有机磷杀虫剂乐果对乙酰胆碱受体通道的阻断作用

有机磷杀虫剂乐果对乙酰胆碱受体通道的阻断作用 有机磷杀虫剂乐果对乙酰胆碱受体通道的 阻断作用 f争1D,一 第26卷第3期 1541997年5月 卫生研究 JOURNALOFHYGIENERESEARCH Vo1.26No.3 May1997 有机磷杀虫剂乐果对乙酰胆碱受体通道的阻断作用 中骶p.S-yY100050)/王(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所.北京 摘要在非洲有爪蟾蜍胚胎神经和肌肉细胞上.用膜片钳技术研究了有机磷 杀虫剂乐果对乙酰胆碱受体(AchR)通道的作用,发现它对自发微终板电流 (MEPc)有双重作用,低剂量(21.6$tmol/L)增加其幅度和频率,高剂量(237~mol/ L)则相反.1465tmol/L乐果缩短通道开放时间降低开放概率.对AChR通道电流 幅度和细胞膜钠,钾通道电流无影响.提示乐果为AChR通道开放阻断剂.本实验 从分子水平上为有机磷杀虫剂对AchR的直接作用提供了依据. 关薯词有机磷杀虫剂非洲爪蟾培:葛中善 BlockingEffectsofDimethoateonAcetylcholine ReceptorChannels XuHaibin}HeXiwen;XleZuoping;HeFengsheng (InstituteofOccuPationalMedicine?Chin~eseAcademy ofPreventiveMedicine,Beijing100050?China) Thepatch-clamptechniquewasusedtostudytheinhibitoryettectot dimethoate,anorganophosphrouspesticide,onthemembraneotembryoincXena-- pusmuslecellsinculture.Usingwhole—cellclampandcell—attachedclamp,we toundthatthedirectinhibitoryeffectsofdimethoatewasevidencedonboth miniatoreend—platecurrents(MEPC)andsinglechannelcurrents.Dimethoatej11- creasedtheamplitudeandfrequencyofMEPCatalowerconcentration (21.6mol/L)whilebothdecreasedatahigherconcentration(237/.tmol/L).The dimethoateataconcentrationol146?mol/Lshortenedtheopeningtimeandde— creasedtheopeningprobabilityotthesinglechanne1.Theresultsshowthat dimethoate|sanAChRchannelblocker. Keywords:organophosphrouspesticide{acetyIch0linegicreceptors;patch clamp;Xenopuslaevis *卫生部重点研究课题,国家自然科学基金贷 助项目39430110有机磷杀虫剂是目前我国杀虫剂中使用 1清华大学生物科学与技术系量最大的品种之一.每年常因各种原因发生 第3期馀海滨,等.有机磷杀虫剂乐果对乙胆碱受体通道的阻断作用155 中毒与死亡.并且出现"中间综合征等一些 新的毒性问题.传统上认为它是通过抑制乙 酰胆碱醋酶(ACHE)产生毒性作用的.由于 乙酰胆碱受体(AChR)特异阻断剂口一银环蛇 毒(a—BTX)的发现,AchR的分子生物学研 究取得迅猛发展胆碱酯酶抑制剂对AChR 是否有直接作用引起毒理学家们的极大兴 趣,这方面的研究在G类战争毒剂和某些氨 基甲酸醋类化合物上已取得一些进展.有机 磷酸醋类化合物与AChR的直接作用,目前 偏重于中枢神经AChR的毒草碱样受体(M 受体),对外周神经AChR的烟碱样受体(N 受体)的影响研究较少.烟碱样乙酰胆碱受体 (nAChR)是神经肌肉接头(NMJ)处的主要 受体蛋白,它是由5个多肽亚基组成的: n2a,其中a亚基有两个,每个亚基都有一 个活性基团可特异结合一个乙酰胆碱 (ACh)L1].nAchR通道活性变化是肌肉细 胞兴奋和收缩的前提,近年发展起来的膜片 钳技术能直接观察到可兴奋细胞生物电活动 相关的基本单元——离子单通道的动力学特 征及其相关因素.本实验首次利用这一技术 观察了有机磷杀虫剂乐果对神经肌肉接头 nAChR通道及钠,钾离子通道作用. 1材料与方法 1.1材料乐果:纯度98,由上海农药 厂提供.30ram塑料培养皿(Fluk公司).胎 牛血清(S~ma公司),玻璃毛细管(VWR 科学公司). 1.2细胞培养技术 1.2.1采卵;将分别注射过绒毛膜促性腺 激素(HCG)的雌雄非洲爪螬(Xenopus laavis)各1只放在暗处,使其受精排卵.取 卵程序t第1天早8t00雄塘,每次剂量 250IU(0.5rag).午2l00SC雄,雌蟾,晚8 t00sc雌螬.第2天选择发育良好的胚胎 保存待用. 1.2.2细胞培养:取22期(受精24h)蛙 胚,无菌条件下培养.先用75酒精消毒, 在10Ringer液中剥去卵膜.井在10 Ringer液中洗4遍,在无ca及无Mg的 Ringer液中剪下背部中段的神经管和少量 中胚层细胞,放置消化约20,30rain.细胞 自然散开.用新拉制的毛细管吸取细胞.划 线接种在塑料培养皿内事先固定好的干净 的盖玻片上,培养液总量2ml,放入25?培 养箱中培养24h后即可进行电生理学实验. 培养基成分(pH7.2):Leibovitzmedium (L15)30,胎牛血清2,Ringer液68. Ringer液(pH7.4,mmol/L):NaC1ll5, CaCI22.0.KCI2.5,HEPESi0. 1.3单通道技术 1.3.1微电极的拉制:利用微电极拉制仪 (NauishigePP一83,Japan),拉制出尖端约 1m的玻璃毛细管电极在微电极尖端涂 上树醋(SyIgard)井烤干,然后用微电极抛 光仪(NauishigeMF一83,Japan)抛光.使尖 端光滑并且开口在(0.65士0.15)/*m之间, 拉制过程中避免电极的枵染. 1.3.2离子单通道仪器及膜片钳技术:用 单通道放大器(ListEPC一7)仪记录信 号于示波器(TEAc—XR一30(2)并存入微机 或磁带记录仪(TEAc一3OC).实验结果用双 道记录仪(GOuLD一2200)绘制.利用全细 胞式和贴附式膜片钳技术进行本实验.记录 工作在上述培养基中进行. 电极内液组成(pH7.2,mmol/L):KCI 82,KOH35,CaC121,DGTA11.HEPES5. 培养和记录都在室温20~25?进行. 2结果 2.1有机磷杀虫剂乐累对神经肌肉接头自 发搬终板电流(MEPC)的影响在培养的 细胞中可见形态各异的神经元和肌细胞.有 些神经元和肌细胞形成接点联系以前的工 …一一…一-—1T?—_ 卫生研究第26卷 B C 作证明这种联系是胆碱能性的.培养良好 的肌细胞可见其跳跃活动,对这类肌细胞进 行全细胞电位钳制可以观察到神经肌肉接点 (NMJ)处的MEPC. 乐果对MEPC作用具有双重性,平皿终 浓度21.6~mol/L可增加MEPC的幅度和 频率;当浓度增加到237t~mol/L时则减小 霉平 圉1不同浓度乐果对培养的非洲爪螬卵母细晦神经肌肉接点自发散终板电流的 影响(A)实 验设计(B)自发错终板电流(内向电流向下.箭头所指为加药时间.静息电位80mY) (c)为(B)的放大记录 MEPC幅度和频率(图1).在记录时间内(> 30rain)未观察到MEPC完全阻断现象,以 Ringer液代替乐果加入培养皿中对MEPC 未产生同样影响. 2.2有机磷杀虫剂乐果对肌细胞钠电流,钾 电流的影响对独立的肌细胞进行全细胞方 式的电压钳制(一78,一80mY,接近肌细胞 的实际静息电位),给予肌细胞频率为 0.2Hz,幅度为0.6mV的电刺激,可记录到 肌细胞去极化时的离子电流——钠电流和钾 电流.在培养皿中加入终浓度为108,umol/L 的乐果后观察10min,均未见到钠电流和钾 电流的明显变化(图2). 2.3有机磷杀虫剂乐果对AChR通道的影 响在电极尖吸取约11含0.5~mol/LACh 的Ringer液后,在电极后部充满含有不同浓度 的乐果和0.5~mol/LACh的Ringer液的混 合液,选择培养皿中孤立的肌细胞迅速做成贴 附式膜片钳电压钳制于+2omV,即可记录到 AchR的开放活动.当电极后部的乐果逐渐扩 散到电极尖端,就能观察到对AchR通道的影 响.有机磷杀虫剂乐果对AChR通道发生作用 很快,2min内即可发生,通道开放时间缩短,开 放数目减少(图3).不同浓度乐果对AchR通 道参数的影响见附. 3讨论 胆碱酯酶抑制剂在抑制AChE的同时 158卫生研究第26卷 (上接第153页) 要进行3步有机溶剂的萃取,我们只用2步, 减少了抽提中对DNA的机械损伤.对乙醇 沉淀后的DNA,我们用异丙醇和75乙醇 清洗,去除杂离子,避免对以后的酶反应产生 不良影响.我们用纯化后的PCR产物成功地 进行了SSCP分析和DNA测序.该套纯化石 蜡包埋尘肺组织PCR产物的方法,为石蜡包 埋尘肺合并疾病肺组织的分子生物学研究提 供了基本手段. 4参考文献 lGoelzSE,HamiltonSE.VogelstelnB,eta1. Purificat[oinofDNAfromformaldehydefixed andparaffinembededhumantissue.BiocheI111 BrophysicResComm,1985-130(1)l118 2MichaelAI.DavidHG,JohnJS.eta1.PCR protoca1.Callfornia:AcademicPre日s,l989 3S~mbrcokJ,FritschEF,Maniat.培T.Recov. eryandpurificationofDNAfractiohalOna. garosegels.MolecularCloning.NewYorkl ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989 (1996-09-06收稿)