【doc】奴卡氏菌病的实验诊断

【doc】奴卡氏菌病的实验诊断 奴卡氏菌病的实验诊断 奴卡氏菌病的实验诊断 泸州医学院附属医院刘朝一综述周华春审校 ?蜜近几年.担卡瞳?舟的亮毽谚斯技术有了毒}的囊展.为了简便,快速和可靠地 实现耐车一|的早j靠 谚断和精疗,奉文综述了奴卡瞳菌曲彤盎学,培井童血谤学进展?并对进些新谚斯 方眭作了评竹a 奴卡氏菌病(Nocardisls)是一种不常见 的疾病,可分为系统奴卡氏菌病和皮肤奴卡 氏菌病两个类型.前者最为多见,几乎均始 于呼吸遭,主要是吸入星形奴卡氏菌引起; 后者又分为4型:(1)足分支菌病(足 肿)j(2)淋巴皮下感染(类孢子丝菌 病);(3)浅表皮肤感染j(.4)伴有皮肤 受累的系统奴卡氏茵病.这些感染主要是由 巴西奴卡氏菌和豚鼠奴卡氏菌直接经伤口侵 入皮肤所致.系统奴卡氏菌病在北美多 见,皮肤奴卡氏菌病在南美,印度和非洲多 见 近几年来奴卡氏菌病已不罕见,在有或 无免疫异常的人中均可发生''.早期诊 断并早期治疗,可l00%治愈.若诊断延误, 病死率可达30~50呖,因此准确而及时的诊 断十分重要.现将新近有关本病的实验诊断 作一简介. 细菌学诊断 . 形态学 奴卡氏菌用常规苏木精和伊红法不染 色,因此若不用特殊染色,在组织切片上常 漏诊'.用Broun等染色可显示菌丝几种 真菌染色法,如GomoH氏环六甲四胺银,只 要延长染色时间也可证实奴卡氏茵.用皂镜 观察感染材料中硫磺颗粒的构成对诊断也 有帮助'.因组织学检查是损伤性的,常不 为病人所接受. 将临床标本直接涂片染色?,奴 卡氏菌为革兰氏阳性,呈分支的细丝(直一 径<ll-tm)或球杆菌样,着色多不.大, 礓醑,杆菌弱.用改良 一 17? Ziell-Nee]sen法,以0.5—1呖硫酸代替酸 酒精脱色是证实本菌的较好的方法.抗酸性 还随菌株的保存时间和传代次数的增加而逐 渐减弱,甚至消失.在常规条件下,若检出 菌不抗酸,可初步"非抗酸需氧放线 菌" 培养 标本包括痰,脓'脑脊渡和其他组织材 料.奴卡氏菌在血琼脂,沙氏,罗氏琼脂和 普通琼脂上,在肉骨汤,脑心浸液,硫乙醇酸 盐肉汤中均可生长.如要生长得更好,可加 10呖CO2.37?是培养的最佳温度.若标本 (如痰)含杂菌太多,可提高孵育温度至4O 一50?,或预先用0.5霸乙酰半胱氨酸 (NAC)',2霸NaOHNAC或氯化苯烃铵 (Zephiram—TSP)处理,或接种选择性培养 基.在璩脂上,有的奴卡氏菌株于2—3 天出现小的黄色菌落.由于气菌丝柏存在可 有天鹅城似的表面,颜色多为白色或浅秸红 色,链霉菌多为灰色,皆有特征性的霉臭或 土臭味.到5—10天,菌落堆起,有不规则 折叠,呈黄至深桔红色颜色和气味可园所 甩的培葬基和培养时间不同而不同,因而不 能作为唯一鉴定依据.镜下可见到细的,分 支状和纵横交错的菌丝,常带有增殖菌丝 体.除巴西奴卡氏菌外,均产生分生孢 子""'.培养物应保持30天,以免生长 慢的菌株漏检. 最近有人用石蜡诱饵法分离痰标本中的 奴卡氏菌.该法具有高的检出率它是将经 过处理的痰标本加入有5~?mlMeaung无 碳肉汤的试管中,再插入1支覆盖有石蜡的 玻棒,然后置37"C孵育4周.若为阳性标 本,约于1周左右就会在石蜡棒的肉汤液面 处出现奶油售至桔红色生长物,再把生长物 蝴线接种刭沙琼脂上,便可分离出单个菌 落.Singh等'用此法检查了1510份痰标 本,分离到67株星形奴卡氏菌,面甩常规方 法仅培养出3O株 动物试验" 大多数奴卡氏菌(尤其是星形奴卡氏 菌)对小白鼠和豚鼠致病.可将分离的菌株 腹内接种,常于7—14天死亡.死后检查可 发现大量脓性渗出物,涂片染色可有典型形 态学,则证实本病.但由于各株的毒力和动 物对奴卡氏菌的敏感性不一,所以动物试验 不一定可靠,阴性嫱果并不B说明问题.晟 好还是通过生化鉴定 种鉴定 奴卡氏菌属有3O个种,其中3个种(星 形奴卡氏茵,巴西奴卡氏菌和豚鼠奴卡氏 菌)具有临床意义.这些种与其他需氧放线 菌,如足肿救线菌.链霉菌,细单孢子菌和 红球菌等很糟似,但在治疗上却有所不同, 应予鉴别(见下表)". 传统的鉴定方法有酪蛋白,酪氨馥,磺 曛呤水解试验,溶菌酶耐受试验和尿素分解 试验等但起决定性作用的是L一或间一二氢 基庚二酸(DAP)试验.经验证明,这种方 法虽稻麻烦,但只要操作仔细,技术上并不 存在任何问题.一个熟练的技术员仅需报短 蝴即可完成,且比常规方法易于封断结暴. 大多数医院都能采用.有人建议DAE应作 为常规试验现特方法简介如下". 取lOmg干的待定菌细胞于加有1ml6N HCl的5ml安瓿内,并熔封.置100?加热 水解5小时,砖后过滤,取此液1Ol在华特 门1号滤纸上点样,用甲酵一水-ioNHCI一 毗啶层析16".-'18小时,待干后浸入O.2%醋 酸茚三酮,置100?2分钟显示斑点DAP 呈橄榄绿色,但随之退为黄色,L—uAP走 在间-DAP之前数厘米,而其他氨基酿斑点 为紫色,也将镊帙退去,这些氨基酸均在 DI4p之前.由于奴卡氏菌含阃-DAP,链 霉sm-L-DAP,所以检测DAP的类型是 区剐奴卡氏菌和链霉菌的可靠方法 奴卡氏茵与其他放线茵的鉴别表" 阿 . I瞢置牌霪l尿素一DAP N.星+一I—f—l十+/-N.巴西+一l+l一『++ N.豚鼠+一一J?J一+/一 链霉菌一:{:I:}二+/-足肿旋螭菌+一 奴卡氏菌台支菌酸,而链霉菌和足肿放 线菌无支菌酸,园而用高效液相色谱法 (HPLC)可检测其支菌酸的存在,并 将其鉴别开来.Butter等最近拘研究证明, 在所试的3株奴卡氏菌中,在HPLC色谱 图上均有t2"y14个峰组成的蜂群,而2株足 肿放线菌和1株链霉菌,在支菌酸区刚无任 何峰出现,因而认为HpLC是鉴定禽支菌 酸菌(如奴卡氏菌,)与链霉菌的一种快速和 特募的方法. 挠蕾刹敏蒜试验" 磺胺是治疗各型奴卡礞藏病的瞢j毫萄, SMZ联台应用效果更好,特别是严 TMlP— 重的系统奴卡氏鸷病.二甲氨四环素可舴第 二选择萄,已有单用此萄治疗成功者.最近 的试管内研究表明,丁胺卡那霉索,亚胺硫霉 素(imipenem),氨苄青霉素十棒酸(Aug— mementin)也是有效的但是在有条件的 情况下,最好是将分离菌作药敏试验,并按 药敏试验结果治疗药敏的方法有纸片法, 琼脂扩散法和肉汤稀释法.这些方法与其 他细菌的药敏试验大体相同,值得一提的是 菌悬滚构锫j备.现以纸片法为例简介如下. 将待试菌接种入含有5m1玻珠的肉汤 (如Mueller-Hinton肉沥)中,置37?孵 育,每日旋转混合培养液1次,以阻止成丛 生长和获得均一的菌悬液.当有较大的菌团 ? 175? 块时,颓离心移去.然后将浊度调至0.5麦 氏浊度(10.,,10sc~u/ra1).用棉纤蘸取 菌液涂复予—H琼脂j,贴上欲试的抗荫 剂纸片,孵育后观察结果已有表明, 纸片法与琼脂稀释法和肉汤辅释法均有良好 的相关性. 血清学诊断 过去诊断奴卡氏菌的血清学技术在敏感 性和特异性方面都不甚满意,主要是缺乏 适当的抗原.i985年发现星形奴卡氏菌可产 生一种特异的55-KDa蛋自后,就用这种簧 自作为抗原发展j一种抉遂血清学技术__- 酶免疫试验(EIA).该法敏感而特异,且 不与结核病人血清起交叉厦应.用EiA检 查了22侧奴卡氏菌病人,结果有91嘶的奴卡 氏菌病倒血清都有?1:255的效价,而对照 衙僦均?i:25G; 最近A.ageles等又傲现巴西奴卡氏菌 和豚鼠奴卡氏菌也有55-KDa蛋白拭原并 用点印迹法作奴卡氏菌感染的诊断.方法是 将含55-~KDa蛋白的硝酸纤维膜方块放凡苑 菌培养皿中,然后加入孵育液,再加待检血 清,置s7oc保温2小时,用TBs吐温20洗2 次.荐加抗人或抗兔辣根过氧忱酶结合:IgG. 在37?孵育1小时,冲洗后立即用4,氯一1 — 荣黯显色.5一1o分钟用蒸龋水代替溶渡终 止反应r在抗原位置处出现颜色反应为阳 性Augeles等用此法研究了6例巴西奴卡 氏苗和2倒足肿放线菌剞起的足肿,结果足 肿病悄100啦为阳性,1O侧住院对照病例均 呈阴性. 最近还有人用频脉冲电子捕捉气液相色 潜法检割奴卡氏菌病人血清中的奴卡氏菌代 谢物诊断本瘸,也获成功.但这些方法都 还在研究中,且需要一定设备,目前还难于 推广 176 参考资料 1.KBhnFWeta【:AmJMed198II70:85g 2.AngelesAMetalIIC/inMicfobiD11987; 25(1):2278 3.schulmanBLetaltAmJMegsci1987J 293(5)3l5 4.MinlzerDMetal'A口?InternMed1985} 102(2);203 5.MastersDLetaiIJInfedDis1984}149 C5):824 6.CarlisleJTIlbld1988;150(1)2244 7.Hoi』irkGEetnllAmIMedTech1984 1.1:297 8.Wac.fIctal:^m】TropMed198{7 (1):174 9.AdairJCet}JC】jnM~crebiol1987,25 (11):12l4 10.FiaegoldSetai:BaileyandScoffsDiagnos— fieMicrobiologyed6McsbzCo1982 I1.CarryArchInternMed19802140~8I8 l2.MishmSAetallJClinM;crobiol1980;1I 佰):728 18.SinEhMetalI工b谴1987;25(1):176 14.MalayPRetaiIIbid1987;25(10);2010 15.MurrayPR"也lbld1088~拍(6):I219 16.ButterWRetallIbid1087,25(11):2126 l7.Ba~terWR"etaiIibid1986J25(1):182 18.Ada1115HRetalIAmJMedsciI4}287 (1):8 19,PeiefsenEAeta【iJAMA1003;250{7): 730 20.Joasso6SJcalIA[flRevRespirDis19061 1?(5):932 z1.WnaRJetal,JInfectDis19871IS6 (6):957 22.GombertMEeta】tAnth?ic?bAgen~ Chemother1987}81:2013 23.BrooksJJeta【IJClinMierobioi1087~25 t2):445 24.K8bBEetalIlAmAcadDermatol1985~ I3(1):125