CTLA4Ig重组慢病毒引流淋巴结定向表达研究（可编辑）

CTLA4Ig重组慢病毒引流淋巴结定向表达研究（可编辑） CTLA4Ig重组慢病毒引流淋巴结定向表达研究 分类号 密级 国际十进分类号(UDC)第四军医大 学 硕士学位论文CTLA4-Ig 重组慢病毒引流淋巴结定向表达的研究 曹 姣 学历研究生 培 养 类 别 学术学位 申请学位类型 外科学(整形) 学科领域专业 指导教师 郭树忠 教授(主任医师) 指导教师单位 西京医院整形外科 二 O 一二年五月 独 独 创 创 性 性 声 声 明 明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德,本人声明所呈交的论文是我 个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文 中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果,不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。论文作者签名: 日期: 保 护 知 识 产 权 声 明 保 护 知 识 产 权 声 明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在 校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业 离校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。 学校可以公布论文的全部或部分内容(含电子版,保密内容除外),可以采 用影印,缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅, 并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入《中 国优秀博硕士学位论文全文数据库》和编入《中国知识资源总库》 ,同意按 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。 论文作者签名:导师签名: 日期:CTLA4-Ig 重组慢病毒引流淋巴结定向表达的研究 研 究 生:曹 姣 学科专业:外科学(整形) 所在单位:第四军医大学西京医院整形外科 导 师:郭树忠 教授(主任医师) 辅导教师:韩 岩 教 授夏 炜 副教授(副主任医师)李 杨 讲 师 资助基金项目:国家自然科学基金(No.81071582) 关键词:同种异体复合组织移植;CTLA4-Ig;慢病毒;引流淋巴结;成熟树 突状细胞 中国人民解放军第四军医大学 二 O 一二年五月第四军医大学硕士学位论文 目 录 缩略语表 1 中文摘要 2 英文摘要 5 前 言 9 文献回顾. 11 正 文. 26 实验一 大鼠淋巴结内注射 CTLA4-Ig重组慢病毒. 26 1 材料与方法. 26 2 结果. 28 3 讨论. 29 实验二 大鼠成熟树突状细胞的培养及鉴定 31 1 材料与方法. 31 2 结果. 33 3 讨论. 36 实验三 CTLA4-Ig重组慢病毒转染大鼠成熟树突状细胞37 1 材料和方法. 37 2 结果. 39 3 讨论. 41 实验四 CTLA4-Ig重组慢病毒转染 DCs 引流淋巴结定向表达42 1 材料和方法. 42 2 结果. 43 3 讨论. 44 小 结. 45 参考文献. 46 个人简历和研究成果59 致 谢. 60 第四军医大学硕士学位论文 缩略语表 缩略词 英文全称 中文全称 APCs Antigen-presenting cells 抗原提呈细胞 CD Cluster of defferentiation 白细胞分化抗原 Carboxyfluorescein 羟基荧光素乙酰乙酸琥 CFDA SE diacetate,succinimidyl ester 珀酰亚胺酯 CTA Composite Tissue Allotransplantation 同种异体复合组织移植 CTLA4-I Cytotoxic T-lymphocyte-associate 细胞毒性 T淋巴细胞相关 g protein 4 immune gloulin 抗原 4融合蛋白 DCs Dentritic cells 树突状细胞 Fetal calf serum FCS 胎牛血清 FITC Fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素 Granulocyte-macrophage GM-CSF 粒细胞巨噬细胞刺激因子 colony-stimulating factor GVHD Graft versus host disease 移植物抗宿主疾病 IL-2 Interleukin 2 白介素-2 imDCs Imuture Dendritic cells 未成熟树突状细胞 LPS Lipopolysaccharide 脂多糖 MHC Major histocomatibility complex 主要组织相容性复合体 MLR Mixed lymphocyte reaction 混合淋巴细胞反应 PE phycoerythrin 藻红蛋白 Treg Regulatory cells 调节 T细胞-1-第四军医大学硕士学位论文 CTLA4-Ig 重组慢病毒引流淋巴结定向表达的研究 硕士研究生 :曹 姣 导师 :郭树忠 教授 第四军医大学西京医院整形外科,西安 710032 中文摘要 新型免疫抑制药物的研制及发展,为整形外科在异体复合组织移植领 域的稳步发展带来了新的机遇。然而,异体复合组织移植(CTA)的发展 远远不似内脏器官移植一样迅速,究其根本,是因为异体复合组织移植物 组分复杂,并且抗原性不均一。自1998年首次手移植被Dubernard成功实施 以来,到目前为止,在临床上已完成超过60例手移植和23例异体颜面移植。 第一例异体颜面移植在法国成功施行手术后,曾经发生2次急性排斥反应, 第二例患者是在本科室成功实施后,术后也发生了3次急性排斥反应。加大 免疫抑制剂用量是使排斥反应得到控制的有效方法,但是往往会出现各种 棘手的并发症如急性肾衰、高血压症等。鉴于上述原因,寻找可以使免疫 抑制剂用量最小化的方法,已成为CTA移植领域重点研究的项目。免疫应答 的一般规律同样适用于异体复合组织移植排斥反应的发生, 首先,外来的异体抗原被免疫识别之后激活机体免疫系统,继而产生对移 植物的免疫排斥反应,也就是说,阻断免疫应答中的任何一个环节,都可 以实现对移植免疫耐受的诱导。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抗体融合蛋 白(CTLA4-Ig)可以阻断 CD28-B7途径,能有效诱导免疫耐受的发生。树突状细胞毋庸置疑是最主 -2-第四军医大学硕士学位论文 要的抗原提呈细胞,在其表面可以高水平表达MHC-II类分子以及CD80、 CD86等共刺激分子,通过B7分子与CD28的结合,开启第二信号刺激途径, 从而激活初始T细胞。成熟的树突状细胞具有淋巴归巢的特性,因此, CTLA4-Ig重组慢病毒转染的成熟树突状细胞有可能成为细胞回输治疗 的备选细胞。目的: 研究CTLA4-Ig直接淋巴结注射后其表达效率、CTLA4-Ig重组慢病毒转 染成熟树突状细胞后相关基因的表达,局部注射转染后的成熟树突状细胞 后观察CTLA4-Ig在引流淋巴结内的表达,探索淋巴结直接基因治疗方法的 可行性;试图通过局部细胞治疗诱导免疫耐受,降低全身免疫抑制剂的用 量,为同种异体复合组织移植探索新途径。方法: 1.大鼠淋巴结内注射CTLA4-Ig重组慢病毒,观察CTLA4-Ig在淋巴结 内的表达。2.贴壁培养法体外诱导成熟树突状细胞,进行形态学鉴定、活性 及表 型鉴定,体外鉴定其免疫学功能。3.体外试验研究CTLA4-Ig重组慢病毒转染 大鼠成熟树突状细胞,观测 CTLA4-Ig的表达时间及表达高峰。 4.体内试验研究CTLA4-Ig重组慢病毒转染的成熟树突状细胞于大鼠引 流淋巴结的定向表达。结果: 1.实时荧光定量PCR及冰冻切片示,空白对照及阴性对照组淋巴结内 均无CTLA4-Ig的表达。CTLA4-Ig重组慢病毒淋巴结内注射组有明显的 CTLA4-Ig表达。 -3-第四军医大学硕士学位论文 2.光镜见培养的成熟树突状细胞集落分散,悬浮,分布较均匀。扫描 电镜见细胞表面大量褶皱与粗细不等的突起。流式细胞术显示成熟树突状 细胞表面的DC功能相关抗原MHC II、CD80、CD86均高表达。功能试验检 测其分泌IL-12能力较未成熟树突状细胞强,混合淋巴细胞反应显示其有强 的刺激T细胞增殖的能力。活细胞率为(80.34?1.25)%。 3.慢病毒转染成熟树突状细胞76h后,于倒置荧光显微镜下可观察到 荧光表达。随时间延长,荧光表达增多,细胞形态亦出现老化。转染后第 7d细胞明显老化。Q-PCR示CTLA4-Ig重组慢病毒转染成熟树突状细胞第3 天,于mRNA水平有CTLA4-Ig的表达,western blotting所示结果与 Q-PCR一致。 4.距大鼠腋固有淋巴结处2公分皮下缓慢注射所收获的CTLA4-Ig重组 慢病毒转染后第3天的DCs,术后第4天取材,Q-PCR显示注射CTLA4-Ig重 组慢病毒转染的DCs组于淋巴结内可检测到CTLA4-Ig的表达。 结论:1.CTLA4-Ig重组慢病毒淋巴结内直接注射可行,但范围局限且损伤较 大。2.细胞治疗初步显示可行,其效果需在异体复合组织移植模型中做进 一步的验证。 关键词:同种异体复合组织移植;CTLA4-Ig;慢病毒;引流淋巴结;成熟 树突状细胞-4-第四军医大学硕士学位论文 The study of CTLA4-Ig recombinant Lentiviral Vector directed expression to draining lymph nodes Candidate for master: Cao Jiao Supervisor: Guo shuzhong Department of Pastic Surgery,Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China Abstract Ethnology, the rapid development of transplant surgery, plastic surgeons also stepped up exploration in the field of allogeneic composite tissue transplantation. However, the CTA transplantation has lagged far behind the visceral organ transplantation; the reasons why it is backward are its complex composition and antigenic heterogeneity. Since 1998, Dubernard first successful implementation of the hand transplant, until 2007 the world has completed 20 cases of hand transplantation, eight cases of face transplant. According to the literature review, the first case CTA patient in France experienced 2 acute rejections in the postoperative. In our institute the second patient of the world experienced 3 acute rejections. Increasing the dosage of immunosuppressive agents, rejection could be controlled, but the price has been a variety of difficult complications, acute renal failure, hypertension, hyperglycemia, leukopenia, and so on. Therefore, how to minimize the risk of immunosuppressive agents has become a top priority in the field of CTA transplantation -5-第四 军医大学硕士学位论文 Allogeneic composite tissue transplantation rejection episodes follow the general rules of the immune response. Namely, first, the foreign alloantigen immune recognition, and then entering the activation phase, the resulting immune rejection of the graft, therefore, selective blocking any one link, are likely to induce transplantation tolerance CTLA4-Ig could block CD28-B7 pathway to induce immune toleranceDendritic cells are the main antigen-presenting cells. it has high level of surface expression of MHC-Class II molecules and costimulatory molecules of CD80, CD86 and stimulate the way through the second signal to activate naive T cellsMature dendritic cells have the characteristics of the lymphatic homing; therefore, the mature dendritic cell is a cell reinfusion treatment program ideal alternative cellObjectives: To research the expression efficiency of CTLA4-Ig directly injected into lymph node, the related gene expression which was infected CTLA4-Ig recombinant Lentiviral Vector in mature dendritic cells, and local injection of transfection of mature dendritic cells and observing the expression of CTLA4-Ig in the draining lymph nodes. Proposing the new concept of local cell therapy to induce immune tolerance or lymph nodes directly gene therapy, reducing the risk of systemic immunosuppressive agents for allogenic composite tissue transplantationMethod: 1. Injecting CTLA4-Ig recombinant Lentiviral Vector to Rat lymph node to observe the expression of CTLA4-Ig in the lymph nodes 2. Adherent cultured inducing mature dendritic cells in vitro, taking the-6-第四军医大学硕士学位论文 morphological identification, the activity and phenotype identification, and finally identifying immunological function in vitro3. Study CTLA4-Ig recombinant Lentiviral Vector transecting rat mature dendritic cells in vitro, and measuring the expression time, peak expression of CTLA4-Ig4. Study the Mature dendritic cells’ directed expression of CTLA4-Ig recombinant Lentiviral Vector transfection in lymph node drainage in rats in vivoResult:1. Real time fluorescence quantitative PCR and the frozen section showed that there was no expression of CTLA4-Ig in the lymph nodes in the blank control and negative control group. CTLA4-Ig recombinant Lentiviral Vector injection within the lymph node group has significant CTLA4-Ig expression2. Cultured mature dendritic cell colony dispersion, suspension, and distribution more uniform could be seen by Optical microscopy. A large number of cell surface fold with thickness and process ranging from thickness could be seen by Scanning electron microscope. Flow cytometry showed that DC function-associated antigen MHC II, CD80, and CD86 were highly expressed in the surface of mature dendritic cells. Function tests to detect the secretion of IL-12 capacity showed that the mature DCs are stronger than immature ones, mixed lymphocyte reaction showed its strong ability to stimulate T cell proliferation. Living cells 80.34 ? 1.25% 3. After 76h of Lentiviral transfection of mature dendritic cells, it showed that there were observed fluorescence expressions under an inverted fluorescence-7-第四军医大学硕士学位论文 microscope. the fluorescence expression increased with time, cell morphology turned to be senescent. The cells turned to be senescent obviously after 7 days of transfection. Q-PCR showed that there were CTLA4-Ig expression at the mRNA level after 3 days of the CTLA4-Ig recombinant Lentiviral Vector mature dendritic cells transfection, Western blot detection showed the same results as Q-PCR 4. Injecting slowly of CTLA4-Ig recombinant Lentiviral Vector harvested after 3 days of transfection of DCs away from the rat axillary the inherent lymph nodes at 2 cm subcutaneous then took a tissue after three days, the Q-PCR showed that it could be detected the CTLA4-Ig expression after injection of CTLA4-Ig recombinant Lentiviral Vector transfection DCs in lymph nodesConclusion: 1. CTLA4-Ig recombinant Lentiviral Vector could be injected into lymph node directly, but the range is limited and the damage is more2. Cell therapy is feasible preliminary, but it is necessary to research for furtherexperiental studies in the allogeneic composite tissue transplantation modelKey words: composite tissue allotransplantation; CTLA4-Ig; draining lymph node ;Lentiviral Vector; mature DC -8-第四军医大学硕士学位论文 前 言 异体复合组织移植与传统的自体组织移植修复相比,可以获得良好的 组织外形,并能较好的恢复其功能,且不会造成供区继发畸形。随着新型 免疫抑制药物的研发与应用,整形外科在异体复合组织移植领域的探索研 1 究也稳步推进 。但是,复合组织移植在临床的广泛应用仍然受到限制,主 要是因为CTA移植物的组成成分中的皮肤和附件具有高度的免疫原性,由 2 此造成了移植术后高发生率的免疫排斥反应 。 3 据报道,CTA术后患者大多发生了可逆性急性排斥反应 ,多数可通过 新型免疫抑制剂有效抑制,从而维持移植组织的成活。然而,临床实践亦 表明,这种大剂量免疫抑制剂冲击治疗的非特异性免疫抑制作用同时也带 来了严重的全身毒副反应。 要想在此领域取得进一步的发展,就需要研究 探索新的低毒性免疫抑制方案或者研究发展供体特异免疫耐受方法。异体复合组织移植排斥反应的发生遵循着免疫应答的一般规律,即首 先对外来的同种异体抗原进行免疫识别,继而进入活化阶段,最终产生对 移植物的免疫排斥反应。无论选择性阻断其中的哪一环节,对移植免疫耐 4 受 的诱导均有可能实现。目前对供者特异性移植免疫耐受的诱导方法有: 移植术前注射供者的抗原以期阻断抗原识别,骨髓移植诱导嵌合体,病毒 以及分子治疗阻断T细胞活化的共刺激途径,以及T细胞疫苗等。抗原提呈 细胞摄取各种异体移植物的抗原碎片及细胞后,通过淋巴引 流进入次级淋巴组织,如通过输入淋巴管进入引流淋巴结,将所摄取的抗 原提呈给引流淋巴结的初始T细胞,使初始T细胞激活并增殖为效应T细胞, 这些效应T细胞再通过血运达到异体移植物局部,与多种细胞配合共同作 用,引起移植物排斥反应的发生,促使异体移植物细胞的凋亡。相对于器 官移植而言,位于体表的异体复合组织其供、受体抗原提呈细胞在摄取了 -9-第四军医大学硕士学位论文 抗原之后可通过淋巴引流的输入淋巴管进入引流淋巴结,在引流淋巴结内 刺激机体产生针对移植物的特异性T细胞。如果对引流淋巴结进行局部干 预,或许有减少特异性T细胞数量的可能,以此降低受体适应性免疫排斥反 应的强度。 鉴于非特异性免疫抑制剂所引起的全身毒副反应,局部病毒注射治疗 或是局部细胞回输治疗具有一定的优势,在诱导免疫耐受的研究中有着令 人期待的前景。本课题拟体外诱导受体成熟树突状细胞,CTLA4-Ig重组慢 病毒转染该细胞,将转染后的细胞回输大鼠皮下,利用成熟树突状细胞的 淋巴归巢途径,将 CTLA4-Ig带至引流淋巴结,以期诱导免疫耐受的发生, 减少 CTA 术后移植物排斥反应的发生,降低全身免疫抑制剂的用量。同时 对比研究 CTLA4-Ig 重组慢病毒引流淋巴结注射后,CTLA4-Ig 于淋巴结组 织中的表达。-10-第四军医大学硕士学位论文 文献回顾 异体复合组织移植越来越受到临床医生的重视,手、面、膝盖等的移 植的成功引起了人们对 CTA 的广泛的兴趣,。但免疫抑制后的风险仍然是 此项技术进步的障碍。要想在此领域取得突破就需要研发新的低毒性免疫 抑制剂,或者探索供体特异性免疫耐受方法。 1 同种异体复合组织移植临床进展概述 1.1 同种异体复合组织移植的发展 CTA 是整形外科医生多年来的梦想,面部和四肢的严重创伤经常会导 致用自体组织移植修复软组织和骨骼缺损,尽管自体组织移植手术已经在 临床上得到广泛应用,但是其功能与外形恢复仍远不能让人满意。要想恢 复功能以及恢复病人的容貌和自信心,研究发展 CTA是一个可行的途径。 据估计美国每年大约有 700 万人因手术、创伤、和出生缺陷而出现体表组 织器官的缺损与畸形,有望从 CTA研究中受益,这些潜在的患者人数远超 5 过等待器官移植的人数 。 6 肢体移植的概念可追溯到 4 世纪一个肢体移植的传奇故事 。也有文献 记载了整形手术之父 GAspare Tage 曾尝试用奴隶的前臂组织皮瓣异体移 植 7 进行了鼻再造 。 20 世纪初血管手术的进步推动了早期的异体组织器官移植实验。第一 8?9 个动物和人的全关节移植在 1908年完成 ,但是这两个移植物均没有携带 10 血管,也没有使用免疫抑制剂,1936 年 Schwind 描述了一起成功的小鼠 后肢异位移植。他将一个小鼠的后肢缝合到另一个后肢部分截断术的小鼠 的腿上,但是,实验中所用的小鼠是同一品系,因此排斥了对于移植组织 产生免疫反应的可能性,这些研究展示了肢体移植在技术上的可行性。-11- 第四军医大学硕士学位论文 11 1964 年报道了临床第一例手移植 。Robert Gilbert 带领的团队实施了 这一史无前例的手术,患者是在一次爆炸中失去双手的年轻人,尽管全身 使用了类固醇以及硫唑嘌啉,还是出现了严重的免疫排斥反应,以致最后 不得不将移植的手截除。 随着更加有效免疫抑制剂的发展,CTA 成功的可能性大大增加,钙调 12?13?14 磷酸酶抑制剂环孢素 A和后来的 FK506 都对 CTA 的成功贡献巨大 , 通过几种药物联合应用,与单种药物使用相比,不但可以有效的对抗组织 15 免疫排斥反应,并且毒性更低 ,现在器官移植的急性免疫排斥反应发生率 已经显著降低,但是慢性移植物功能障碍的难题仍然没有解决。 1998 年,一个国际团队在法国里昂成功实施人手移植,开启了移植外 16 科的新纪元 ,但是病人由于依从性差,最终发生排斥反应,移植的手被切 17 除。在这个短暂的成功案例之后,Jones 等完成了第一个世界上长期存活 的手部移植,发现控制手移植排斥反应,仅仅需要使用用于维持肾移植免 疫抑制同样的三种药物。2009 年 3 月,手和复合组织移植国际注册协会记 录了 32例病人的手移植,仅仅有少数移植物被截除,且几乎都是由于患者 18 依从性差、停止使用免疫抑制剂所致 ,手移植目前最长存活时间超过了 10年。 1.2 CTA中所用免疫抑制剂相关的风险 尽管在这些相对较少人数的患者中出现的可喜的早期结果,在 CTA 中 19 与免疫抑制药物相关的风险是否大于其带来的好处仍有争论 。免疫抑制药 20 物抑制免疫系统没有特异性,导致肿瘤,机会性感染和内脏毒性风险上升 , 手部移植注册协会报道的机会感染为 63.6%,代谢并发症为 50%,最严重 21 的并发症为在一例病人中出现的类固醇相关的无菌性股骨头坏死 ,以及移 22 植受体的肾脏损害 。尽管其他的并发症如恶性肿瘤,心血管相关疾病,肾 23 毒性还没有报道,人们预测其发病率与实体器官移植受体的相类似 。 慢性排斥反应被认为是 CTA的另一个主要挑战,被认为是一个多因子 -12-第四军医大学硕士学位论文 的致病源,在移植是出现的缺血性损伤以及对移植物的慢性免疫反应是主 24 要的原因 ,尽管急性排斥反应率在最初的十二个月的手部移植中有 85%。 这些都可被加大免疫抑制而轻松逆转。到目前为止,在临床 CTA中,慢性 25?26 排斥反应的特征并没有充分描述 。第一个手部移植患者,在一个延长的 不依从的药物治疗后,接受了手部截肢,并在移植物上显示出皮肤上的慢 性排斥反应。受到排斥的移植物显示出和慢性苔藓样 GVHD相类似的组织 27?28 学现象 。第一例的由于患者减至单一药物疗法而引发的移植物死亡在 29 American Transplant Congress 2009 Annual Meeting被报道 。 CTA 面临的最主要挑战是在面对急性和慢性排斥反应的时候使免疫抑 制最小化。这个目标让移植免疫学这一领域的研究转向供体特异性免疫耐 受。免疫耐受可被定义为在在维持对于第三方抗原适当的免疫反应时,在 30 没有免疫抑制的情况下,对于供体的低反应状态 。免疫耐受是移植领域的 最佳解决方法。 1.3 CTA中所用免疫抑制剂的相关副作用 免疫抑制治疗所引起的副作用包括条件致病菌感染、肾毒性、神经毒 性、代谢紊乱及移植后淋巴组织增生,一旦出现上述症状,需立即中断免 疫抑制治疗。 2 同种异基因移植排斥反应的防治进展 异体复合组织移植排斥反应的发生遵循着免疫应答的一般规律,即首 先对外来的同种异体抗原进行免疫识别,继而进入活化阶段,最终产生对 移植物的免疫排斥,因此,选择性阻断其中任一环节,均有可能诱导移植 免疫耐受。 2.1 对受者或移植物进行预处理对于移植物中的过路细胞尽可能清除,有助 于减轻甚至防止宿主抗移 31 植物反应的发生。这些预处理措施包括术前放射照射移植物 或受者淋巴结 -13-第四军医大学硕士学位论文 清扫以及血浆淋巴细胞的置换。2.2 对受者的免疫应答进行抑制抑制受者的 免疫应答包括化学类免疫抑制剂的应用如糖皮质激素、硫唑 嘌呤等。以及生物制剂的应用如某些抗免疫细胞膜抗体,膜抗原与这些相 应的细胞膜抗体结合,通过补体依赖的细胞毒作用,以达到清除体内T细胞 或胸腺细胞的目的。抑制受者的免疫应答还可以应用某些细胞因子与毒素 组成的融合蛋白、某些黏附分子与免疫球蛋白组成的融合蛋白 如 CTLA-4-Ig等。最后,中草药类免疫抑制剂如冬虫夏草也可对受者的免疫 应答进行抑制。2.3 诱导受者产生针对移植物的免疫耐受2.3.1 通过嵌合 体建立免疫耐受 32 最早和最为熟知的建立免疫耐受的方法之一是造血干细胞嵌合体 。在 嵌合体中,具有不同基因的两个不同组织成功的分布于同一机体中。嵌合 体可以被分为两种基本类型:宏观和微观。宏观嵌合体通常是通过单独骨 髓移植到经过清髓处理的患者来实现的,该患者需去除骨髓为异基因骨髓 腾出空间,从而防止移植的骨髓发生免疫排斥,在供体多能造血干细胞嫁 接于受体骨髓中并生成他所有的细胞系后,一个新的有受体-供体双向免疫 耐受的混合免疫系统就产生了。胸腺中新产生的识别供体或者受体的 T 淋 巴细胞被克隆性的删除。实验证实,仅有 1%供体嵌合体对于诱导供体特异 33?34 的免疫耐受状态有效 。 35 微观嵌合体发生在移植物的白细胞迁移到未处理的受体中 。这些移植 物中的白细胞被认为在与受体的白细胞作用之后可以导致供体特异的免疫 耐受。在微观嵌合体中,供体多能造血干细胞并没有植入受体的骨髓,然 而造血源性细胞(主要是 DC)在供体的器官中生成,并系统性的迁移。因 此,并非所有干细胞源性细胞系都被生成,在受体的外周血中可以检测出 供体的细胞。对于微观嵌合体可以诱导免疫耐受还是它是免疫耐受的副作 -14-第四军医大学硕士学位论文 用还有争论。 在 1992 年春天,一个在 30 个长期存活的肝脏或者肾移植患者的血中 36 查找供体白细胞的实验中 ,证实微嵌合体在所有 30名患者中出现 ,尽管 免疫排斥反应在微嵌合体存在时也可出现,并且免疫耐受在微嵌合体缺乏 37?38 时也可出现 ,但是一些学者坚称微嵌合体对于维持在移植后几周时间内 39 由过客白细胞初始潮引起的免疫清除起着重要的作用 。 2.3.2 血管化的骨髓移植形成嵌合体 在手部移植物中,因为同时移植了有血管供应的骨组织,免疫学家期 待这个过程能诱导嵌合体的生成,尽管受体在移植之前没有经过处理。在 这些情况下,手移植物被认为是血管化的骨髓移植(VBMT) ,供体骨髓细 胞存在于他们自己的微环境中,一旦移植后,供体造血淋巴生成细胞提供 40 源源不断的补充时就会发生作用 。利用小鼠肢体移植的研究证实与单独的 41 细胞性骨髓移植相比,在 VBMT 中免疫耐受的产生更加迅速 ,尽管手移 42?43 44 植中的骨髓成分也可能增加 GVHD 的风险 ,Hewitt 利用小鼠后肢移植 模型,发现 37.5%受体发生致命性 GVHD,而剩余的移植动物从自限性的 GVHD 进程中慢慢恢复,并产生长期免疫耐受。一些学者在手移植之前进 45?46 47 行辐照,以预防 GVHD 。在没有辐照时清除淋巴结可消除 GVHD ,表 明 VBMT 不是 GVHD的诱因,而是移植物内成熟的淋巴细胞在起作用。显 然 GVHD 到目前为止还没有发生在任何一个手移植病例中。 48 这些结果并没有在大型动物模型中得到重复, Bourge 等 证实外周嵌合 体仅仅在手术后短暂出现,在诱导对于骨骼肌移植物的免疫耐受猪模型中, VBMT 对于免疫耐受的维持并不是必须的,没有检测到供体的微嵌合体, 外周微嵌合体在移植后早期出现,之后就消失了。人类手移植通常只含有 少量功能活跃的供体骨髓,因此不会明显影响受体。 目前存在两种骨髓嵌合体:完全异源和混合异源,在完全嵌合体中, 供体骨髓取代了受体的造血系统。-15-第四军医大学硕士学位论文 2.3.3 阻断 T细胞活化的共刺激信号途径 B7/CD28 和 CD40/CD40L分子对是参与 T 细胞活化的最重要的共刺激 49 通路 。一般认为,对于 B7-CD28/CTLA4 共刺激通路的操控为达到免疫抑 制治疗的一条非常有潜力的途径。 CTLA4-Ig结合 B7分子的亲和力比 CD28 更高,因此可以有力的抑制 B7-CD28 介导的 T细胞共刺激途径,有效抑制 50?51 急性排斥反应 。 但 CTLA4-Ig和抗 B7抗体影响自身免疫性的发展或者促进移植物的耐 受的机制仍不十分清楚。 2.3.4 对移植受体内的T细胞受体进行有效的干预,或可达到抑制移植后免 疫排斥反应的目的。 应用针对同种抗原特异性 T 细胞 TCR 的单克隆抗体或靶向抗 TCR 抗 体,有可能封闭或清除同种抗原特异性 T 细胞,建立同种移植耐受。同种 异体 MHC 分子含有某些称为优势肽的关键性肽段,它们在引发受者 T 细 胞活化的过程中具有重要作用。优势肽在受者 APC 内可与受者 MHC?类 分子高亲和力结合成复合物,并被提呈给受者 T 细胞。在间接识别中,受 者同种反应性 T 细胞主要识别供者 MHC 分子中优势肽的表位。因此,应 用人工合成的肽段模拟供者 MHC分子的优势肽封闭受者同种抗原特异性 T 细胞的 TCR,可通过干扰间接识别而诱导移植耐受。应用针对同种抗原 特异性 T 细胞 TCR 的单克隆抗体或靶向抗 TCR 抗体,有可能封闭或清除 同种抗原特异性 T细胞,建立同种移植耐受。2.3.5 T 细胞疫苗TCVT 细胞 疫苗是由特异性抗原活化的T 细胞经用物理或化学方法灭活后 制成的灭活的自身反应性T细胞。它本身表达一组特定的T细胞受体TCR, 诱导产生针对TCR的抗体,导致针对特定抗原的特异无反应性,此作用具 有抗原特异性,TCV可以诱导作用于活化抑制性T 细胞或者杀伤细胞抗独 特型T细胞的种植??,以抑制抗原反应性T细胞或去除抗原反应性T细胞。 -16-第四军医大学硕士学位论文 研究发现, T 细胞疫苗可以诱导并激活抗独特型T细胞,抗独特型T细胞是 指 活化T细胞的抑制性T细胞或者杀伤细胞,其效应具有抗原特异性,上调的 抗独特型T细胞可以抑制独特型T细胞的功能,从而抑制免疫应答降低受者 体内同种抗原特异性T细胞的应答能力;促进受者B细胞产生抗TCV特异性 抗体;上调受者体内抗TCV独特型的T细胞,抑制独特型T细胞的功能,从 而抑制免疫应答。 2.3.6 供者特异性抗原输注移植前对受者进行供者抗原输注或可引起移植 物存活的主动增强现 象,即可延长移植物存活的时间。临床资料已报道,应用供者特异性输血 52 DST诱导耐受,可提高移植成功率 。3 次级淋巴组织 3.1 次级淋巴组织在同种异体移植中的作用包括脾、淋巴结、粘膜免疫器官 等在内的次级淋巴组织是效应 T 细胞 产生的部位。异体免疫排斥反应的主要细胞组分为效应 T 细胞,它协同其 它细胞完成免疫排斥反应。初始 T 细胞通过血运监视各个次级淋巴组织, 检查是否存在外来的异物分子或者病原,抗原提呈细胞摄取各种异体移植 物的抗原碎片及细胞后,通过淋巴引流进入次级淋巴组织,如通过输入淋 巴管进入引流淋巴结,将所摄取的抗原提呈给通过血运进入引流淋巴结的 初始 T细胞,使初始 T细胞激活并增殖为效应 T细胞,这些效应 T细胞再 通过血运达到异体移植物局部,与多种细胞配合共同作用,引起移植物排 斥反应的发生,促使异体移植物细胞的凋亡。相对于器官移植而言,位于 体表的异体复合组织其供、受体抗原提呈细胞在摄取了抗原之后可通过淋 巴引流的输入淋巴管进入引流淋巴结,在引流淋巴结内刺激机体产生针对 移植物的特异性 T 细胞。如果对引流淋巴结进行局部干预,或许有减少特 异性 T细胞数量的可能,以此降低受体适应性免疫排斥反应的强度。由此, -17-第四军医大学硕士学位论文 降低使用全身免疫抑制药物的剂量以致降低毒副反应的影响。 免疫细胞包括成熟 T 细胞、B 细胞等定居在次级淋巴组织。同时,次 级淋巴组织亦是免疫应答产生的部位,它是适应性免疫应答启动的主要场 所。绝大多数初始 T 细胞在脾、粘膜相关淋巴组织、淋巴结等次级淋巴组 53?54 织中存在 。因为次级淋巴组织的局部趋化因子微环境及其特殊结构,少 量的 T 细胞在此与载有抗原的树突状细胞充分接触,并启动适应性免疫应 55?56?57 答 。不仅初始 T细胞的存活、成熟与次级淋巴组织密切相关,其分化 为效应 T 细胞及记忆 T 细胞亦与次级淋巴组织密不可分。效应 T 细胞与 记 58?59?60 忆 T细胞是通过将外周组织中出现的异物抗原清除来保护机体组织 。 3.2 淋巴结在同种异体复合组织移植中的作用 淋巴结、脾、粘膜相关淋巴组织共同组成了次级淋巴组织,这些器官 可有效的将血液、外周组织及粘膜组织来源的异物抗原截获。同时,这些 器官的结构都有利于载有抗原的树突状细胞、T细胞、B 细胞之间相互作用 引发适应性免疫应答的启动。输入淋巴管可使外周组织的组织液进入淋巴 61 结 。树突状细胞以及淋巴源性抗原通过输入淋巴管进入被膜下淋巴窦,在 62?63 髓质窦流入输出淋巴管 。高内皮静脉表达的外周淋巴结地址素、粘附分 ?64?65 子及 CCL21均可促进一定的 T细胞与 B细胞归巢 57 。载有抗原的成熟 树突状细胞与同源的 B 细胞、T 细胞作用,促进形成增殖、分化和生发中 66?67?68 心 。淋巴窦巨噬细胞是存在于淋巴结被膜下的特殊细胞,其特殊性在 69 于可以拦截淋巴引流液中的抗原成分,从而避免抗原的全身扩散 。不仅如 此,淋巴结间质细胞可以提呈内源性抗原,从而诱导自我反应性 T 细胞发 70 生清除性耐受 。针对侵入组织的病原的免疫应答因为引流淋巴结而受到保 ?71?72 护,从而避免了对肠道抗原的耐受及肠道抗原的播散 69 。 4 CTLA4-Ig 4.1 CTLA4-Ig在同种异体复合组织移植中的作用-18-第四军医大学硕士学 位论文原始 T 细胞的激活需要 2 个信号刺激:第一信号是抗原特异性信号, 它基于 T 细胞受体(TCR)的对抗原肽-MHC 复合物的识别,第二信号是 非抗原特异性信号,通过特异 T细胞受体与抗原提呈细胞(APCs)表达的 配体相配对连接形成共刺激分子而传递。抗原提呈细胞上的 B7分子家族与 T细胞表面相应配体 CD28和 CTLA4CD152相结合为 T细胞激活提供了一 个重要的共刺激信号,抗原与 T 细胞受体结合后若缺乏共刺激会导致 T 细 胞抗原特异的无反应性,称为失能,因此,对于 CD28/B7 通路的操控被视 为达到免疫抑制或免疫耐受状态的一条非常有潜力的途径。CTLA4-Ig最初 被作为 CD28/B7 通路(BMS-188667)的一个竞争性抑制物由 Bristol-Myers Squibb 发现,此后 CTLA4-Ig在一些独立实验室被分离出来,显示出具有抑 制 T 细胞依赖的抗体应答的功能,显著延长移植器官的存活时间,并在一 些模型中能诱导出长期供体特异性的免疫耐受,延缓自体免疫疾病的进展, 且在其它一些免疫学疾病模型中显示具有免疫调节功能。近来,CTLA4-Ig 用于银屑病(T细胞介导的皮肤疾病)和同种异基因骨髓移植的移植物抗宿 主反应的治疗已经进入一期临床试验阶段,但仍然缺乏使用 CTLA4-Ig的大 量临床随机治疗病例报道,然而其有效的免疫抑制效果以及其作用专一