军团菌检验方法实施细则

军团菌检验方法 1 适用范围: 本细则适用于各类样品中军团菌的检测鉴定。 2 检测依据: 国家《传染病诊断》WS195-2001 军团病诊断标准及处理原则 军团病诊断标准及处理原则，卫生部，2002年 上海市卫生防疫站1979;卫生防疫细菌检验，第一版，上海科技出版社 3 设备与材料 3.1 冰箱: 4,-20?。 3.2 恒温培养箱: 36?1?。 3.3 振荡器 3.4 显微镜 40x 100x 3.5 离心机 12000rpm 3.6 架盘药物天平: 0 g -500g, 精度0.5g。 3.7 锥形瓶: 100 mL、500 mL。 3.8 灭菌吸管: 1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。 3.9 灭菌平皿: 直径90 mm。 3.10 灭菌试管: 16 mm×160 mm.。一般用的是18*180mm 3.11 温水浴箱 :36?1? 3.12 二氧化碳培养箱:5%CO36?1? 2 3.13 紫外灯 3.14 过滤器 4 培养基和试剂 4.1 BCYEα琼脂 成份: N-2-乙酰胺基-2-氨基乙烷磺酸(ACES) 10.00 克 氢氧化钾片(85%KOH 试剂级) 2.80 克 活性炭(Norit A) 1.50 克 酵母浸膏(Difco) 10.00 克 琼脂(Difco) 17.00 克 α-酮戊二酸(单钾盐) 1.00 克 L-半胱氨酸盐酸盐(溶于10毫升蒸馏水中) 0.40 克 焦磷酸铁(溶于10毫升蒸馏水中) 0.25 克 蒸馏水 1000 毫升 4.2 甘氨酸、万古霉素、多粘菌素B(GVP)琼脂 成份: 除上述每升BCYEα琼脂成份外，再加: 甘氨酸 3.00 克 万古霉素 5.00 毫克 多粘菌素B 10 万单位 1 4.3 明胶酶试验培养基: 此培养基的制备，除用明胶(每100ml中加3g)代替琼脂外，其它同BCYEα培养基。 4.4 酪氨酸BCYEα培养基: 在BCYEα琼脂中除去碳粉，再于每升培养基中加0.45g酪氨酸。试验时划种平板，于37?培养5天观察结果。 4.5 血平板 4.6 无半胱氨酸BCYEα平板 4.7 1%新配制的四甲基对苯二胺水溶液 4.8 3%新配制的过氧化氢液 4.9 1%马尿酸钠水溶液 5.0 3.5%茚三酮 5.1 0.2%亚甲兰水溶液 5.2 10%中性福马林液 5.3 96孔U型(8×12)微孔板和微量移液器(8道及单道) 5.4 0.01mol/L pH2.0的盐酸 5.5 0.3mol/l KOH 5.6 革兰氏染色液 5.7 军团菌成套诊断血清 5 检验程序(军团菌检验程序) , 临床含杂菌的标本: 痰、肺或其它组织(均用少量蒸馏水调匀或机械研磨成均匀的悬液)和气管灌洗液等标本 直接免疫荧光法镜检 酸处理或放50?30min 必要时放,70?保存 划种GVPC琼脂平板(36?，5%CO7—14天) 2 , 血液标本: 取5ml血液接种BCYEα双相培养基(36?，分离血清作血清学诊 5%CO7,14天)每日将液基 2断(用间接荧光法或微量 覆盖斜面一次，如斜面出现生长痕迹划 凝集试验) 种BCYEα平板(36?、5% CO7,14天),挑选可2 疑菌落作鉴定。 2 , 水样类标本: 水样(0.5L,5L水的离心沉淀物或经过滤后的0.22μm孔径滤膜) 或水龙头等处的棉拭子洗液 酸处理或50?30min，取0.1ml 划种至琼脂平板36?、5% CO7,14直接免疫荧光法镜检2 天培养后，挑选可疑菌落作鉴定。 , 菌种初步鉴定: BCYEα琼脂平板上的可疑菌落 接种无半胱氨酸的BCYEα琼脂平板 36?，5%CO3,7天) 2 生长 不生长 (从原始平板做革兰氏片染色镜检) 第2天生长 第3天后生长 出单个菌落 的革兰氏阴性杆菌 阴性杆菌 阳性杆菌或阴性球菌 不是军团菌 接种血琼脂平板 可能是军团菌 不是军团菌 不生长 生长 可能是橡树岭军团菌 不是军团菌 菌种做进一步鉴定 6操作步骤 6.1 样品处理 6.2 病人培养标本 加热处理:将标本放50?水浴30min，可杀灭大部分杂菌而不影响军团菌的存活。 6.3 环境标本(水样) 加酸处理:采集500ml水样，经0.22μm孔径的滤膜抽滤后，将滤膜剪碎，放置于5ml原水 3 样中混匀，取1ml混匀或研匀的标本，加于试管中，并于其中加1ml0.01mol/L pH2.0的盐酸，充分混匀。然后于室温中作用5,15min，再于其中加0.03mol/l KOH若干以中和酸的作用。取0.2ml处理水样培养。 6.4 血清学试验标本 于发病时和两周后采血，测定军团菌抗体效价，每次采血2毫升(不加抗凝剂)并分离血清。单次采血可在发病一两周后。 6.5 培养分离军团菌 无菌的标本材料如胸水，可以在离心沉淀后划种BCYEα琼脂平板，而污染的材料则应先划种GVPC琼脂平板，划种时应先在原始区浓厚接种，然后再分离单个菌落。将平板放36? 5%CO培养箱(或烛缸)培养。每日观察结果。 2 6.6 生化鉴定 6.6.1 氧化酶试验 采用平板法或滤纸法，即将1%新配制的四甲基对苯二胺水溶液直接滴在BCYEα琼脂平板上新生长出的菌苔和菌落上，30秒内出现明显深紫色时为阳性，或直接挑取新鲜菌落揉擦在清洁的白色泸纸上，再滴加试剂于其上，30秒内出现深紫色为阳性。 6.6.2 触酶试验 准备一管新培养的BCYEα斜面培养物，于其中滴加3%过氧化氢液，立即出现大量气泡者为阳性。也可用铂丝、小玻棒等挑取少量新鲜生长的菌落或菌苔，研均于盛有少量3%过氧化氢液的清洁试管内，立即出现大量气泡者为阳性。 6.6.3动力试验 用军团菌营养肉汤的新鲜培养物做悬滴法。观察时注意与布朗氏运动区别。 测定菌落荧光:将被试菌接种酪氨酸BYE琼脂平板，待生长出单个菌落后，在黑暗处以长波(365mμm)紫外线照射下，观察菌落发出的荧光。 6.6.4 棕色色素产生试验 将被试菌划种酪氨酸BYE琼脂平板，待生长出单个菌落后(36?培养7天)，观察菌落和菌苔，出现棕色时为阳性。 6.6.5 马尿酸水解试验 将一满环(环直径3mm)BCYEα琼脂斜面的生长物，接种于马尿酸盐管(内含1%马尿酸钠水溶液0.4ml)中，使成均匀混浊菌悬液，放36?水浴18,20小时，再于其中加入0.2ml茚三酮试剂液(将3.5%比例的茚三酮溶解于按1?1混合的丙酮与正丁醇中，新鲜使用或黑暗中保存短时间)，放36?水浴10min，取出后在20min未接种的马尿酸盐管作空白对照，同样的条件下，嗜肺军团菌通常于5,15min形成兰色(阳性)，而一般其它军团菌则于15min后完全无颜色改变。 6.6.6 BCP试验 将 0.05%溴甲酚紫水溶液1滴，加在一滤纸处，再于BCYEα琼脂上新生长的菌落或菌苔，以接种环取较大量揉擦于滴过试剂的滤纸处，如在1min内出现绿兰色，则此试验为阳性;黄色或暗绿色为阴性。 6.6.7 测定β内酰胺酶产生试验 有多种方法。有条件时建议采用硝化先锋霉素(Nitrocefin)纸片法，阳性时纸片由淡黄色变为深红色。一般均认为此法是最灵敏、准确和方便的方法。 6.6.8 明胶水解试验 将待试菌穿刺接种于明胶酶试验培养基管，放22?培养至少14天，如出现液化时为阳性。 6.7 血清学分型鉴定 4 军团菌血清分型鉴定时采用玻片凝集法，可参照标准分型表判定结果。如符合以上结果， 可按上表报告检出某种军团菌。 表1 军团菌科各常见种的表型试验鉴定特征 在各种琼脂上生长 马β血菌BC明氧尿棕内缺半清触动落P胶血菌株名 化酸色酰BCY胱氨型酶 力 荧斑液平酶 水素 胺Eα 酸数 光 点 化 板 解 酶 BCYE 嗜肺军团菌 15 + - - +/- +/- + - + - + + + 米克戴德军团菌 1 + - - +/- + + - - + - - - 博杰曼军团菌 蓝白 2 + - - - + + - - + +/- + 杜莫夫军团菌 蓝白 1 + - - - +/- + - - + + + 长滩军团菌 2 + - - +/- + + - - - + +/- + 约旦军团菌 1 + - - + + + - - - + + + 高尔曼军团菌 蓝白 1 + - - - +/- + - - + + + 菲利军团菌 2 + - - - + + - +/- - +/- - +/- 阿尼沙军团菌 蓝白 1 + - - + +/- + - - + + + 詹姆斯敦军团菌 1 + - - - + + - - - + + + 红光军团菌 红 1 + - - - + + - - + + + 橡树岭军团菌 1 + -/+ - - + - - - - + +/- + ，,阳性 ,,阴性 ，,,,可阴可阳 6.8 基因检测 以全军团菌属5s rRNA和嗜肺军团菌mip基因的特异序列作为引物，扩增片段大小分 别为104bp和440bp。 核酸的提取及扩增 (1)已知菌核酸提取:取灭菌双蒸水0.5ml于离心管中，挑取菌苔少许放入该离心管中 振荡混匀，放置于裂解仪中100?裂解10min，取出放入-20?速冻，15min后， 12，000rpm， 4?，离心5min，取上清液，按试剂盒提供的方法操作。 (2)水样中核酸提取(第二批预处理水样):取水样混悬液1ml于离心管中，10，000rpm， 离心5min，取上清液，按试剂盒提供的方法操作。 (3)扩增条件 预变性94? 5min;94? 35sec、55? 35sec、72? 75sec循环35次; 最后72? 延伸3min。 PCR结果判定 取10μl扩增产物，经2%琼脂糖凝胶电泳，100v，电泳20,30min，观测 结果。 7报告结果 7.1报告阳性结果 检出军团菌 7.2报告阴性结果 未检出军团菌 5 浙江省军团菌病监测 1976年美国宾夕法尼亚州费城，一起流行性爆发性肺炎使人们陷入极度恐慌中，共221人感染，死亡34例。由于患者主要是退伍军人，故称此病为军团菌病。次年找到病原体，并命名为军团菌。以后经过不断研究发现，此菌广泛分布于自然界，特别是水中。军团菌有34个种59个血清型，其中嗜肺军团菌(Legionella pneumophila，Lp)有14个血清型，是引起人类军团病的主要病原菌。军团菌感染可引起上呼吸道感染样症状、持续发热及其他系统的改变(临床症状体征并非特异。军团菌感染主要以肺部炎症为特征。轻者称庞地亚克热(pontiac fever)，重者表现以肺部感染为主的全身多脏器损害，即军团菌病。军团菌肺炎容易导致呼吸衰竭、横纹肌溶解和肾功能衰竭，15%军团菌肺炎可引起出现肾功能衰竭，其中有50%病人最终死于肾功能衰竭。 近年来，国外有过多起有关军团菌肺炎疫情爆发的报道，2004年Chrysochou C报道了一起军团菌肺炎爆发。2000年发生比利时一起军团菌肺炎爆发疫情，该起疫情为旅行团中93例发生军团菌肺炎的，引起了当地政府的高度重视。1996年法国也发生了一起旅行团中爆发军团菌肺炎。我国在1981年发现首例病人，随后又在肺炎病人痰和空调系统冷却塔水中分离出军团菌。血清流行病学证实，我国南京、广州、天津，等地均有军团菌感染。不仅如此，据国内外报道在家禽家畜中也广泛存在军团菌感染，目前已在多种动物体内发现军 6 团菌，发生感染并引起疾病。 军团菌引起肺炎症状，在临床上容易与SARS、禽流感和其他不明原因发热和肺炎相混淆。而且军团菌由于缺乏典型的临床体征以及治疗的特殊性，其实验室确诊显得尤为重要。但军团菌人工培养条件的苛刻及其生长代谢的缓慢导致临床与环境标本检出率低下，从而造成事实上的假阴性漏检，而且目前大多数医院都没有开展军团菌检测的条件和技术，对军团菌的预防和治疗十分不利。因此通过监测，并运用PCR的高灵敏度、强特异度和快速报告等特点，可以及时发现病人，提供鉴别诊断，为预防和控制军团菌感染的爆发和流行提供科学依据。 一、目标 开展军团菌病的监测，了解军团菌感染的本底水平，及时发现隐患，预防和控制军团菌病的暴发与流行。 二、监测内容与方法 (一)监测对象: 军团菌病监测病例的定义:临床诊断为肺炎的住院病例，排除已有明确其他病原学诊断的肺炎病例均作为监测对象。 (二)监测时间 监测时间为每年的5-11月份。 (三)监测地点: 分别在宁波市、嘉兴市两地，选择具有代表性的综合性医院作为监测点医院。 7 (四)监测内容: 监测单位选择呼吸内科病房作为监测点，统计各类肺炎和不明原因发热病人，并填写肺炎和不明原因发热病人登记表。按照军团菌病监测病例的定义，对符合军团菌病监测病例的对象，填写监测病例个案调查表。监测单位每月将上月肺炎或病例登记表和军团菌病监测病例个案调查表上报省疾病预防控制中心，每月不少于10例。 (五)标本的采集和运送 1. 血液标本:双份血清，第一份血液标本于病人入院时采集2-3ml血液分离血清作血清学诊断;第二份血液于病人出院时采集2-3ml。血清于-20?冰箱保存。 2. 支气管肺泡灌洗液、胸水、痰液或纤支气管镜标本:取标本后立即送检，如标本放置30min以上时，应将标本放4?冰箱，如放置24-48小时，则应放-20?以下保存。应避免反复冻融。 3. 大型医院、宾馆等冷却水样:采集水样500ml/份，取样后立即送检。如标本需放置30min以上时，应放于4?保存。24小时内检测。 三. 各有关单位的职责与分工 (一)省疾病预防控制中心: 1. 组织省内地区(市)级疾病预防控制机构开展军团菌病监测工作，负责进行军团菌监测技术指导、质控、和考评; 2. 负责标本的收集和检测。检测结果及时反馈至有关监测医院; 3. 负责监测资料的收集汇总，并进行分析; 8 4. 组织开展军团菌病爆发疫情调查。 (三)宁波市、嘉兴市疾病预防控制中心: 1. 负责辖区内监测医院标本采集和上送。 2. 指导开展监测医院军团菌病的监测工作; 3. 负责监测资料的收集汇总。 (六)监测医院 1. 负责呼吸内科门诊及病房各类肺炎和不明原因发热病人的统计汇总;负责填写军团菌监测病例个案调查表; 2. 负责标本采集，将标本妥善保存并上送; 3. 将实验室检测结果反馈给病人或负责治疗该病人的医生。 四. 考核与评估 每年组织对各监测点医院进行督导检查，保证监测工作的落实。考核内容包括:上报的及时性、标本采集的质量和数量及上送的及时性等。 附件:1. 军团菌肺炎监测病例登记表 2. 军团菌肺炎监测病例个案调查表 3. 军团菌检测方法实施细则 9 军团菌肺炎监测病例登记表 监测点:___________________ 月份:__________ 编号 姓名 性别 年龄 住址 联系电话 调查日期 10 军团菌肺炎监测病例个案调查表 编号:???????? 1(一般情况: 1.1姓名: 1.3性别: ?男 ?女 ? 1.4年龄(岁): ?? 1.5职业: ?? ?幼托或散居儿童 ?学 生 ?教 师 ?医院工作人员 ?保育保姆 ?餐 饮 业 ?商业服务 ?工 人 ?民 工 ?农 民 ?干部职员 ?离退人员 ?家务待业 ?其 他 1.6现居住地(详填): 省 市 县(区) 乡(街道) 村 1.6.1联系电话 1.7工作(学习)单位: 2(发病与就诊情况 2.1 发病情况 2.1.1 发病时间: 年 月 日 ???????? 2.1.2 首发症状(描述): 2.2 发病地点: 省 市 县(区) 医院(学校/旅馆/其他) 2.3 初诊时间: 年 月 日 ???????? 2.4 确诊时间: 年 月 日 ???????? 2.5 入院情况 2.4.1入院日期: 年 月 日 ???????? 2.4.2所住医院名称: 2.4.3入院诊断: 2.6 出院情况 2.6.1 出院日期: 年 月 日 ???????? 2.6.2 出院诊断: 3.流行病学史调查: 3.1 请详细描述发病前二周内特殊活动情况(如到医院、去工地、旅游、聚会、野外活动等). 3.2 发病前2周内是否接触过不明原因发热或肺炎患者:?是 ?否 ? 3.2.1 如3.2选“是”，则接触地点: 3.2.2 如3.2选“是”，则与患者关系是: ?家庭成员 ?同事/同学 ?同住旅馆/医院 ?社会交往 ?其他 4.临床表现: 4.1发热 ?有 ?无 ? 4.1.1体温(最高) ? 11 4.2咳嗽 ?有 ?无 ? 4.2.1 咳痰 ?有 ?无 ? 4.3上呼吸道卡他症状 ?有 ?无 ? 4.4胸闷 ?有 ?无 ? 4.5呼吸困难 ?有 ?无 ? 4.6腹泻 ?有 ?无 ? 4.7 中枢神经系统症状 ?有 ?无 ? 4.8基础疾病:?糖尿病 ?高血压 ?心脏病 ?肾病 ?其他 ? 5.临床及实验室检查: 5.1 血常规 9入院时:白细胞计数: ×10/L 中性粒细胞: % 淋巴细胞计数: % 5.2胸部,线检查 入院时:日期: 年 月 日 结果: ?正常 ?渗出液 ? 其他 5.3军团菌血清学检测结果: ?阴性 ?阳性 ?未检测 5.4 军团菌PCR检测结果:?阴性 ?阳性 ?未检测 5.5 军团菌病原分离结果:?阴性 ?阳性 ?未检测 6. 转归与最终诊断情况(随访或根据医疗报告完成): 6.1最后诊断:?军团菌肺炎 ?其他 6.2转归: ?痊愈 ?死亡 ? 若病例死亡,则填写6.2.1 6.2.1病例死亡时间 年 月 日 ???????? 监测医院: 调查者签名: 调查时间: 年 月 日 12 13