a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用实验方案

a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用实验 实验:α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用 背景资料 一、酶 酶(enzyme)催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。 1(高效性:酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快; 2(专一性:一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽;因此在食用酵素当今在功能上，主要有四种:高浓缩SOD酵素如复方天然酵素主要用于乳腺瘤、子宫肌瘤、卵巢囊肿等肿瘤方面;长生酵素直接补脾补肾补气血，全面调理;纤体酵素专门转化脂肪减肥;肠毒清酵素则专门清理肠皱褶的毒素。 3(多样性:酶的种类很多，大约有5000多种，其中可以通过食用补充的酵素达2000多种;形态上主要有三种:专业级酵素为酵素胶囊，其次为酵素粉，而液体酵素含量低、效价低、易腐败而安全性较差一些，食用风险较高。 4(温和性:是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的，因此，纯正酵素是中性的，温和的，不存在副作用，或“好转反应”。对于有刺激性而必然存的“好转反应”，除了本身腐败以外，也有可能有药品的添加。 5(活性可调节性:包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。 6.易变性:大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏; 7.有些酶的催化性与辅助因子有关。 酶与无机催化剂的比较 酶 无机催化剂 1)改变化学反应速率，本身几乎不被消耗; 相同点 2)只催化已存在的化学反应; 3)加快化学反应速率，缩短达到平衡时间，但不改变平衡点; 4)降低活化能，使化学反应速率加快。 5)都会出现中毒现象。 1)酶具有高效性，催化效率比一般催化剂高出107-1013; 不同点 2)具有高度专一性，只对特定的一种或一类底物起作用; 3)更易受环境因素和生物体生理条件的影响，酶是蛋白质和核酸组成，易 变性失活，所以酶在反应时不断产生和分解; 4)酶的催化活性是被调节控制的、有序进行的; 5)条件温和:常温常压，pH接近中性。 但酶易受环境影响而失活，包括温度、PH值等，例如一般来说动物体内的酶最适温度在35到40?之间，植物体内的酶最适温度在40-50?之间;细菌和真菌体内的酶最适温度差别较大，有的酶最适温度可高达70?。动物体内的酶最适PH大多在6.5-8.0之间，但也有例外，如胃蛋白酶的最适PH为1.8，植物体内的酶最适PH大多在4.5-6.5之间。 另外，反应中反应产物和酶的分工和回收困难等缺点限制了酶在工业上的广泛应用。 二、固定化酶及其应用 固定化酶(immobilized enzyme)，就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。酶本身还是溶于水的，只是是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。 固定化酶的形式多样，可制成机械性能好的颗粒装成酶柱用于连续生产;或在反应器中进行批式搅拌反应;也可制成酶膜、酶管等应用于化学;又可制成微胶囊酶，作为治疗酶应用于临床。现在又有人用酶膜(包括细胞、组织、微生物制成的膜)与电、光、热等敏感的元件组成一种装置称生物传感器，用于测定有机化合物和发酵自动控制中信息的传递及环境保护中有害物质的检测。最常用的是酶膜与离子选择电极组成的生物传感器，例如脲传感器是由固定化脲酶、固定化硝化菌及氧电极组成，脲经脲酶分解成氨及二氧化碳，氨又继续被硝化菌氧化，总耗氧量则通过氧电极反映出电流的变化，用以计算脲的含量。 1、天然酶的缺点 (1)天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活 (2)溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本 (3)反应后，酶会混在产物中，影响产品质量，难以在工业生产中广泛应用 2、固定化酶的优缺点 优点 缺点 ?极易将固定化酶与底物、产物? 固定化时，酶活力有损失; 分开; ? 增加了生产的成本，工厂初始投 ?可以再较长时间内进行反复分资大; 固定化酶 批反应和装柱连续反应; ? 只能用于可溶性底物，而且较适 ?在大多数情况下，能够提高酶用于小分子底物，对大分子底物 的稳定性; 不适宜; ?酶反应过程能够加以严格控制? 与完整菌体相比不适宜于多酶反 ?产物溶液中没有酶的残留，简应，特别是需要辅助因子的反应; 化了提纯工艺; ?胞内酶必须经过酶的分离程序。 ?较游离酶更适合于多酶反应; ?可以增加产物的收率; ?酶的使用效率提高，成本降低。 三、酶的固定法 1、吸附法 物理吸附法:将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂有机载体如纤维素， 无机载体如活性碳、多孔玻璃等(酶与载体形成范德华力)备注:范德华力也叫分子间力。分子型物质能由气态转变为液态，由液态转变为固态，这说明分子间存在着相互作用力，这种作用力称为分子间力或范德华力。分子间力有三种来源，即色散力、诱导力和取向力。色散力是分子的瞬时偶极间的作用力，它的大小与分子的变形性等因素有关。一般分子量愈大，分子内所含的电子数愈多，分子的变形性愈大，色散力亦愈大。诱导力是分子的固有偶极与诱导偶极间的作用力，它的大小与分子的极性和变形性等有关。取向力是分子的固有偶极间的作用力，它的大小与分子的极性和温度有关。极性分子的偶极矩愈大，取向力愈大;温度愈高，取向力愈小。 离子交换法:利用蛋白质的两性性质，使其带有电荷的基团，与离子交换及形成离子键，而被交换结合到交换剂上) 2、包埋法(将酶包埋在多孔载体中，包埋成格子型或微胶囊性，常用载体:聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素、海藻酸钠凝胶) 包埋法的原理是将酶截流在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中。通过聚合作用或者离子网络形成，或通过沉淀作用，或改变溶剂、温度、pH值使细胞截流。凝胶聚合物的网络可以阻止酶的泄漏，同时能让基质渗入和产物扩散出来。 3、载体结合法 最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括:氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。 4、交联法:是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。其中使用最广泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生反应，从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶。但是交联法中酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。 (后附酶的固定法详细介绍) 四种方法的比较 实验目的 1(能够制备固定化的α-淀粉酶 2(能够说出固定化的α-淀粉酶水解淀粉的测定的原理并且会独立操作此过程 实验原理 一、选择石英砂做吸附剂原因 1.石英砂本来是不带电的，其上之所以有电荷是因为:石英砂表面的硅原子水合后产生硅烷醇基团SiOH,硅烷醇基团可以通过摄入水体中的H+和OH-而带电: SiOH+H+ ? SiOH2+ +H2O ? SiOH+OH- SiO-+ HO ? 2? 当石英砂表面为SiOH2+，蛋白质在大于其等电点时，其带负电荷，被石英砂表面的正电荷吸附;但石英砂表面为SiO-时，溶液中的Ca离子就会起到桥联作用，在溶液中Ca离子存在以下平衡: 2+-+Ca+OH Ca(OH) + Ca(OH)Ca(OH) 2 Ca(OH)+在吸附过程中起着至关重要的作用，它的多少决定了石英砂表面的负电荷的转化率的多少，也就决定了石英砂对蛋白质的吸附率的高低。当pH的值为11.00左右时，虽然石英砂表面的负电荷的转化率较低，但是溶液中负电荷大大增加，导致石英砂表面上的负电荷密度增加，这成为主导因素，会使Ca离子的平衡向左移动，Ca(OH)+也适当增加，石英砂表面的负电荷的转化率增高，表面逐渐带正电荷，蛋白质在大于其等电点时带负电荷，石英砂从而起到吸附蛋白质的作用。 2.石英砂外观呈多棱形、球状，，具有机械强度高、截污能力强、耐酸性能好等特点。石英砂滤料起到过滤作用，就像水经过砂石渗透到地下一样，将水中的那些悬浮的物阻拦下来，主要针对那些细微的悬浮物。 3.利用石英砂的理化性质，它不会破坏蛋白质的结构，即不会破坏酶的活性。. 二、淀粉酶 淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α,1，4-葡聚糖，水解α,1，4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为α-淀粉酶(EC3(2(1(1()与β-淀粉酶(EC3(2(1(2()。(1)α-淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α,1，4-链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50,，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70,分解限度的(最终游离出葡萄糖); (2)β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α,1，4-葡聚糖链。主要见于高等植物中(大麦、小麦、甘薯、大豆等)，但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α,1，6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。从上述的α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用方式，分别提出α,1，4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶(α,1，4,glucan 4-glucanohydrolase)和 α,1， 4-葡聚糖-麦芽糖水解酶(α-1，4,glucan maltohydrolase)的名称等而被使用。 α-淀粉酶 α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖苷酶)多是胞外酶，其作用于淀粉时可从分子内部随机地切开淀粉链的α-1，4糖苷键，而生成糊精和还原糖，产物的末端残基碳原子构型为α-构型，故称α-淀粉酶。 1、性质和特征 1.1底物特异性 α-淀粉酶和其它酶类一样，具有反应底物特异性，不同来源的淀粉酶反应底物也各不相同，通常α-淀粉酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性，这些淀粉及衍生物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等。 1.2最适 pH和最适温度 反应温度和pH对酶活力影响较大，不同来源的α-淀粉酶有各自的最适作用pH和最适作用温度，通常在最适作用pH和最适作用温度条件下酶相对比较稳定，在此条件下进行反应能最大程度地发挥酶活力，提高酶反应效率。因此，在工业应用中应了解不同的酶最适pH和最适温度，确定反应的最佳条件，最大限度地提高酶的使用效率是很重要的。 通常情况下α-淀粉酶的最适作用pH一般在2到12之间变化。真菌和细菌类α-淀粉酶的最适pH在酸性和中性范围内，如芽孢杆菌α-淀粉酶的最适pH为3，碱性α-淀粉酶的最适pH在9,12。另外，温度和钙离子对一些α-淀粉酶的最适pH有一定的影响，会改变其最适作用范围。不同微生物来源的仅一淀粉酶的最适作用温度存在着较大差异，其中最适作用温度最低的只有25?,30?，而最高的能达到100?,130?。另外，钙离子和钠离子对一些酶的最适作用温度也有一定的影响[12]。 1.3金属离子 α-淀粉酶是金属酶，很多金属离子，特别是重金属离子对其有抑制作用;另外，巯基，N-溴琥珀酸亚胺，p-羟基汞苯甲酸，碘乙酸，BSA，EDTA和EGTA等 对 仅一淀粉酶也有抑制作用。 α-淀粉酶中至少包含一个Ca2+，Ca2+使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性。Ca2+对仅一淀粉酶的亲和能力比其它离子强，其结合钙的数量在1到10之间。结晶高峰淀粉酶A(TAA)包含10个Ca2+，但只有一个结合很牢固。通常情况下结合一个Ca2+就足以使α-淀粉酶很稳定。用EDTA透析或者用电渗析可以将Ca2+从淀粉酶中除去，加入Ca2+可以激活钙游离酶。用Sr2+和Mg2+代替TAA中的Ca2+，在Sr2+和Mg2+过量的情况下也能使其结晶。加入Sr2+、Mg2+和Ba2+离子可以激活用EDTA失活的TAA。通常情况下，有Ca2+存在淀粉酶的稳定性比没有时要好，但也有报道α-淀粉酶在Ca2+存在时会失活，而经EDTA处理后却保留活性，另外，有报道称Ca2+对仅一淀粉酶没有影响。 1.4电场强度 实验结果表明，不同强度电场导致酶活性增加的效应不同，并且呈非单调性变化。我们认为，不同强度电场对酶蛋白分子的构象产生了不同影响，处理酶所用的电场能量虽然不足以改变 酶蛋白氨基酸序列，但可以改变酶蛋白的构象(姚占全等[13]用不同强度电场处理α-淀粉酶5min，处理后分别在第1天与第1O天测定电场对α-淀粉酶活性的影响。第1天测定结果表明，电场对酶产生明显影响，而且不同强度电场对α-淀粉酶活性的影响程度不同，在0.5,6.0kV,cm范围内，酶活性随场强增加呈非单调性变化，与对照组相比，变化幅度在5.5%,26.2%之间。第1O天测定，酶活性变化幅度在0.2,,16.3%之间，表明电场对酶产生的影响经过一定时间后趋于消失。 2、在本次实验中的作用 α-淀粉酶只将淀粉水解为糊精 ，淀粉溶液加入KI-I2指示溶液时显现蓝色，而转变成糊精后显现红色。 原理:淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200,980或相对分子质量范围是32 000,160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20,28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。 麦糖化淀粉 β-淀粉酶 葡α-淀粉酶 淀糊芽酶 萄粉 精 糖 糖 遇碘显蓝色 遇碘显红色 遇碘不显色 将吸附有α-淀粉酶的石英砂装柱，使淀粉溶液流过柱，若柱的流出液在加入KI-I2溶液时可看到溶液呈现红色，表明水解产物中有糊精。 α-淀粉酶制成不溶性的固定化酶后，酶的稳定性增加 ，包括酶对热的稳定性，对蛋白酶的抵抗能力、对各种试剂的稳定性都不同程度地增加。由于稳定性增加，保存期也相应延长，数日内酶活力不减。 低温保存酶的原理:酶都有一个共性，高温会使其失去活性，因为酶本质上大部分是蛋白质，低温4?能够抑制酶的活性但又不会使其失活，故能够保存酶，在使用时恢复其最适温度即可发挥酶的催化功能。 三、KI-I2溶液 1、配方 0.127g碘 0.83g碘化钾 100ml蒸馏水 2、配制 固态碘是非极性分子晶体，难溶于极性较强的水中，在25?时，1 升水中只能溶解0.3 克碘。实验室使用的碘水要求有比较大的浓度。为了得到浓度较大的碘水，可先向水中加入少量碘化钾晶体，然后再加入碘的晶体。这是由于在含有碘离子的溶液中，每个碘离子可以跟一个碘分子结合，生成三碘离子I3-。生成的I3-离子能够离解成碘和碘离子，溶液中有下列平衡存在: I-，I2 I3- 当反应需要碘时，上述平衡即向左方移动，使溶液内有碘供应，所以含有I-3 离子溶液的性质与含有I2 的溶液即碘水的性质相似。 注:将此液保存在棕色玻璃瓶内。 3、在本次实验中的作用 用稀释的碘-碘化钾溶液与淀粉作用时，形成碘化淀粉，呈蓝色的特殊反应，所以常用碘-碘化钾溶液鉴定淀粉。淀粉的水解物糊精遇碘变红。糖原遇碘变红褐色。糊粉粒是植物细胞中贮藏蛋白质的主要形式，当碘-碘化钾溶液与细胞中的蛋白质作用时，呈黄色反应，因此鉴定蛋白质常用的方法也是用碘-碘化钾溶液，但浓度较大效果才好。 四、淀粉 1、淀粉的相关特性及其分类 淀粉是葡萄糖的高聚体，在餐饮业又称芡粉，通式是(C6H10O5)n，水解到二糖阶段为麦芽糖，化学式是(C12H22O11)，完全水解后得到葡萄糖，化学式是(C6H12O6 )。淀粉有直链淀粉和支链淀粉两类。淀粉是植物体中贮存的养分，贮存在种子和块茎中，各类植物中的淀粉含量都较高。 淀粉有直链淀粉和支链淀粉两类。直链淀粉含几百个葡萄糖单元，支链淀粉含几千个葡萄糖单元。在天然淀粉中直链的占20%,26%，它是可溶性的，其余的则为支链淀粉。当用碘溶液进行检测时，直链淀粉液呈显蓝色，而支链淀粉与碘接触时则变为红棕色。(原因是:具有长螺旋段的直链淀粉可与长链的聚I3 , 形成复合物并产生蓝色。直链淀粉,碘复合物含有19%的碘。支链淀粉与碘复合生成微红,紫红色，这是因为支链淀粉的支链对于形成长链的聚I 3 , 而言是太短了。) 直链淀粉 α-淀粉酶作用于直链淀粉，在这里对直链淀粉做一个简单介绍。 直链淀粉是D-葡萄糖基以a-(1,4)糖苷键连接的多糖链，分子中有200个左右葡萄糖基，分子量1,2×105，聚合度990，空间构象卷曲成螺旋形，每一回转为6个葡萄糖基。 特性 1)直链淀粉具有抗润胀性，水溶性较差，不溶于脂肪; 2)直链淀粉不产生胰岛素抗性; 3)直链淀粉糊化温度较高，糯淀粉为73?，而直链淀粉为81.35?; 4)直链淀粉的成膜性和强度很好，粘附性和稳定性较支链淀粉差; 5)直链淀粉具有近似纤维的性能，用直链淀粉制成的薄膜，具有好的透明度、柔韧性、抗张强度和水不溶性，可应用于密封材料、包装材料和耐水耐压材料的生产。 含有直链淀粉的食物 食品类型 简介 因粘滞力、膨胀度、水分等不同，直链淀粉和支链淀粉有显著不同的膨化膨化食品 效果，直链淀粉有更强的抗拉伸力，成型性好，能够增加产品的脆性和强 力;支链淀粉在其中形成网状结构，有助于增大膨化体积，增强食品的松 脆性。要得到最大膨化体积，并非支链淀粉含量越高越好，而是一个合适 的直支比，两种成分有相互制约作用，有一个最佳的配比，实际加工中常 通过调节不同的直支比来得到不同的效果。 在保健食品方面，直链淀粉可作为低脂肪、低热量食物添加物，其水解产低脂食品 物可替代食品中的脂肪。美国的快餐业很发达，但由于这类食品的高油、 高脂性，许多人对此敬而远之，以高直链淀粉作为油脂、奶油的代替物解 决了这一问题，如在某些冰激凌中以直链淀粉代替大量奶油，在夹心饼干 中以直链淀粉代替油脂等，制成“低脂食品”。研究表明用高直链玉米淀粉作 为脂肪代替物制成的低脂食品，具有很好的流变学特性及稳定性，与全脂 奶油产品具有相同的口感，且生产过程只需原来的生产线，不需添加另外 的设备。 直链淀粉和支链淀粉(或不同直/支比的淀粉)作为食品添加剂的效果不同。食品添加剂 适宜直/支比的淀粉作为罐头、饮料、口服液等饮品的添加剂，溶液不分层， 固液相均稳定、不沉降、口感好;作为香肠、冰淇淋等的凝固剂，口感滑 嫩细腻;用于糕点、奶酪可使其松软可口;用作饴糖、口香糖以及化妆品 等的添加剂都较普通淀粉好。 制玉米粉丝必须选用直链淀粉含量高的玉米品种(如金皇后、马牙齿)，原玉米粉丝 因是直链淀粉在糊化冷却后，它的分子会重新结晶，从而使粉丝具有一定 的拉力，而支链淀粉含量相对高的品种，其淀粉湖化后，不会发生明显的 重结晶化，不能用来制粉丝。 五、关于本实验操作的基本原理 实验器材 实验步骤与方法 实验结果记录表 对实验的预期 思考题 附录: 酶的固定方法 吸附法 吸附法包括物理吸附法和离子交换吸附法。 ? 物理吸附法各种物理吸附法使用的载体，通常都有巨大的比表面，因而存在巨大的表面剩余能，能够吸附其它物质，其中包括酶。这种吸附作用选择性不强，吸附不牢。 常用于酶固定化的载体(吸附剂)有:无机载体，如活性氧化铝、活性炭、皂土、硅藻土、高岭土、多孔玻璃、硅胶等;有机载体，如:面筋、淀粉、纤维素、胶原、赛璐珞和火棉胶等。无机吸附剂的吸附容量一般很低，常小于l mg(蛋白),克(吸附剂)，少数有达17mg者，如氧化钛钦包被的不锈钢粒(直径100—200μm)，吸附β-半乳糖苷酶即是。有机吸附剂的吸附容量要高一些，常达数十毫克,克(吸附剂)、如火棉胶膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸酪酶等，可达70mg(蛋白)?cm-2(膜);每l克胶原膜，可吸附溶菌酶服酶、葡萄糖氧化酶50mg之多。国产微孔玻璃载体吸附葡萄糖淀粉酶，得到4,一8,的蛋白含量，是一种优良的载体。 无机吸附剂在固定化之后，常引起吸附变性，损失活力回收率。有人将糖化酶与阴离子表面活性剂反应后，再用活性炭吸附，酶活力高，且长期稳定。用多孔硅(CPGl00，孔径100nm)固定化α-淀粉酶和糖化酶时，添加钛盐所制备的固定化酶，其活力比用戊二醛交联法制备者高两倍。这说明无机吸附剂配合其它方法使用，可能更好。可惜这方面的规律性知识很少。 ? 离子交换吸附法 这是一种电性吸附。 常用的载体有:DEAE-纤维素、CM-纤维素、DEAE—葡聚糖凝胶，还有DEAE—纤维素、Amberlite IRA-93、纤维素-柠檬酸盐、IR—50、120、200、Dowex-50等。这类载体一般每克可吸收50-150mg蛋白。 中国科学院微生物所固定化酶组，用DEAE—Sephadex A-50吸附葡萄糖淀粉酶，固定化酶的表观活力为1400U?g-1, 天津工业微生物所，以强碱阴离子交换树脂290制备葡萄糖异构酶，固定化酶活力达9000-15000U?g-1, 活力回收率86,一92,，果糖转化率42,。 包埋法 将酶分子包埋于凝胶的网眼中或半透性的聚合物膜腔中，以达到固定化之目的的方法，即称包埋法; ? 格子型包埋法 常用的凝胶有聚丙烯酰胺凝胶、硅橡胶、卡拉胶，还有人用过大豆蛋白质、合成纤维。王厚行等先后报道用廉价的PVC(聚氯乙烯)包埋脲酶和乳酸脱氢酶，制备酶电极，效果优于聚丙烯酰胺包埋法。 以聚丙烯酰胺(PAG)包埋法为例，包埋酶的制备与PAGE凝胶制备类同。即将lml溶于适当缓冲溶液的酶液，加于3m1含750mg丙烯酰胺单体和40mg N，N’—甲叉双丙烯酰胺的溶液中，再加0.5ml 5,的二甲氨基丙氰和1,的过硫酸钾，作为加速剂和引发剂，混匀保温(23?)10min，即成含酶凝胶。此胶孔径1.0—4.0 nm，底物和产物可进出凝胶网眼，而酶分子不透出。FAG的包埋容量在10一100mg(蛋白)?g-1 (单体)之间。 ? 微囊型包埋法 本法是以超滤用的半透膜包裹含酶的液滴而成;它大多用于医疗。例如天冬酰胺酶，就可以做成囊型酶使用。 微囊包埋法按制作特征可分为界面聚合法、液体干燥法、分相法和液膜(脂质体)法四种。 ? 界面聚合法 是将疏水和亲水单体，在界面进行聚合，使酶包被其中而成。 具体方法:将酶的水溶液和亲水单体，用一种与水不混合的有机溶剂作成乳化液，再将溶于同一有机溶剂的疏水单体溶液，在搅拌下加入上述乳化液中。在乳化液中的水相和有机溶剂相之间的界面发生聚合反应，这样，水相中的酶即包被于聚合膜内。例如，将亲水单体乙二醇或多酚与疏水单体多异氰酸结合而成聚脲膜。用聚脲制备天冬酰胺酶、脲酶等微囊。 ? 液体干燥法 是将一种聚合材料溶于一种沸点低于水、且不与之混合的溶剂中，加入酶的水溶液，并用油溶性表面活性剂为乳化剂，制成乳化液。此为“水在油中”乳化液，把它分散于含有明胶(或丙烯醇)和表面活性剂的水溶液中，形成第二乳化液。在不断搅拌下，真空干燥，即成含酶微囊。常用的聚合材料为乙基纤维素、聚苯乙烯、氯橡胶等。常以苯、环己烷和氯仿为溶剂。 此法曾制备过氧化氢酶、脂肪酶等的乙基纤维素和聚苯乙烯微囊，微囊制备的酶几乎不失活。但很难完全除去残留的有机溶剂。囊的直径几十到几百微米，膜厚约25nm，大小可由聚合物浓度、乳化速度和保护性胶的选择任意调制。 ? 分相法又称界面凝聚法 是利用某些高聚物在水相和有机相界面上有极低溶解度，因而易形成皮膜将酶包被的方法。例如将含酶水溶液在含有硝酸纤维素的乙醚溶液中乳化分散，然后一边搅拌，一边滴加能和乙醚互溶但不能溶解硝酸纤维素的另一有机溶剂苯甲酸丁脂。这时乳化液滴周围的硝酸纤维素凝聚成膜囊，而将酶的水溶液包围其中。如以乙基纤维素为材料，则用四氯化碳溶解，而用石油醚使乳滴凝聚成囊。 ? 液膜法或称脂质体(Liposome)法 是由磷脂分散于酶水溶液而形成脂质囊包埋酶液的方法。此法的最大特征是底物和,或产物穿过液膜时，与膜的孔径无关，而与其对膜组分的溶解度有关。因此，其用途将有新的发展。 载体偶联法(共价法) 此法是将酶分子的必需基团经共价键与载体结合的方法。就蛋白而言，可供反应的非必需侧链基团有一NH2、一OH、一COOH、一SH2、酚环、咪唑基、吲哚基。就载体而言，常用的载体，有多羟基聚合物如纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖等;多胺基聚合物，如聚丙烯酰胺凝胶、多聚氨基酸。还有一些其他的载体如聚苯乙烯、尼龙、多孔玻璃等。这些载体的功能基团有:芳香氨基、羟基、羧基、羧甲基和氨基等。 酶分子侧链与载体功能基之间，往往不能直接反应，因而反应前必须事先将载体功能基团加以活化，然后与酶分子反应而固定化。活化和偶联反应多种多样，这里择要介绍几种。 重氮化法 这是一类应用较广的方法，适用于多糖类的芳香族氨基衍生物、氨基酸共聚物、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、乙烯二马来酸共聚物和多孔玻璃等载体。载体先用亚硝酸处理，生成重氮盐衍生物，然后在温和条件下与酶分子的酚基、咪唑基或氨基反应而成键。 2(2(4交联法 利用双功能或多功能试剂，使酶分子之间或酶蛋白与其它惰性蛋白之间发生交联，凝集成网状结构，而成固定化酶，此即交联法。双功能和多功能试剂，功能基团相同的，例如戊二醛、二重氮联苯胺,2，2’—二磺酸等为“同型”双(多)功能试剂。功能基团不相同者如1，5—二氟—2，4—二硝基苯等，为“杂型”双(多)功能试剂。戊二醛是应用最广的双功能试剂，它与酶的游离氨基反应，形成Schiff碱而使酶分子交联: 交联法单用时，所得到的固定化酶，颗粒小、机械性能差、酶活性低，故常与吸附法或包埋法联合使用。例如使用明胶(蛋白质)包埋，再用戊二醛交联，或先用尼龙(聚酰胺类)膜或炭等吸附后，再交联。 例如，武汉生物制品研究所生化室，用氨基乙基纤维素和戊二醛结合法，制备固定化胰蛋白酶及胃蛋白酶。 交联法是利用双功能试剂使酶分子之间或酶分子与载体之间发生交联反应, 制成具有网状结 构的固定化酶的方法。 最常用的双功能试剂是戊二醛, 戊二醛有; 两个醛基, 这两个全集醛基都可以与酶蛋白分子上的游离氨基发生反应,戊二醛本身起到分子间桥作用。 反应式如: OHC,(CH2)3,CHO，n[E]= ,CH=N,E,,,CH,,, 利用戊二醛作交联剂进行酶固定化具有以下特点: A 戊二醛与蛋白质的反应迅述, 一般在1小时内即克完成反应。 B 反应受基质的离子强度有关, 反应的pH范围较广, 能在pH5-9进行。 C 交联反应, 是不可逆的。酶固定化载体的再生比较困难。 D 在利用戊二醛进行交联反应时, 不仅有分子间交联反应, 而且同时发生分子内交联反应, 在酶固定化后, 对酶分子的稳定性有较大的改善, 但由于发生供价反应, 在固定化后有部分酶蛋白失活。 吸附交联法 吸附交联法所用的载体与吸附法的载体基本一致，从交联反应原理不难理解, 戊二醛的醛基与酶蛋白的游离氨基发生反应, 因此, 对于大部分载体来说, 在固定化反映时, 反应体系中, 主要是酶分子内或分子间的交联反应, 酶蛋白与载体之间的反应较少;所以目前用的最多的是吸附交联反应, 即将吸附和交联反应结合起来, 首先将酶蛋白吸附到载体上, 然后再加入交联剂戊二醛, 使酶蛋白分子形成网格结构, 牢固地附着在载体上。 吸附交联法固定化酶蛋白的基本操作过程: ? 吸附条件测定:主要包括 基质的离子强度、pH、酶蛋白与载体的最佳比例、吸附完成时间。 ? 吸附, 在测定吸附条件后, 进行酶蛋白的吸附, 在进行吸附时, 要进行不断的搅拌, 但搅拌的述度不能太快, 太快反而不利于吸附进行。 ? 加交联剂: 交联剂的用量因不同的酶蛋白而不同, 交联剂加入量不够, 交联反应进行不完善, 酶固定化反应不牢固, 交联剂加入过多, 过渡的分子内交联反应, 影响酶活收率;交联反应时间一般1小时即可完成(戊二醛作交联剂)。 ? 固定化酶的洗涤, 除去游离酶, 测定固定化酶的酶动力学参数和酶活收率。 实例: 利用离子交换树脂(Dowex MWA-1)固定化碱性蛋白酶: A 载体处理: 70%的乙醇浸泡30min, 用蒸馏水洗涤除去乙醇, 1N氢氧化钠浸泡30min, 蒸馏水洗致中性, 3N盐酸浸泡30min, 蒸馏水洗致中性, 最后用1/15N pH6.5的磷酸buffer 平衡。 B 吸附: 4ml 酶蛋白溶液(10mg/ml) 与1g 载体混合, 待吸附完成后, 加入等体积的10%的戊二醛, 0? 60min即可完成交联反应。 C 洗涤除去游离酶: 用上述buffer 反复洗涤, 将游离酶除去, 测定碱性蛋白酶的酶活收率为27%。