11鼠体内,可以看到 E17鼠皮质的脑室区域体积缩小。 E10鼠在 VIP拮抗剂治疗 12h后,Brdu标记的原始区域的细胞数量下降, 但在 E12或 E18鼠,这种现象不发生,证明 VIP受体的阻断作用可能在 [47] 早期的细胞增殖中发生 。 1.2.3 神经细胞粘附分子 神经细胞粘附分子NCAM是一种细胞外基质蛋白,可调节细胞间的 吉林大学博士学位论文 12 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 相互作用神经元迁移、轴突延伸和基因表达的发育过程。NCAM 在神经 干细胞从室下区迁移至嗅球路径上大量表达,表明其参与神经干细胞的增 [43] 殖分化过程。Amoureux等 发现在 bFGF存在时,NCAM通过其配体抑 制海马前体细胞增殖,促进其分化为神经元表型,使微管相关蛋白MAP 阳性细胞数量增加 2倍,减少细胞凋亡数量,促进其存活。 以上反映了神经干细胞对外源性因子反应的多样性,这也使得从离体 试验结论推出某种因子在神经前体细胞包括干细胞和祖细胞成熟过程 中的作用非常困难。因此,每个外源性因子的作用必须特异性地放在一个 系统进行验证。由于体内是一个错综复杂的细胞因子网络,所以在干细胞 分化研究的初期阶段,这种离体、单个因子逐一试验的方法是必须经历的 一个过程。在已知某种细胞因子及其细胞内信号通路时,该筛选方法将有 利于揭示诱导 NSC定向分化的分子机制,有利于实现今后通过基因调控 手段完成对 NSC的定向诱导。目前对介导神经干细胞分化方向的分子机 [48] 制知之甚少,这方面的报道也相对较少。Sakurada 等研究发现从成年脑 组织的海马区分离的 NSC 向中脑 DA 能神经元方向分化时,有核因子 Nurr1参与此过程。Nurr1激活后与位于酪氨酸羟化酶TH基因启动子区 的反应元件相结合,是使干细胞向 DA能神经元定向分化的机制之一。 LIF 和 CNTF等因子通过 LIF受体在发育期及成熟神经系统内发挥各种作用。 [49] Turnley 提出这些因子调节的是细胞内信号转导的下游,通过 JAK/STAT 而非 MAPK途径决定着神经前体细胞对上述因子的反应性,即向神经元 方向分化还是向胶质细胞方向的分化。 1.2.4 内环境信号对 NSC分化方向的影响 有关内环境信号的作用,主要通过将 NSC与其他组织细胞共培养, 或将由 NSC扩增得到的异质性细胞群体组成的细胞球植入脑内后进行跟 [50] 踪观察研究 。结果证明,植入的细胞不仅可以在发育期脑和周围神经系 吉林大学博士学位论文 13 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 统中广泛迁移,而且向神经元和胶质细胞分化,甚至人胚胎来源的干细胞 在植入成年大鼠脑内也可以分化成为神经元和胶质细胞;同时发现移植细 胞分化方向似乎由其所处的局部环境而非内在的特性决定。 [51] Catapano 等将永生化细胞株 HiB5源自 E16海马前体细胞植入到 成年大鼠的皮层、胼胝体和纹状体的多个位点,利用形态学和免疫细胞化 学方法观察 HiB5分化,结果提示:三个部位仅纹状体支持供体细胞向神 经元方向的分化,且靠近中线的室周纹状体区比偏外侧的纹状体区更支持 [52] 向神经元和胶质细胞的分化。Rosario 等将培养的干细胞植入基因突变 致小脑前叶发育缺如的小鼠模型,发现这些细胞逐渐分化成颗粒细胞并形 成小脑的内颗粒层;电子显微镜观察结果显示供体细胞分化而来的颗粒细 胞与宿主苔藓纤维建立了突触联系。在移植到成年动物正常情况下不产生 神经元的部位,干细胞则不能生成神经元,而是向胶质细胞分化。在受损 [53] 伤的发育期脑内,干细胞则向损伤部位移行并替代缺失的细胞。Gage 等将细胞球注入成年脑组织某个脑区后观察,结果提示随注入的神经前体 细胞迁移部位的不同而有不同分化方向。一般迁移到嗅球和齿状回可以新 生神经元的脑区,NSC可以分化成那个部位特异性的神经元;在这些脑 区之外或注射损伤的局部,注入的神经干细胞均分化成胶质细胞。 [54] Nishino 等将来源于 E12中脑的 NSC,移植到成年大鼠偏侧帕金森病模 + 型的双侧纹状体区,结果证实病损侧较健侧脑组织内 NSC更易分化为 TH 神经元,即 DA已被耗竭的纹状体区提供了更适于中脑干细胞分化为成熟 [55] DA能神经元的内环境。Bjornson 等报道,从胚胎或成年小鼠脑内取得 的细胞经标记后移植到放射损伤的宿主鼠体内,竟然分化为骨髓细胞、淋 [56] 巴细胞以及其他原始的造血细胞。 Galli 等将从人胚胎和成年小鼠快速分 离的 NSC与成肌细胞共培养,结果 NSC可分化为骨骼肌细胞。由此推测, 神经干细胞的分化潜能不只局限于神经系统,植入的细胞在分裂增殖的同 吉林大学博士学位论文 14 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 时,可能“辨别”其所处的环境,但是什么因素始动分化并决定其分化方 向还有待于进一步探索,其中必然交杂着内外因素的复杂作用,供体细胞 本身所具有的内在分化程序、局部环境中的各类细胞因子、细胞外基质、 [57] 黏附分子、炎症介质及细胞间的相互作用均可能参与其中。Clarke 等将 成年小鼠脑组织取出的 NSC与鸡胚胎体一起培养,结果 NSC可以分化为 各胚层类型细胞,形成了嵌合体。NSC跨胚层分化的成功,提示神经干 细胞具有更广阔的应用前景。 1.3 神经干细胞向胆碱能神经元的分化 胆碱能神经元是分布比较广泛、功能比较活跃的神经元。它所分泌的 乙酰胆碱是非常重要的神经递质。胆碱能神经元广泛支配着大脑皮质及海 马等有关结构,在学习记忆行为中有重要的调节作用,而在脊髓中胆碱能 神经元主要执行运动功能,因此胆碱能神经元的变性与丧失会导致神经退 行性疾病如老年性痴呆以及运动功能的丧失。由于原代培养的神经元寿命 很短暂,且很难得到人自身脊髓组织来进行科学研究,因此对老年性痴呆 及胆碱能运动神经元性疾病的药物开发及治疗很受限。如果能向患者 患病的相应部位补充胆碱能神经元,则患者就有治愈的希望。NSC 的出 现为运动神经元的再生带来希望,使胆碱能运动神经元的获得成为可能。 胆碱能运动神经元能通过分子生物学技术和免疫组织化学方法检测 其表达的蛋白标志来定义。它既表达神经元的标志,如 MAP2,同时表达 胆碱能细胞的标志:乙酰胆碱酯酶和 VAChT。一些同源框转录因子成员 也在胆碱能运动神经元内发现。在脊髓运动神经元分化发育过程中的最早 标志是 Isl-1,另外一个蛋白是位于神经元膜上,沿运动神经元轴突运输的 REG2。通过免疫细胞化学分析和 RT-PCR检测这些标志蛋白来作为检测 胆碱能运动神经元的指标。 吉林大学博士学位论文 15 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 学者们试图将神经干细胞诱导分化为运动神经元,并已取得一些成 果。将脊髓来源的神经前体细胞在体外诱导分化,可发现乙酰胆碱酯酶阳 [58, 性的细胞,证明脊髓来源的神经干细胞可分化为胆碱能运动神经元 59,60] 。为了观察胆碱能神经元的分化及分化的胆碱能运动神经元与其靶器 官骨骼肌是否形成神经肌连接是很有必要的,有学者将获得的脊髓来源的 神经干细胞在体外与骨骼肌共培养,通过电镜观察,发现分化的神经干细 胞与骨骼肌形成了神经肌连接。证明分化的神经干细胞是有功能的。将此 类细胞移植入坐骨神经横断的动物模型,发现移植的细胞至少可存活 12 [61] 周,并可以迁移至远端的肌组织内 。另有学者将神经干细胞移植入脑内 不同区域,发现神经干细胞根据其周围微环境的诱导而分裂,分化成相应 的细胞类型,其形态和功能与附近的宿主细胞非常类似。文献报导,小鼠 [62] 胚胎干细胞在体外向运动神经元的分化已取得突破性进展 。而关于这些 细胞生理学特性还正在研究中。虽然证明神经干细胞可以向胆碱能运动神 经元分化,但学者们还没有找到诱导神经干细胞向胆碱能神经元分化的直 接或关键因素,而关于胆碱能神经元分化的机制尚需探讨。现已发现的影 响胆碱能神经元分化的因素如下: 1.3.1 神经生长因子 神经生长因子NGF是最早被纯化并确定了分子结构的典型细胞因 子,到目前为止,已了解到 NGF是神经系统中最重要的生物活性物质之 一,对神经系统的正常发育及促进再生等方面均有重要的生物学作用。早 期应用组织细胞培养手段证实了 NGF对交感、感觉及中枢胆碱能神经元 [63] 具有营养作用,能维持其存活并诱导其突起生长 。 在神经细胞完成最后的分化,神经元和神经胶质细胞被确切识别的过 程中,特异性的 NGF及 NGF受体于这一阶段开始表达并逐渐到达高峰, 表明 NGF在出生前后神经系统发育及神经元成熟与分化过程中起重要作 吉林大学博士学位论文 16 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 用。 NGF 促进新生动物中枢胆碱能神经元发育成熟,也得到体内外实验 [64,65,66] 的支持 。实验显示能稳定表达 NGF的神经干细胞克隆-HiB5 NGF, 对胆碱能神经元有营养作用,可诱导基底核神经细胞的轴突并行伸向分泌 NGF 的区域。老年鼠是天然的神经元退变模型,胆碱能系统的萎缩与它 们完成认知任务的能力减退相平行。在这些老年鼠移植 HiB5 NGF细胞 后,这些动物的学习和记忆能力显著改善,与年轻动物相当,基底神经核 和中间隔区的胆碱能神经元萎缩数目减少,NGF 的表达可至少持续到移 植后 10周。这些结果表明把分泌 NGF的神经干细胞移植到脑内可治疗老 年性胆碱能系统功能衰退。 另有文献报导,NGF 能提高体外培养的胆碱能神经元的存活率,长 期 NGF治疗可引起海马胆碱能系统功能增强,即高度特异性的胆碱摄入 和乙酰胆碱Ach的合成、贮存及释放都增加。可见,NGF在胆碱能神经 元的发育、存活及再生过程中均起到积极作用。 1.3.2 骨形态发生蛋白 有研究表明,在培养的神经细胞中,BMP9直接诱导编码乙酰胆碱转 移酶和乙酰胆碱转运囊基因的表达及上调乙酰胆碱的合成。脑室内注射 BMP9增加活体的乙酰胆碱水平,说明 BMP9是胆碱能中枢神经系统的分 [31] 化因子 。 1.3.3 声猬蛋白 声猬蛋白 ShhSonic hedgehog已经被证明在神经前体细胞的增殖、表 [67,68,69] 型决定以及细胞存活等方面发挥作用 ,Shh及其配体 Ptc-1在成年 鼠前脑内有表达,尤其是 Ptc-1在胆碱能神经元中有表达。在鼠前脑前体 细胞的培养中,Shh单独或与 NGF协同作用可使乙酰胆碱酯酶ChAT阳 性细胞的数量明显增加,且 Shh与 NGF显示了协同效应:ChAT阳性细 吉林大学博士学位论文 17 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 胞数在 Shh与 NGF协同作用组比单独应用 Shh或 NGF组增加的更明显。 说明 Shh在有丝分裂期后胆碱能神经元的发育中扮演着重要角色。并提示 [70] Shh在神经退行性疾病中具有潜在的治疗价值 。 1.3.4 胰岛素基因增强结合蛋白 胰岛素基因增强结合蛋白Insulin gene enhancer binding protein 1 Isl-1 [112] 是由 Karlsson 等于 1990年发现的同源框 LIM转录因子家族的成员,其 [112] 基因编码的蛋白结合于胰岛素基因增强区。Isl-1 是由 Karlsson 等于 1990年发现的同源框 LIM转录因子家族的成员,其基因编码的蛋白结合 于胰岛素基因增强区。新近的研究表明,Isl-1基因是发育中的运动神经元 最早的分子标记物,在鸡胚脊髓的运动神经元有丝分裂后至神经元特性分 化完成前均有表达。在 Isl-1基因缺失的鼠中,运动神经元无法发育成熟, 而在体外培养的鸡神经管细胞中用反义核苷酸将 Isl-1的表达阻断,结果 未见运动神经元发育成熟,说明 Isl-1在运动神经元发育中起关键性作用 [71] 。有文献报导在纹状体神经细胞分化过程中,主要通过抑制 Isl-1在非 [72] 胆碱能细胞中的表达,而逐步将其限定在胆碱能细胞中 。通过 Isl-1基 因调节纹状体特殊类型细胞的分化发育可能是一个新发现的机制。但有关 Isl-1是否有诱导神经干细胞向胆碱能神经元方向分化尚未见报导。 1.4 神经干细胞分化的基因调控 虽然许多外来信号在干细胞发育分化中起着重要作用,但并不能否定 干细胞自身基因在调节分化发育中的作用。外来信号从根本上讲也是由基 因产生的。有证据表明神经细胞发育的多样性可能与干细胞表达多种多样 的转录因子有关,不同转录因子的表达导致不同谱系的分化,这也是目前 研究的热点之一。脊椎动物的神经发生过程是前体细胞迅速发生接连事件 的过程;在第一个有丝分裂后的神经元产生之前,不同的转录因子已将某 吉林大学博士学位论文 18 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 一特定区域划分为不同的前体区域,当神经发生开始时,前体细胞完成增 殖分化并从某一特定区域迁移出来,这一过程主要涉及一组含有 bHLH结 构域的转录因子及 Notch信号系统。 1.4.1 bHLH家族 众多的研究表明,在脊椎动物体内,有与果蝇 achaete scute复合体asc 和 atonalato功能相近的基因,这些基因编码产生碱性螺旋-环-螺旋bHLH 转录子,因而被称为 bHLH基因。bHLH基因是决定神经细胞分化命运的 功能基因。在 bHLH 基因家族中,与 asc 功能相近的基因 Neurogenin1Ngn1、Neurogenin2Ngn2和与 ato功能相近的基因 MASH1 在中枢和外周神经系统神经细胞谱系的决定中具有重要作用。在发育的哺 乳动物大脑皮质,Ngn1和 Ngn2仅表达于神经发生时期皮质脑室区神经 [73,74,75] 上皮细胞 。 Ngn2与普遍存在的 bHLH蛋白如 E12和 E47形成二聚 体,然后二聚体通过碱性区域与带正电的 DNA序列结合,启动组织特异 [73] 基因表达,促使神经干细胞向神经元方向分化 。Ngnl 在促进神经干细 胞向神经元分化的同时抑制干细胞向胶质细胞分化。即使在有诱导向胶质 细胞分化的因子存在的环境中,Ngnl 仍可抑制细胞因子诱导的皮质前体 [76] 细胞和干细胞向胶质细胞分化,并诱导其向神经元分化 。Ngn2在皮质 前体细胞中的表达出现在细胞从高增殖、多分化能力的前体细胞向限制性 的前体细胞神经元性和胶质性这一特定阶段。MASH1 的诱导与干细胞 的初始分化同时发生, MASH1的强烈表达导致 nestin下调和 Prox 1上调, 从而正性调控细胞分化。与 Ngn2相比,MASH1的表达使干细胞更倾向 于向神经元前体细胞分化。MASH1缺失导致神经上皮细胞增殖减少,神 经元分化标志 Tuj 1表达减少。 Ngn2和 MASH1的功能有互相补偿的作用, 单一的 Ngn2或 MASH1基因缺失对大脑皮质发育影响不大,但两基因均 [77] 缺失可导致皮质发育不良 。总之,bHLH基因主要调节神经元及胶质细 吉林大学博士学位论文 19 第一章 神经干细胞研究现状及应用展望 胞命运的选择,错误表达后,可使分化的神经元减少,但对胶质细胞分化 无影响。 1.4.2 Notch信号传导系统 存在于动物体内的 Notch信号途径,在细胞间传导相互作用的信号, 并通过这种邻近细胞间的信号传递来精确调控各谱系细胞分化,在细胞分 化中起关键作用,特别是对于决定胚胎发生、造血及神经干细胞分化的命 运起着至关重要的作用。 Notch信号通路在哺乳动物 CNS发育中参与神经 发生过程、决定着 CNS祖细胞是选择继续增殖还是向神经元分化,因此 它决定着包括神经细胞在内的许多细胞的命运。激活的 Notch信号系统是 胚胎干细胞分化的抑制性通路,即当 Notch被激活时,干细胞进行增殖; 而 Notch信号系统活性被抑制时,干细胞进入分化程序,发育为功能细胞。 与 bHLH信号作用相反,Notch蛋白的作用为抑制干细胞向神经元方向分 [78] 化,并促进向胶质细胞方向分化 。研究表明,Notch的激活可抑制少突 胶质前体细胞OA分化为少突胶质细胞,并抑制神经上皮细胞向神经元分 化。在神经发生之前向小鼠前脑导入 Notch1NTC,发现转导 NTC的细 胞变成放射状胶质细胞,从而提示 Notch的激活在抑制向神经元分化的同 时,可促进体内皮质干细胞向放射状胶质细胞分化。在出生后,许多转导 [79] NTC 的细胞变成脑室周围的一种星形干细胞 。而正常表达于分化神经 细胞的 Notch配体可抑制神经干细胞产生神经元。Notch1和 Notch3的激 活可促使成年大鼠海马的多能前体细胞AHPs分化为星形胶质,且 Notch 信号的作用为指令性的。短暂的 Notch激活即可促使 AHPs不可逆地向星 形胶质分化。Notch信号的星形胶质诱导机制不依赖 STAT3通路,而是通 过形成 STAT3 Smad1复合体介导。 吉林大学博士学位论文 20 第一章 神经干细