弱精症男子与正常人精浆和精子膜尿激酶酶活性的研究

弱精症男子与正常人精浆和精子膜尿激酶酶活性的研究 酶活性的研究 黄勋彬 熊承良 夏文家 肖敦振 沈继云 周洁玲 陈 莉 余敦秋 摘要 应用琼酯糖2纤维蛋白2平板法和抗人尿激酶多克隆抗体的免疫阻断法, 分别测定了20名正 () 常生育力男子和22例精子活力低下 弱精症的男性不育症患者精浆中及精子膜尿激酶型纤溶酶原激活 () 因子 的酶活性。结果: 弱精症组精浆 活性为2 134?1 581 ƒ正常生育组精浆 活性为, uPA uPA IU L uPA ()3 365?1859. 5 ƒ两组间差异有显著性意义 < 0. 05。弱精症组精子膜 活性为5. 13?3. 82 , IU L P uPA 66(ƒ10正常生育组精子膜 活性为10. 17?6. 18 ƒ10两组间差异有极显著性意义 , , mU ce llsuPA mU ce llsP )< 0. 005。精子膜 活性值与精子活率、活力亦呈线性相关。提示精子膜 酶活性与精子活力及生 uPA uPA 育力可能有一定关系。 尿激酶精子 关键词 精子活力低下不育症, 男性 Com para t ive stud ie s on the urok ina se ac t iva t ion in hum an sem ina l p la sm a an d on sperm a tozoa be tween in f er t ile pa t ien ts w ith a sthen o sperm ia an d hea lthy f er t ile m en , , , , H U A N G X u nbin X ION G C h en l iang X IA W enj ia X IA O D u nz h en , , , S H EN J iy u n Z H OU J ie l ing CH EN L iYU D u nq iu , ,430030C en te r of R ep rod u c t iv e M ed ic ineT ong j i M ed ica l U n iv e rs ity W u h an : O bjec t ive sT o com p a re th e u ro k ina se ac t iva t io n o n sp e rm a to zo a and in h um an sem ina l p la sm a be2 .tw een infe r t ile p a t ien t s w ith a sth eno sp e rm ia and h ea lth y fe r t ile m en ( : 22 D e s ignU ro k ina se ac t iva t io n o n sp e rm a to zo a and in sem ina l p la sm a o f a sth eno sp e rm ia g ro up ) () 20 22ca se sand no rm a l g ro up ca se sw e re de te rm ined by aga ro sef ib r in p la te m e tho d and imm uno lo g ica l .iden t if ica t io n te st w ith po lyc lo na l an t ibo d ie s aga in st h um an u ro k ina se : , .Se tt in gC lin ic in th e C en te r o f R ep ro duc t ive M ed ic ineT o ng jiM ed ica l U n ive r sity : M e thodsSem ina l p la sm a and ly sa te s o f sp e rm a to zo a w e re added in to a sp ec if ic p la te co n sist ing , . m a in ly o f aga ro se and f ib r in and incuba ted fo r ce r ta in t im eT h e ir re levan t d isso lved c irc le s o n th e p la te .w e re m ea su red fo r u ro k ina se ac t iva t io n and ca lcu la ted u sing a u ro k ina se standa rd g rap h : .M a in outcom e m ea sureU ro k ina se ac t iva t io n : Re sultsIn sem ian l p la sm a and o n sp e rm a to zo a sign if ican t ly low e r leve ls o f u ro k ina se ac t iva t io n o n 6 ( 2 134 ?1 581 ƒ?3. 82 ƒ10, 5. 13 sp e rm a to zo a w e re fo und in p a t ien t s w ith a sth eno sp e rm ia IU L mU 6 ) ( ) ?1 859. 5 ƒ?6. 18 ƒ10<3 365, 10. 17, ce llsa s com p a red to h ea lth y fe r t ile m en IU L mU ce llsbo th P 0. 05. A po sit ive co r re la t io n w a s o b se rved be tw een u ro k ina se ac t iva t io n o n sp e rm a to zo a and sp e rm v ia2 ( ) ( ) = 0. 65, ?0. 000 1, = 0. 48, < 0. 005.b ility rP a s w e ll a s w ith sp e rm m o t ility rP : Con c lus ionIt is ind ica ted th a t u ro k ina se ac t iva t io n o n sp e rm a to zo a m ay be re la ted d irec t ly to .sp e rm m o t iliy and fe r t ility Key words: A sth eno sp e rm ia Infe r t ility, m a le U ro k ina se Sp e rm a to zo a 本课为湖北省科学委员会科学基金资助项目 ) () 。惠赠纤溶酶原激活因子 是一类高选择性 PA s 2. 测定: 尿激酶活性测定方法采用琼 类胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶, 能将细胞外液中 酯糖2纤维蛋白2平板法, 参照文献6 进行。简 丰富的无活性纤溶酶原转变成具有广泛蛋白水 述 如 下: 称 取 1. 4琼 酯 糖, 用 0. 01的ƒg m o lL 解活性的纤溶酶。已知的 包括: 尿激酶型PA s ) (( ) ( ) 7. 和组织型 , 它们由机体的多种细 4 配制成1.PB S pH 4% 水浴煮液。取5 u PA tPA m l () 胞分泌, 被认为在与组织重塑和细胞迁移有关 1. 7 ?预热 的 牛 纤 维 蛋 白 原; 0. 3 ƒ37gL m l1, 2 () 的细胞外蛋白水解过程中具有多种功能。有 10 0. 3, 42?预热的牛凝血酶原和0. 3 ƒIU m l () 4. 2酪蛋白单位牛纤溶酶原一起加入到溶 关研究发现尿激酶可提高体内外精子的活 m l 3, 4 化 的 琼 酯 糖 5中 混 合, 迅 速 倾 入 86× 力, 本实验旨在比较研究弱精症与正常生育m l mm 55mm , 凝后打间距相等6 个的卧式电泳槽内力男子精浆中及精子膜结合 酶活性。 u PA 孔, 孔径5。制平板时注意不要产生气泡, 平 mm 材料与方法( 板厚薄宜均匀。每孔各加标本总量20 精浆Λl ) 10 或精子膜提取液上清20 ,+ 10 , ΛlPB S ΛlΛl一、研究对象 1. 正常生育组: 正常生育力男性20名, 年龄 ( 置湿盒中37?孵育一定时间 精浆8小时, 精子 25, 34岁, 平均28. 85岁。均已生育一个子女, 无 ) 膜14小时, 测量透明溶解圈的直径。另取已知 急慢性前列腺炎病史, 按精液参数, W HO 酶活性的尿激酶标准品稀释成不同浓度梯度进 精液参数均属正常范围。 行相同方法测定, 制作尿激酶的标准曲线。出现 2. 弱精症组: 精子活力低下男性不育症患 的透明圈直径的对数值与尿激酶活性的对数值 者22例, 年龄24, 34岁, 平均28. 4岁。婚后同居3 年以上不育。精液结果: 精子活率< 60% , ( ) 呈线性相关 = 0. 99, 通过该曲线可求出待测 r( ) 活力 级 快速直线运动< 25% , 或 级 + a a b θ ()样品中 酶活性值 ?。由于精浆中还存 u PA xs() 中速直线运动< 50% , 其它参数基本正常。 在 和其它纤维蛋白水解酶, 的活性值tPA u PA 二、精液的采集与处理 应为抗尿激酶多克隆抗体阻断前后的差值。禁欲3, 5天, 手淫或电动按摩取精液, 置于 3. 免疫阻断试验: 为了证明透明溶解圈确 50洁净烧杯, 36?恒温水浴箱内, 30 分钟内 m l 系精子膜 所致, 本实验应用兔抗人尿激酶 u PA ( ) ? 32进行阻断对照试验, 同时用于精浆 1 液化的精液作常规分析并。分别取一定量 IgG 9 ( 活 性 的 测 定。每 孔 加 入 总 量 30精 子 u PA Λl () 精液 便于将精子密度调至50×10离心30, ƒL ) ( 提取液上清20抗体10, 或20精 + u PA ΛlΛlΛl ) 浆10抗体10, 具体操作和条件同前述。+ ΛlΛl 分钟, ×5 000, 精浆取出分装, - 30?冷冻待g 测。精子膜结合 的提取: 离心后的精子用 u PA 结果 洗涤3 次, 各加入1含1% 2100PB S m l T r ito n X 一、精液分析参数的0. 1 2缓冲液, 重新将精子悬 ƒ1m o lL T r is H C , 各项参 正常生育组精液经两次精液分析浮, 置- 30?冰箱冷藏待测, 方法参照文献5 。 数均属正常范围。弱精症组精液由同济医科大 临测时取出解冻、离心, 取上清液测定。 学生殖医学中心门诊提供。精液分析结果, 见表 三、酶活性测定方法u PA 1. 1。: 尿激酶标准品39 支, 牛主要试剂ƒ IU L 二、精子膜结合 活性及精浆 活 纤 溶 酶 原 21 酪 蛋 白 单 位ƒ支, 牛 纤 维 蛋 白 原 u PA u PA ( 85支, 牛凝血酶原100 支 均系卫生部 ƒƒm g IU 性 )( 生物制品检定所提供。兔抗人尿激酶 军 IgG 根据各标本测得的透明溶解圈直径大小事医学科学院生物工程研究所程度胜副研究员 () 图1, 2, 从尿激酶标准曲线中推算出各标本相 组 与 正 常 组 精 子 膜u PA 活 性 值 分 别 为结果显示: 标准品及标本均被阻断, 无透明溶解 6 () 5. 13?3. 82 及 10. 17 ? 6. 18 ƒ10图3, 表2。 圈出现 mU ce lls P < 0. 005; 精浆 活性值分别为2 134?1 581u PA 及3 365?1 860 < 0. 05。ƒ, IU L P θ ( ) 表1弱精症组与正常生育组精液参数 x?s ( ) ( ) 弱精症组22例正常组20例 () 精液量 ?1. 17?0. 923. 663. 01m l () 液化时间20. 36?6. 7318. 15?7. 71m in 9 ( ) 密度×1065. 18?24. 171. 2?9. 53ƒL ( ) 活率% 44. 86?11. 4678. 1?4. 10 ( )活力% 级1. 05?2. 98?2. 3626. 1a 级 14. 3?9. 6326. 6?4. 20b ( ) 正常形态% 64. 8?10. 2373. 6?6. 16图3 免疫阻断对照实验精子膜 琼酯糖2纤维蛋白 uPA 平板溶解图。1, 2为精子膜 uPA ; 3为尿激酶标准品; 4, 5为精子 膜 uPA + 抗尿激酶多抗; 6为尿激酶标准品+ 抗尿激酶多抗 表2 免疫阻断对照试验 孔号 组 分 1 2 3 4 5 6 精子膜 uPA () 25 25 尿激酶标准品mU 20Λlƒ ( )20 20 正常人精子 uPA 提取液Λl 20 20 ( ) 10 10 10 抗尿激酶多抗1? 32 Λl ( ) 0. 01m o lƒL PB S Λl10 10 10 精浆 uPA图1 弱精症组与正常组精子膜 活性琼酯糖2纤维 uPA ( )0. 2 0. 2 IU ƒ10Λl 尿激酶标准品蛋白平板溶解图。1, 3为正常组; 4, 6为弱精症组 () 精浆Λl10 10 10 10 ( ) 10 10 10 抗尿激酶多抗1? 16 Λl ( ) 0. 01m o lƒL PB S Λl10 10 10 四、精子膜结合 活性值与精子活率、 u PA 活力的相关性分析 ) ( 将所测 精子膜结合酶活性值与相 u PA () 应的精子活率、活力 + 级精子百分率进行 a b ( ) 相关分析 软件包, 1987 版, 精子膜结合 SA S ( 酶活性与精子活率呈直线正相关 =u PA r ) 0. 65, ?0. P 0001, 与精子活力亦呈直线正相 弱精症组与正常组精浆 活性琼酯糖2纤维蛋 图2uPA ( )关= 0. 48, < 0. 005。 rP 白平板溶解图。1, 2为精浆标本; 3为尿激酶标准品; 4, 5为精浆 标本+ 抗尿激酶多抗; 6为尿激酶标准品+ 抗尿激酶多抗 讨论 fo r p ro duc ing lo ca lized ex t race llu la r p ro teo ly sis. In: B e r lin 计, 因精子活力低下而导致的男性不育症者约7 ()RD , H e rm ann H , L epow I H , e t a l ed s. M o lecu la r ba sis o f 占30% 。因此, 有学者把精子活力作为预测受 8 b io lo g ica l deg rada t ive p ro ce sse s. N ew Yo rk: A cadem ic 精能力的一个重要指标。等的研究表 H u a r te . , 19781155- 169.P re ss Inc 明, 与射出精子膜有关, 只有在射精 u PA u PA 2 D ano K , A nd rea sen PA , G røndah l2H an sen J , e t a l. P la s2 时或射精前后才结合到精子膜上, 并提出可能 , . m ino gen ac t iva to rt issue deg rada t io n and cance rA dv 是通过一种特异性膜受体结合。本实验发现弱 , 1985, 44? 139.C ance r R e s 精症男子精浆中和精子膜结合 的酶活性 u PA , , , . H o ng C Y C h iang BN H uang JJ e t a lTw o p la sm ino gen 3 均显著性低于正常生育力男子, 而且精子膜 , ac t iva to r sst rep to k ina se and u ro k ina se st im u la te h um an . , 1985, 17? 317.sp e rm m o t ilityA nd ro lo g ia u PA 酶活性值与精子活率、活力之间均呈直线熊承良, 沈继云, 周洁玲, 等. 尿激酶对弱精症患者精子活 4 力影响的研究. 生殖医学杂志, 1995, 4? 164. 正相关, 说明精子膜结合 可能对精子活力 u PA , , , , M a ie r U K irch h e im e r JC H iene r t Ge t a lF ib r ino ly t ic p a2 5 的影响是直接的。而精浆中 酶活性与精子 u PA . , 1991,ram e te r s in sp e rm a to zo a and sem ina l p la sm aJ U ro l 活率和活力无明显相关性, 可能这种 对精u PA 146? 906. 有别子活力的影响是间接的, 因为精子膜 u PA2, , . G rane lliP ip e rno A R e ich E e t a lA study o f p ro tea se s 6 9 于精浆中的 有其特异性。然而, 关于 , u PA 2. and p ro tea se sinh ib ito r com p lexe s in b io lo g ica l f lu id sJ , 1978, 148? 223.E xp M ed 提高精子活力的具体机制, 尚待进一步探 u PA 周惠耕, 江 鱼. 1321例男性不育症的病因分析和诊治体7 索。根据目前的研究进展, 可以推测有两方面的 会. 男性学杂志, 1990, 4? 92. 通过催化纤溶酶原转变成纤作用: 其一, u PA, , , . H ua r te J B e lin D Bo sco D e t a lP la sm ino gen ac t iva to r 8 溶酶, 后者引起的蛋白水解反应促进了精浆中: and m o u se sp e rm a to zo au ro k ina se syn th e sis in th e m a le gen ita l t rac t and b ind ing o f th e enzym e to th e sp e rm ce ll 蛋白质的降解, 降低了精子游动的阻力; 其二, . , 1987, 104? 1281.su rfaceJ C e ll B io l 结合于精子膜表面特异性受体, 在精子表u PA R ek k a s C , B e liba sak i S, T a itzo g lo u I, e t a l. Inc rea sed p la s2 9 面将纤溶酶原转变成纤溶酶, 由纤溶酶直接刺m ino gen ac t iva to r ac t iv ity and p la sm ino gen ac t iva to r inh i2 10 激精子, 达到提高精子活力的作用。当然, 这 b it io n in sp e rm a to zo a and sem ina l p la sm a o f th e ram af te r 个过程中还有其它一些因素的参与和调节。如 ( ) , se rum go nado t rop h in PM SG adm in ist ra t io nco r re la t io n 10 . () w ith th e inc rea sed leve l o f te sto ste ro ne in th e b loo dA n2 纤溶酶原激活因子抑制物等。 , tPA PA I ? 273., 1991, 23d ro lo g ia 本实验对临床上治疗精子活力低下引起的 男性不育症及抗生育的研究均有一定参考意 10 , , , . Sm o ko v it is A Ko ko lis N A lexopo u lo s C e t a lP la sm ino 2 , gen ac t iva to r ac t iv ityp la sm ino gen ac t iva to r inh ib it io n and 义。通过体内应用尿激酶的治疗, 本研究室已经 p la sm in inh ib it io n in sp e rm a to zo a and sem ina l p la sm a o f 4 发现对弱精症的精子活力有明显提高。h um an and va r io u s an im a l sp ec ie s, E ffec t o f p la sm in o n . , 1987, 1? 253.sp e rm m o t ilityF ib r ino ly sis 参 考 文 献 ( )收搞: 1996205227 修回: 1996209227 1 R e ich E. A c t iva t io n o f p la sm ino gen: a gene ra l m ech an ism 新书信息 世界卫生组织编写的《不育夫妇标准检查与诊断手册》已由北京协和医院和国家计划生育委员会科学技术研 究所翻译出版。本手册推荐一种标准的不育检查方法。本手册将免费赠送到各大医学院校、计划生育研究所及医疗 () 单位。个人需要者请来函索取并交纳4元包装、邮资费 不报销款到即发, 份数有限, 赠完为止。 来信请写明: 索取者姓名、性别、职称、职务、工作单位、单位地址及邮政编码。 来函请寄: 100081 北京海淀区大慧寺12号《生殖医学杂志》编辑部蒲以森同志 本刊编辑部