睫状神经营养因子的研究进展

睫状神经营养因子的研究进展 第11卷第4期 2002年12月 中国组织化学与细胞化学杂志 CIIINF~EJoURNAL0FHII'0CHEMIYANDY Vo1.11.No.4 Dec.2002 睫状神经营养因子的研究进展 王特为王廷华刘芬吴林艳 (昆明医学院神经科学研究所,昆明650031) (中图分类号]R322.91(文献标识码]A 睫状神经营养因子(CiliaryNeurotrophieFae— tor,CNTF)最初是从鸡胚的眼组织睫状节中提 取出来,因对睫状节神经元有营养作用并可维持鸡 副交感神经节的存活而得名[1q].CNTF属神经调 节细胞因子家族中的一员,但不属于神经营养因子 家族成员.至今,已发现CNTF具有广泛的生物 学活性,如它对于感觉和运动神经元的分化,存活 及功能维持均具有重要作用_1].本文就CNTF的 结构,分布,生物学效应及其与脊髓损伤修复的关 系作一综述. 1.CNTF及其基因结构 1.1CNTF的结构CNTF最初由Helfand 等在1976年发现,1984年Barbin等从鸡睫状神经 元提取获得,并于1989年获得CNTF的eDNA. 人类CNTF(hCNTF)是一个由200个氨基酸残 基组成的酸性蛋白质,分子量为20,24kD,仅在 第17位有一个Cys,分子内无二硫键,无分泌信 号,无N一糖基化位点和信号及肽,能耐受剧烈的 化学处理[4].在CNTF一级结构的基础上预测 CNTF的高级结构,认为它和造血细胞因子如白细 胞介素一6(IL-6),白血病抑制因子(I.IF),抑瘤 素M(OSM),粒细胞集落刺激因子(GCSF)及 骨髓单核细胞生长因子(MGF)等有相似的螺旋 框架结构,故被认为是造血因子超家族的成员之 一 ,即均由A,B,C,D4个a一螺旋束组成分子的 骨架结构,称为神经节细胞因子.其中【)_螺旋中 部D2区与亲水的A—B螺旋连接区构成高亲和力的 受体结合位点[5],这种【)_螺旋结构的存在对其生 物活性十分重要;而C端形成的松散转角和无规 则卷曲结构对CN7,F的生物活性影响不大;B螺 旋结构后段和C螺旋结构可能形成蛋白质的疏水 [收稿日期]2002—05[修回日期]2002—07 [作者简介]王特为,男,(1972年),汉族,硕士生. 核心_6.7J. 1.2CNTF基因人类CNTF(hCNTF)的 基因位于第11号染色体长臂近端,属单拷贝基因, 编码区长600bp,两个外显子之间有一个lkb左右 的内含子,内含子介于第38~39位氨基酸残基对 应的密码子之间,转录起始位点(tsp)位于起始 密码子上游5bp,在tsp上游45bp存在可与转录 因子IID结合的TATA序列,该序列上游91bp存 在Jun和Fos家族二聚体结合位点5,-TGAHTCA* 3;终止子后650bp处有两个聚腺苷酸AATAAT 序列,这两个AATAAT序列与保守的AATAAT 系列不完全相同,产生编码400核苷酸的3翻译 区[8.9].有关CNFF基因的其它调控元件目前尚不 清楚.人,兔,大鼠CNTF同源性达84左右, 而与神经生长因子(NGF)的同源性却很低,其 分子结构和生物学活性也不同于NGF家族的生长 因子如神经营养因子一3(NT-3),脑源性神经营养 因子(BDNF)等_1... 2.CNTF的组织分布及其细胞内定位 以往很多实验明_1?,CNTF可由I型星形 胶质细胞,神经膜细胞,成纤维细胞和骨骼肌细胞 合成,因而其广泛存在于中枢和外周神经系统. CNTF阳性神经元和胶质细胞在中枢神经系统主要 位于大脑皮质,小脑皮质下区和胚胎脊索.体外培 养的I型星形胶质细胞也可见CNTF表达;用 CNTFeDNA探针原位杂交所证实,CNTFmR— 在胚胎脊索,脑干和后 NA具有特定的区域分布, 脑的表达明显高于听觉区[].Dobrea等采用免疫 组织化学研究发现,正常大鼠脊髓的白质中存 在着CNTF免疫反应复合物,他们还采用CNTF,/ 胶质源性酸性蛋白(GFAP,星形胶质细胞的特异 性抗体)双重标记组织化学研究发现了脊髓中的 CNTF免疫反应细胞,GFAP免疫反应呈阴性.说 明此类细胞并非是星形胶质细胞,推测它们可能是 490中国组织化学与细胞化学杂志第11卷 一 类少突胶质细胞.CNTFmRNA在脊髓中主要 存在于两类细胞,一类是脊髓的感觉和运动神经根 中的雪旺细胞;另一类则是位于脊髓白质中的少突 胶质细胞.综合起来看,CNTF阳性细胞在中枢神 经系统主要分布在大脑皮质,嗅球,小脑皮质下区 和脊髓白质;在周围神经系统主要存在于有髓神经 纤维髓鞘的雪旺细胞中. 细胞内定位:胶质细胞CNTF阳性免疫反应 定位于胞体,而突起呈阴性反应;在神经元主要位 于胞核,而胞浆呈阴性反应_】?.但也有报道在神 经元胞核,胞浆CNTF阳性免疫反应均呈阴性_】引. 在周围神经系统,CNTF主要分布于睫状神经节和 雪旺细胞的胞体和突起中l_】?. 3.CNTF受体(CNTFR)及其分布 3.1CNTFR的结构CNTFR不同于NGF 家族的生长因子受体,其组成和结构特点类似于 II,6受体和IIF受体.分子量52kD,是由三个亚 基CNTFR—a,I.IFR-t3和糖蛋白130(gpl30)组 其中CNTFR的a一亚单位是CNTF 成的复合体. 特异性结合蛋白,从而决定哪些细胞对CNTF有 反应;它不是跨膜蛋白,而是通过糖基一磷脂酰肌 醇(GPI)键锚在细胞膜上,与天然杀伤细胞刺激 因子的大亚基有很高的同源性;gpl30是一个分子 量为130的糖蛋白,在I176家族中作为信号传递 体;LIFR-[~分子量为190,是IIF的结合蛋白, LIFR-t3的胞浆部分没有蛋白激酶活性和GTP结合 位点,但并行排列的信号传递体gpl30和I.IFR-t3 与Jak_Tyk激活有关,故gpl30,I.IFR-I?与信号 传导有关_8引. 3.2CNTFR基因由于CNTFR的a一亚单 位是CNTF特异性结合蛋白,hCNTFR_a基因由 1O个外显子和9个内含子组成,长度至少35bp, 位于染色体的9p13位置,第一,二个外显子和第 十个外显子含5,3}翻译区,第三个外显子编码 信号肽序列,第四个外显子编码免疫球蛋白(Ig) 样结构域,第五到第八个外显子编码细胞因子样 (CRI)结构域,第九个外显子编码疏水的GPI识 别序列引. 3.3CNTFR的组织分布CNTFR在神经系 统和骨骼肌中广泛存在.在中枢神经系统以小脑 CNTFR-~mRNA水平最高,其它依次为后脑,中 脑,丘脑,下丘脑,纹状『本,海马,皮质和嗅球, 且脑脊液中也存在可溶性CNTFR-a.在周围神经 系统的交感神经节,副交感神经节也存在CNT FR.在外周组织中以骨骼肌的CNTFR_amRNA 水平最高,其次为皮肤,肺,肠,肾,肝,脾和胸 腺. NTF的作用机制 4.C CNTF生理作用的发挥是通过与CNTFR结 合,而后发生的一系列复杂生理反应过程.Op— penheimRWl_】等研究发现在敲除了LIFR-{~或 CNTFR—a基因的胚胎小鼠中枢神经系统中运动神 经元有明显减少.相反,IIF或CNTF基因的缺 失对发育中的运动神经元并没有明显影响.由此可 能存在一种机制在CNTFR基因缺失的小鼠胚胎发 育期间运动神经元的减少发挥作用.一种可能参与 此机制的物质是CNTF_IIF家族成员心肌营养因 子一1(CT一1).C1是第一个真正被证明了的对胚 胎发育中的运动神经元的存活所必需的肌源性神经 营养因子,它在胚胎骨骼肌中有高水平的表达并由 肌管分泌产生,对培养中的大,小鼠运动神经元有 促进存活的作用.Oppenheim还发现从胚胎14天 至生后1周之间,由于CT一1的缺乏致使脊髓和脑 干神经核团中运动神经元的死亡数增加.而有趣的 是,在生后的随后时期并没有发现运动神经元的死 亡数有进一步的增加,并且在缺乏CT一1的年轻成 年小鼠中,周围神经的损伤并没有导致脊髓后角运 动神经元有明显额外的减少,正如先前在缺失 CNTF和IIF基因的小鼠所观察的那样L1. Nishimune发现在培养的脊髓前角运动神经元 中,CNTF相关细胞因子可以诱导Reg-2的表达 (Reg-2是一种胚胎发育期依赖于细胞因子并由胚 胎运动神经元分泌的分泌型蛋白,也即胰腺炎相关 蛋白一1,PAPI一1).Reg-2对于运动神经元的某些 亚群来说本身是以自分泌/旁分泌的形式来分泌神 经营养因子,并通过激活PI一3激酶,Akt激酶和 NP-kappaB途径发挥对运动神经元的促存活作用. 利用Reg一2抗性的腺病毒特异性阻止Reg一2在运动 神经元中的表达,从而可废除CNTF对培养中的 运动神经元的作用,这提示Reg-2的表达是CNTF 促进运动神经元存活途径中所必需的一步.Reg-2 在晚期胚胎脊髓中具有独特的表达模式:在运动神 经元中,Reg一2的表达逐渐上调并以单个细胞为基 础的方式进行表达,提示只有一部分运动神经元暴 露在细胞因子之中.因此,Reg一2是运动神经元的 神经营养因子,并且它本身也是CNTF促进运动 神经元存活途径的必需的细胞因子媒介C15]. 在成人神经系统中,颅脑和脊髓运动神经元对 第4期王特为等.睫状神经营养因子的研究进展 CNTF非常敏感,并且在被抗CNTFR抗体 (AADH—CNTF)封闭时,酪氨酸激酶(STArr3) 磷酸化会被很快终止.与此形成鲜明对比,表达有 CNTFR的其它类型神经元的STAT3磷酸化水平 却不随着CNTF的处理而增加,甚至在CNTF被 高浓度使用时也不会增加.因此,在体内由CNF— FR诱导STAT3的信号转导是受到调控的.目前 的资料提示,至少这种调节的某些步骤发生在 STAT3酪氨酸磷酸化阶段,结果提示由受体引起 的STAT3信号转导的其它形式也许受到相似的调 节. 在其它研究中,有人报道,CNTF通过GPI 与键锚在细胞膜上的CNTFR-a结合而启动传导, 进而引起gpl30和I.IFRI3的聚合,激活gpl30上 Box-1区Jak激酶的活性,然后引起gpl30远端 Box-3区的磷酸化,Box-3吸引STAT3的SH2区 与之结合,最后STAT3被Jak激酶活化,导致 STAT二聚体的形成.STAT3转位到细胞核后, 通过结合到DNA上的基因反应元件调控转录口. 最近研究还发现,CNTF通过其受体介导可致胞 体,核内及树突内磷酸化的STAT3明显增加,提 示STAT3酪氨酸激酶磷酸化是CNTF发挥作用信 号转导关键的一步l_1引. Dolcet研究了Jak/STAT,Pl一3激酶/Akt和 ERK途径的激活.CNTF在短时间内激活了 STAT3和ERK途径,而没有激活PI-3激酶途径. Jak-3抑制剂可以抑制细胞因子和靶肌肉介导的促 存活作用.相反,一种ERK抑制剂PD98509却不 能抑制细胞因子介导的促存活作用.由此说明 ERK与此途径无关.但是PF3激酶抑制剂 I.Y294002也能阻止细胞因子介导的促存活作用. 与对照培养组相比较,随着细胞因子处理时间的延 长,在后阶段PI一3激酶的活性开始激活,这种延 迟增强的活性完全能被Jak-3抑制剂所阻止.综合 之,CNTF促进运动神经元存活的细胞内途径是通 过Pl一3激酶的激活而实现的.而Pl一3激酶的激活 必需有依赖于Jak途径合成的蛋白质的参与]. 综上所述,CNTF生理作用的发挥有赖于与 CNTFR的结合.从而使STA'I,3磷酸化继而发挥 作用.在这个过程中必须有CT1和CNTF相关因 子分泌的Reg一2的参与,而且Reg一2是CNTF促 进运动神经元存活途径中所必需的一步.STArr3 酪氨酸激酶磷酸化是CNTF信号转导关键的一步. 5.CNTF的生物学效应 5.1维持神经元存活CNTF最突出的功能 防止受损神 是促进中枢和周围运动神经元的存活, 经元退变,以及对运动神经元功能的维持,这在基 底前脑胆碱能,黑质多巴胺能,丘脑前腹,背侧核 以及面神经核和脊髓运动神经元均已得到证明.对 培养的鸡胚运动神经元,CNTF是最有效的神经营 养因子.经毒物处理可致培养中的脊髓运动神经元 死亡,而应用CNTF对损伤的脊髓神经元存活有 明显的营救作用L2.通过基因重组造成CNTF基 因缺陷,虽在胚胎发育时期对运动神经元发育影响 不明显,但随着年龄的增长,日渐显出CNTF对 维持神经元存活的重要性,说明CNTF虽与运动 神经元的发育无关,却对出生后运动神经元功能的 维持,防止运动神经元退行性丧失有着重要作用. 外周神经切断可引起相应脊髓皮质运动神经元 (Cortispinalmotorneuron,CSMN)死亡,应用 CNTF,NT4,GDNF能支持部分脊髓皮质运动神 经元存活.CNTF和GDNF可维持被纯化的CS- MN存活至少5天;而NT4则对纯化的SCMN作 用不明显,但对未纯化的CSMN有作用,表明 CNTF和GDNF可直接对CSMN发挥营养作用, 而NT4作用的发挥则需辅助细胞参与[2?.此外, CNTF还可阻止体内神经元的退行性丧失和新生小 鼠面神经元由于轴突横断而引起的退行性变l2. 遗传型进行性运动神经元疾病(progressivemotor neuronopathy,pmn)突变鼠在植入可产生CNTF 的细胞后,面神经核神经元的存活数增加,膈神经 轴突数增多,运动功能得到改善,小鼠存活时间也 显着延长.pmn鼠由于运动神经元退行性病变, 在生后6周,4O面神经运动神经元已发生退变, 使其雪旺细胞中的 如在生后第4周切断面神经, CNTF得以释放,则面神经损伤侧的运动神经元存 活数显着增加,表明内源性CNTF能阻止体内神 经元的退行性变[2引.新生大鼠脊髓运动神经元胞 体对轴突损伤反应敏感,容易导致胞体变性,死 亡,但生后3周这种易感性明显减弱,可能与此时 雪旺细胞CNTFmRNA蛋白质水平较高有关.利 用同源重组技术修饰CNTF基因(基因打靶技术) 使其失活,可导致动物先天性运动神经元变性,死 亡4l;此外,近年还发现CNTF能促进运动神经 元轴突再生川. 5.2诱导神经元分化在体研究发现CNTF 能诱导胚胎神经元的发育,分化.CNTF不仅可阻 止交感神经细胞的增殖并促进其分化,而且它还是 492中国组织化学与细胞化学杂志第11卷 交感神经元的胆碱能分化因子,如CNTF能通过 提高胆碱转乙酰酶(CHAT)而降低酪氨酸羟化酶 (TH)的水平,将肾上腺能神经元转变为胆碱能 神经元.引. 5.3对胶质细胞的作用大鼠0—2A胶质前 体细胞既可以分化为少突胶质细胞也可以分化为星 形胶质细胞.CNTF能诱导体外培养的0—2A胶质 前体细胞向II型星形胶质细胞分化l】.进一步研 究表明,CNTF可以由I型星形胶质细胞产生,这 种细胞由于受损或受某种因素影响释放CNTF,从 而和其它因子共同作用来诱导0—2A前体细胞分化 为II型星形胶质细胞(Lillien等.1990).在体 但也需 外,CNTF能够促进少突胶质细胞的存活,要和其它因子的联合作用(Barres等.1993).此 外,CNTF能保护少突胶质细胞免受肿瘤坏死因子 一 a,p(TNF-a,p)的杀伤.在体内,由于脑内 CNTF广泛分布,而且主要存在于胶质细胞中,所 以CNTF很可能还作为胶质细胞的保护因子.这 一 结果为临床研究,治疗胶质细胞病变提供了新思 路(Louis等.1993). 5.4CNTF与神经再生周围神经雪旺细胞 含有较多的CNTF和CNTFmRNA.神经损伤后 远侧段神经雪旺细胞中的CNTF和CNTFmRNA 明显减少,至伤后2周几乎观测不到[2引.当坐骨 神经损伤后,CNTF在雪旺细胞中的表达量与神经 的功能状况同步.用硅胶管桥接,并于硅胶管中加 入CNTF,术后每天皮下注射CNTF,结果表明, CNTF能促使更多的运动神经元轴突再生,通过修 复部位到达腓总神经中,此类神经元的数量于术后 4周时已相当于外膜缝合后9周时的数量,而对感 觉神经元轴突再生的作用不明显[2引.当发生华勒 氏变性脱髓鞘化时,CNTF的表达降低;当神经再 生而再脱髓鞘化时,CNTF的表达恢复正常,至伤 后4周随神经再生成功,CNTF的表达逐渐恢复至 正常水平[2.外周神经损伤后,肌中CNTF受体 的表达将增加数十倍,可溶性的CNTFR—a与 CNTF形成的复合物也增多.引,从而有利于神经 损伤的修复,若此时在靶肌肉注射CNTF可明显 促进周围神经再生和神经功能恢复29].随着再生 提示雪旺细胞 神经纤维增多,CNTF表达也增多, 表达CNTF与轴突生长硬神经再生程度有关,此 时若补充外源性CNTF可能会改善神经再生的微 环境. 5.5影响非神经组织CNTF属于细胞因子 大家族的成员,因此它对非神经组织生理,病理过 程有调节作用.下述两种现象表明,CNFF可能是 神经元性肌营养因子:?CNTF在周围神经中有丰 富表达;?CNTFR-a,gpl30,I.IFR-~在骨骼肌 中表达丰富.此外,CNTF促进运动神经元轴突在 正常肌肉中分支发芽.在体内,在去神经去血管引 起肌损伤的情况下,应用CNTF能直接作用于肌 原细胞,加速肌管分化形成,增加再生肌纤维的数 量,促进肌再生?.神经损伤后,其支配的骨骼 肌萎缩,CNTFR—amRNA表达增高20,50倍. 而应用CNTF后,可减少神经损伤后引起的肌总 蛋白的丢失以及肌肉湿重的降低;且肌痉挛张力及 强直张力较对照组高[3引.动物整体肌活动能力与 周围神经中CNTF含量呈正相关.而给老年鼠应 用CNTF治疗后,肌张力明显增强,肌纤维横断 面面积增大E331. 体外实验证实,CNTF能够微弱抑制外周血单 核细胞产生II一8和前列腺素E2,加入CNTFR-a 后CNTF的这种抑制作用大大加强_3.此外, CNTF能抑制胚胎多能干细胞的分化[3;可在急 性炎症反应中诱导肝细胞表达急性期反应蛋白 (APP)口6];皮下注射CNTF可预防失神经支配的 肌发生萎缩[37,27].近来发现CNTF可诱导大鼠胶 质瘤C6细胞的p淀粉样前体蛋白水平增高[3引.将 CNTF注人大鼠皮下或腹腔,7,10天后可使其发 生恶病质[..Gupta等发现[0]CNTF可刺激小鼠 胚胎癌P19细胞发生分化,诱导轴突形成,使神 经丝合成增加.它也可刺激小鼠神经母细胞瘤细胞 轴突生长,使人神经母细胞瘤细胞的胆碱乙酰转移 酶活性增高,从而促进瘤细胞的分化[411.近年还 发现CNTF与其它生长因子合作有协同营养作用. 目前,已知神经营养因子与神经元的关系并非一一 对应.一方面,一种神经营养因子可作用多种神经 元;另一方面,一种神经元接受多种营养因子的营 养,调节,而且神经营养因子之间存在协同作用. 例如,在培养的运动神经元基质中加入BDNF或 CNTF均能分别使胞内CHAT水平升高,而联合 应用则更加明显;进一步研究发现:单独应用BD- NF或CNTF均不能阻止Wobbler突变鼠神经肌肉 的进行性退化,但两种因子联合应用却能阻止其发 病. 6.前景与展望 CNTF是神经源性的营养因子,CNTF及其受 体广泛存在于神经系统中,对多种神经元具有营养 第4期王特为等.睫状神经营养因子的研究进展493 作用,包括脊髓运动神经元,交感神经元,副交感 神经元,感觉神经元,海马神经元等.是目前发现 的唯一同时具有神经营养作用和肌肉营养作用的因 子,又由于CNTF有明显促进中枢和周围运动神 经元存活,防止受损神经元退变的功能.由此,它 可能对人类运动神经疾病,神经损伤及肌肉萎缩等 治疗上发挥重要作用.目前主要将其应用于治疗运 动神经元疾病如肌萎缩侧索硬化(AIS)t"引.其 方法是通过基因转导技术将CNTF的cDNA转入 需治疗的神经细胞或肌肉细胞中,使其表达活性的 CNTF,达到治疗的目的.这种方法可避免全身用 药的副作用,故对神经系统及肌肉系统疾病的治疗 具有广阔的应用前景L4.另外,CNTF对帕金森 氏症的治疗已进入?期临床.尽管存在副作用,但 是通过改变剂量,改变给药途径以及与其他细胞因 子联合使用(如BDNF)可以达到治疗效果[4. 不过,在CNTF作为药物广泛应用之前,还 需要解决以下问题:首先,CNTF天然来源少,不 易大量获得.因此用重组DNA技术来获取大量活 性hCNTF已经成为当务之急.其次,CNTF的给 药途径需要改善,对于外周神经系统疾病和脊髓疾 病,皮下给药,脊髓腔给药可能达到治疗需要;但 对于中枢神经系统疾患,还需要灵巧方便的给 药途径装置,如在中枢疾患处植入可以稳定表达分 泌CNTF的细胞也是一种良好方法.最后是关于 CNTF作为药物的安全性问题,虽然动物实验表 明,CNTF不会导致任何行为异常,但积极而慎重 的基础药理学实验和临床药理学研究是必需的.深 入开展CNTF结构,受体,功能研究,将为 CNTF用来治疗神经系统疾病提供可靠的依据和基 础[6l. 参考文献 (13AdlerR,LandaKB,ManthorpeM,eta1.Cholinergic neurotrophicfactorsintraoculardistributionoftrophic activityforciliaryneurons.Science,1979,204:1434— 1436 (23BarbinG,ManthorpeM,Varon&Purificationofchick eyeciliaryneurotrophicfactor.JNeurosci,1984,43: 1468—1478 (33LinLFH,MismerD,LilejD.eta1.Purification.clo— ning,andexpressionofciliaryneurotrophicfactor.Sci— ence,1989,246:lO23—1025 ,4]LamA,FullerF.MillerJ.eta1.Sequenceandstruc— tureorganizationofthehumangeneencodingciliary neurotrophicfactor.Gene,1991,102:271—276 (53BazanjF.Neuropoieticcytokinesinthehematopoietic f01d.Neuron,1991,7:197—208 (63何成,陈江野,路长林等.人睫状神经营养因子结构各 功能的研究.生物化学与生物物理,1996,28:458 — 463 (73ArmaniniM,WangS,HouenouLj,eta1.Cardiotro— 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