【doc】犬Ⅱ型腺病毒蚀斑技术的建立和初步应用

【doc】犬Ⅱ型腺病毒蚀斑技术的建立和初步应用 犬?型腺病毒蚀斑技术的建立和初步应用 中国兽医杂志2002年(第38卷)第1期 犬?型腺病毒蚀斑技术的建立和初步应用 刘燕,赵永军,周卫国,尹惠琼 (1.中国人民解放军成都军区联勤部军事医学研究所,云南昆明650032;2.中国人民 解放军军需大学,吉林长春130062) 中图分类号:$858.292.65—4文献标识码出文章编号:05296005(2002)01—0017-01 犬?型腺病毒(CAV2)是犬喉气管炎的病原, 通常只引起轻微的呼吸道疾病-13,但是在其它病毒 或细菌继发感染的情况下可诱发较严重的肺炎,支 气管炎,扁桃体炎.,直接影响我国军,警犬和实验 犬的培育,训练和使用.本文拟建立一个广泛适用的 犬腺病毒蚀斑技术,为进一步以犬腺病毒为载体的 重组弱病毒疫苗的筛选提供一个有效的技术方法. 介绍如下. 1材料与方法 1.1病毒株和细胞株CAV一2弱毒株为中国人民 解放军军需大学军事兽医研究所国外联苗分离和 克隆的菌株.犬肾传代细胞(MDCK)由前者犬病研 究中心提供 1.2病毒的培养及病毒DNA的提取按常规方 法培养MDCK细胞,每瓶的培养面积为135cm,每 个瓶以10TCIDs.的CAV一2感染.当绝大多数出现 病变时(约35,40h),按文献[3]的方法提取病毒 DNA并测其浓度,贮存于一20C备用. i.3蚀斑技术的建立参照动物病毒学的方法一, 按常规方法培养MDCK细胞,每瓶的培养面积为 25cm,待长成单层后,用Hank'S液洗3次,加入 0.5ml的CAV一2病毒悬液,再加入2.5ml无血清 的细胞培养液,混匀,37C孵育2h,再用Hank's液 洗3次,空干,先将43,45C1营养琼脂(不含酚 红)注入细胞培养瓶内无细胞的一面,再将瓶缓慢翻 转,使营养琼脂覆盖在细胞面上,厚度约为2Film, 平放30,60rain,待营养琼脂凝固后,随后置37C 继续培养,于7天后,再加入含1/28000中性红的 1营养琼脂,每瓶3,4ml,置暗箱中继续培养 观察. 1.4蚀斑技术的应用按常规方法培养MDCK细 胞,待长成单层后,用Hank'S液洗3次,加入磷酸 钙一DNA悬液(其中CAV一2DNA100ug,制备方法 参见文献[5]),轻轻左右晃动一下培养瓶,使培养液 得以充分混合,置37C5CO及一定湿度的培养 箱中培养4h,倒掉培养液和沉淀物,用PBS(pH 7.4)将单层细胞洗一次,再照1.3的方法加人第一, 二层营养琼脂,继续培养以观察结果. 柠藕日期.2001c1—13 2结果 2.1CAV一2DNA的提取本实验采用Hirt的 方法,直接CAV2的MDCK细胞中提取病毒 DNA.获得了每平方厘米培养面积0.22g的 CAV一2DNA.此方法不需要超速离心,不需提纯病 毒,也不必反复冻融,省时省力 2.2CAV一2蚀斑技术的建立将CAV2病毒接种 MDCK细胞,37C感作2h加入第一层营养琼脂,7 天后加入第二层含中性红的营养琼脂.4天后每毫升病 毒悬液可获得的约400个左右的蚀斑即4o0PFU. 2.3CAV一2蚀斑技术的初步应用我们运用磷酸 钙转染技术,将CAV一2DNA导人了MDCK细胞. 通过已建立的CAV2蚀斑技术,再次获得了蚀斑. 证明了建立的蚀斑技术的实用性,同时为重组腺病毒 弱毒株疫苗的筛选提供了基本的实验技术和方法 3讨论 CAV一2弱毒株已作为疫苗广泛用于传染性犬 肝炎和狐狸脑炎的预防,但有时会引起机体轻微的 免疫抑制.与犬瘟热疫苗联合使用会导致动物对后 者的敏感性增强.甚至发病.如果用CAV一2载体 表达犬瘟热病毒的保护性抗原基因,就可以避免上 述问题;另外,该载体还可以用来构建多价疫苗.因 此本实验通过一系列试验,建立的CAV2蚀斑技 术,并用此技术成功地将CAV2DNA导人MDCK 细胞并获得了蚀斑,为今后以犬腺病毒为载体的重 组弱毒株疫苗的筛选提供了一种有效的方法.有很 大的实用意义. 参考文献 LljAppe【MandRob~onDSAmicroneutralizationteslforcanine distempervi—L』AmJVmRes.1973,34:l459l463. jDitehfle[dJ,MaePherson【.w.Zb0…A.?Associationo1 acanineenovirus(TorotoA26/61)withanoutbreako1 Laryngotraehei~s(KennelCough1[』:CanVetJ,l962.3} 238437. 一 3HirtB,,Be]ecttveextrac【i0nofpoLyomaDNAfrominfer-ted mousece【【cuhureEJ]JMo[Bio[.1987.28:365369 [4]殷震,胡景华.动物病毒学[M]北京科学出版社,1985 l98—203 ]金冬雁黎盂枫.等译.抒子克隆实验指甫[M]北京:科学出版 杜,1992.788—79l 【BlTl丑rdI.Risksa~sociatedwith…of【vaccine一J:.JAm VetMedAss,i990,l96(11)=l8j1?l858.