【doc】黄瓜嫩果白色果皮颜色遗传规律及其AFLP标记研究

【doc】黄瓜嫩果白色果皮颜色遗传规律及其AFLP标记研究 黄瓜嫩果白色果皮颜色遗传规律及其AFLP 标记研究 北方园艺2011(03):135,140?生物技术? 黄瓜嫩果白色果皮颜色遗传规律及其AFLP标记研究 孙晓丹,商庆梅,秦智伟 (1.东北农业大学园艺学院,黑龙江哈尔滨150030;2.黑龙江大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150086) 摘要:运用形态学观察,经典遗传性状分析,AFLP分子标记等技术在形态学和分子标记水 平上研究黄瓜嫩果白色果皮颜色遗传规律.结果表明:黄瓜嫩果白色果皮颜色性状是由1对隐 性基因"伽"控制的;AFI分子标记结果显示对于组合631(黄绿果皮类型)×IX)351(乳白果皮类 型),E35M51,E63M79,E63M91被划分为一个连锁 群;E33M49,E63M85,E43M61,E62M47, E37M85,E56M90被划分为另一个连锁群,各自总的遗传距离为51.3cM和114.6cM.对于组合 631(黄绿果皮类型)×DO351(乳白果皮类型),E37M3l,E49M7O,E55M90,E32M47,E36M60被划 分为一个连锁群,E34M59,E63M50被划分为另一个连锁群,各自总的遗传距离为132.1cM和 24.9cM.其中,在对组合631(黄绿果皮类型)×12)0351(乳白果皮类型)的F2群体进行标记过程 中,引物对FA3M61标记的遗传距离为5.2cM;在对于组合631(黄绿果皮类型)×翠玉8号(乳白 果皮类型)的群体进行标记过程中,引物对E34M59标记的遗传距离为5.6cM;表明这2个标 记与控制黄瓜果白色果皮的隐性基因"'连锁. 关键词:黄瓜;果皮颜色;遗传规律;AFLP标记 中图分类号:S642.2文献标识码:A文章编号:1001--0009(2011)03--0135--06 黄瓜(CucumissativusI.),是葫芦科(Cucurbitace— ae),幼果具刺的栽培种,1a生攀缘性草本植物.是世界 性的主要蔬菜之一,在世界上的栽培面积仅次于番茄, 位居第2位.黄瓜幼果脆嫩,果实含水量高,除富含钙, 镁,钾等元素;还含有促进神经发育的叶酸,改善新陈代 谢的VA,VC,含有起到稀释和降低血糖作用的铬元素; 黄瓜中的黄瓜酶有很强的生物活性,能有效地促进机体 的新陈代谢;同时,黄瓜含有少量蛋白质,脂肪,碳水化 合物和纤维素.因其可口且营养丰富,起源于喜马拉雅 山南麓的印度北部地区的黄瓜,随着民族的迁移,在世 界范围内广泛传播.通过数千年的自然选择,人工选择 和引变,形成了很多变种和生态型;再经过不断淘汰和 改良,发展成为现在的众多栽培品种.根据不同黄瓜果 实的特性,人们往往采用生食,熟食,腌渍的食用方式. 在取食过程中,黄瓜嫩果果皮颜色成为一个重要的参考 指标.所以,研究黄瓜嫩果果皮颜色的遗传规律具有重 要的现实意义. 现利用黄瓜嫩果绿色果皮系列黄瓜与黄瓜嫩果白 第一作者简介:孙晓丹(1974-),女,博士,讲师,研究方向为分子遗 传育种.E-mail:sunxiaodan2005@yahoo.com.cn. 通讯作者:秦智伟(1957一),男,博士,教授,博士生导师,现从事黄 瓜育种研究工作. 基金项目:国家"863计划"资助项目(2O06AA10压39). 收稿日期:2O1O一11--23 色果皮黄瓜为试验,按照Grilling完全双列杂交方 法I配制9个组合.根据形态学标记的结果,选取2个 最佳组合的F2群体作为遗传规律鉴定群体,对亲本和 F1,F2群体分离后代的果皮颜色进行了分析鉴定,并采 用AFI分子标记进行分析.主要目的是探明黄瓜嫩 果果皮颜色的遗传规律,开发实用有效的分子标记,提 高育种工作效率,为丰富黄瓜品种类型,选育具有不同 果皮颜色的黄瓜品种提供理论与实践依据. 1材料与方法 1.1试验材料 亲本1:D0351,黄瓜嫩果白色果皮品系,由东北农业 大学黄瓜课题组选育.亲本2:翠玉8号,华北型黄瓜, 黄瓜嫩果白色果皮品种.亲本3:631-1,华南型黄瓜,黄 瓜嫩果绿色果皮品系,由东北农业大学黄瓜课题组 选育. 1.2试验方法 1.2.1黄瓜嫩果白色果皮性状的形态学标记2004年 2月28日在东北农业大学园艺试验站选取3个亲本试 材进行育苗.于2004年4月27日定植于东北农业大学 园艺试验站大棚,当年7月采收F代杂交种子(组合见 表2).于2005年2月26日在东北农业大学园艺试验 站对符合试验设计要求的杂交组合的Fl代种子进行育 苗,2005年4月26日将Fl代群体定植于东北农业大学 实验基地日光节能温室,2005年5月10日在东北农业 大学实验基地露地定植.在开花期进行常花自交授粉, 135 ? 生物技术?北方园艺2011(03):135,140 生成F2;在开花期同时进行将Fl组合130351X631,翠玉 8号×631分别与各自白色果皮亲本即D0351与翠玉8 号进行回交,生成BC1.在6,7月收获F2种子和BC1 种子.2005年7月在东北农业大学实验基地加代,对F2 和BC1的表型进行调查,统计.每份材料定植36株,进 行观察和统计.2006年2月25日,对2005年l1月收获 的种子进行育苗,加大F2和BC1的单株数,进行育苗; 2006年7月,在东北农业大学园艺实验站自动化温室加 代,继续种植F2及13(21.2006年7月10日,对F2和 BC1进行育苗;2006年9月1日定植于东北农业大学园 艺实验站温室.逐一对植株进行植物形态学标记的记 各180株健康植株 录.2006年累计对2个组合的F2代 进行DNA样本采样,用于分子生物学研究.2007年 2月26日,对人选组合D0351×631及翠玉8号×631的 F2群体进行育苗,同时逐一对植株进行形态学标记的跟 踪.2007年4月15日在东北农业大学园艺实验站 蔬菜育种温室定植,继续逐一进行形态学标记的跟踪记 录.此F2群体,进行常花自花授粉,于2007年7月获得 F3种子.春季育苗保证夜温;夏季育苗控水防徒长.整 个栽培过程,尽量减少遮荫加大受光时间,诱使黄瓜果 皮颜色充分表达.对于黄瓜果皮颜色的目测结果;同一 批单株,确保果实形成期一致,减少因果实生长期不同 产生的差异.观测时,保证黄瓜果实受光条件相同,2人 或多人同测,确保结果客观. 1.2.2研究黄瓜嫩果白色果皮性状遗传规律群体构建 及DNA提取试验根据植物形态学标记及遗传分析结 果,确立2个亲本杂交组合(DO351×631,翠玉8号x 631)自交形成F2代分离群体,群体大小各为180个单 株.黄瓜种质由东北农业大学园艺学院黄瓜课题组提 供,杂交及繁育工作在园艺学院实验基地及东北农业大 学园艺实验站完成.DNA提取采用异丙醇沉淀法并进 行优化. 1.3AFIP分子标记 1.3.1用BsA法建立近等基因池参照Michelmore 等(1991)提出的BSA(Bulked-segregateanalysis)法,从 F2群体中随机选取黄绿色果皮单株,白绿色果皮单株, 白色果皮单株各10株构建黄绿色果皮表型,白绿色果 皮表型和白色果皮表型近等基因池,终浓度为5O,100 ng/~L. 1.3.2酶切连接体系建立及优化酶切连接体系成分 组成:DNA100~500lag,EcoRI(10U/gL)0.3ML, MseI(10U/L)0.3L,EeoRIadapter(5pmol/uL) 1.0L,Mseladapter(5pmol/肚L)1.0,ATP(10mM) 0.2L,10XBuffer2.0L,TlDNALigase1.0L,力?水 定容至50L.酶切连接方法为37"C水浴锅中进行酶切 与连接8h或过夜. 1.3.3预扩增体系建立及优化体系成分组成:酶切连 接模板5.0肛L,ddH2O7.2L,1O×PCRBuffer2.0L, 136 7zzq—polymerase(5U/f』L)0.2L,dNTP(2.5mM)1.6 L,MgCIz(25mM)2.0L,EO0-primer(50ng/~L)1.0 L,M00-primer(50ng/pL)1.0L总体积20.0L.预 扩增PCR反应程序:95?预变性5n'fin;94?变性30S, 56?退火30s,72"C延伸3OS,26个扩增循环;72"C延伸 7min.4?保存. 1.3.4选择性扩增体系建立及优化将预扩增产物稀 释2O,30倍,作选择性扩增模板使用.选择性扩增 PCR反应体系成分组成:预扩增稀释后产物5.0l上L, ddH207.2雎L,1O×f,cRBuffer2.0uL,Taq—polymerase (5U/灶L)0.2L,dNTP(2.5mM)1.6I上L,MgCI2(25 mM)2.0L,E-primer(50ng/gL)1.0L,M-primer(50 ng/~L)1.0L,总体积2O.0L.选择性扩增PCR反应 程序:95?预变性5mint梯度PCR扩增,94?变性30S, 65~56~C梯度降落扩增,每循环降落退火0.TC,12个循 环.4?保存体系稳定性检测,随机选择5对AF1P引 物并更换基因组DNA对优化后的黄瓜反应体系及反应 参数的可靠性和稳定性进行检测.每个引物设2次重 复.扩增引物序列见表1. 1.3.5聚丙烯酰胺电泳及银染在进行烯酰胺电泳前, 3%琼脂糖凝胶电泳检测.取8LPCR扩增产物和 2肚LLoadingBuffer(含0.25溴酚蓝,4O蔗糖),混匀, 点人含有0.5mg/L溴化乙锭的3琼脂糖凝胶中.用 1×TAE电泳缓冲液,在恒定100V电压下电泳约 30rain,然后用紫外凝胶成像系统观察照相.将选择性 扩增的产物2OI中加人变性上样缓冲液8tzL(98~甲 酰胺,10mMEDTA,0.25溴酚蓝,0.25二甲苯蓝), 95~C变性5min,然后在冰浴中迅速冷却,在预电泳后的 6的聚丙烯酰胺凝胶上继续电泳1.5h.采用Bio-lab 垂直板电泳'力?样量8L. 1.3.6AFLP标记结果统计分析采用"0,1"记录法. 将清晰可辨别的条带记录为"1",将同一位点无带记录 为"0".相应转换参照MAPMAKER/EXP3.0说明书 进行.标记与基因问的相互连锁关系采用MAPMAK— ER/EXP3.0分析.在MicrosoftExcel2000上,分别建 立作图群体180个单株的AFLP标记基因型数据库,F2 代带型表现数据库.应用MAPMAKER3.0计算基因 间遗传距离,分子遗传图谱由Excel绘制. 2结果与分析 2.1黄瓜嫩果白色果皮形态学遗传规律分析结果 表1的结果为2004年至2007年8月的田问形态学 标记调查.表2,3总株数为2005,2006,2OO7年3a调查 的总和.通过对亲本D0351,631,翠玉8号和F代及F2 代的形态学标记结果,将试验涉及的黄瓜果皮颜色及其 它性状的基因型及表现型进行分析,并对相应数据进行 统计分析.按着孟德尔的基因独立分配与连锁遗传规 律的原理和公式进行.首先用测验逐一分析参试性 状在杂交组合后代F,F2群体中的显隐性情况,以确认 北方园艺2011(03):135,140?生物技术? 这些性状是否符合显隐性单基因的遗传特点.再统计 每2对基因在杂交组合后代中各基因型的植株数分离 比率,用测验确定它们之间是否符合独立遗传.若 推断其存在连锁遗传关系,则进一步计算每2对基因间 的重组率.计算基因重组率R和标准误的公式参照刘 进生等的方法. 计算基因重组率R和标准误SE的公式为: F2相斥相: R—P=[((bc+ad).+ad(bc—ad))一(bc+ ad)/(bc—ad);SE一[(1一pZ)(2+P)/2n(1十 2p2). 其中a,b,C,d分别为基因型A—B一,A_bb,aaBm和 aabb在F2代的分离比率. 表2以测验各个性状在F2代的分离情况,表明 各个性状在后代显隐性比例为3:1,确定这些性状符合 显隐性单基因的遗传特点. 表3以测验各对基因控制的性状在F2代的分 离情况,分别出现了2种复杂的不符合孟德尔规律的分 离比和符合孟德尔规律的分离比.现作如下分析: (1)控制黄瓜果皮颜色遗传规律的2对基因问作用 效果分析: ?确定组合P1XP2基因型及表现型为:D035l(wwYGyg),631(WWYGyg).其遗传规 律如下: P:P1(DO351)×P2(631) 白色果皮(wwygyg)×黄绿色果皮(WWYgYg) F:黄绿色果皮(w_wYgyg) F2:黄绿色果皮(9w_.Y):浅绿色果皮(3W—ygyg):白色果皮(3wwYg__+1wwYgYg) 190:69:83 近似9:3:4 ?确定组合P2~P3基因型及表现型为:翠玉8号(wwYgyg),631(WWYgyg).其遗传 规律如下: P:P1(D0351)×P2(631) 白色果皮(wwygyg)×黄绿色果皮(gyg) Fl: F2: 黄绿色果皮(WwYgyg) 黄绿色果皮(9W__Yg-):浅绿色果皮(3W_ygyg):白色果皮(3wwYg_+1wwygyg) 150:47:59 近似9:3:4 经测验发现,将各组合在F2代出现的3种表现 型归纳为"果皮有绿色素"与"果皮无绿色素"2类,yg与 w符合显隐性单基因的特点,分离比为3:1.经测 验2对基因控制的性状在F2代的分离情况,发现这2对 基因不符合独立遗传的规律,分离比不是9:3:3:1,而 表现为9:3;4.为较明显的隐性上位表现分离比,是 质量性状遗传6种类型基因互作的一种. (2)控制黄瓜果皮颜色遗传规律的2对基因与其它 性状之间的遗传关系 在组合P2~P3中,发现控制黄瓜果皮颜色的2对 基因"Y,"W"与Tu(果实有棱状突起,Se(shapeoffruit end,暂定)问}分别为独立遗传关系,它们在各杂交后代 群体中的基因型分离比率,符合独立遗传的9:3.3:1 的分离比率. 表1黄瓜亲本基因型及有关性状 137 14o?生物技术? 北方园艺2011(03):135, n—E36M5 121一IIll Il—E63M7lI 一IlII— E6'3M9 U 图4组合631(黄绿果皮类型)×DO351(乳白果皮类型) 的F2群体标记遗传连锁图 试验获得的对组合631(黄绿果皮类型)×D0351(乳 白果皮类型)的群体的标记引物E35M51,E63M79, E63M91与E33M49,E63M85,E43M61,E62M47,E37M85, E56M90;和对组合631(黄绿果皮类型)×翠玉8号(乳白 果皮类型)的F2群体的标记引物E37M31,E49M70, FZ5M90,E32M47,E36M60,E34M59,E63M50中,引物 E43M61与引物E34M59与目的基因的遗传连锁距离分 别为5.2cM和5.6cM,可用于试验材料的苗期选择与鉴 定. EB3MS0 E34"v|59 图5组合631×Cuiyu8的F2群体标记遗传连锁图 3讨论 3.1利用形态学性状标记黄瓜嫩果白果皮遗传规律 试验采用东北农业大学黄瓜课题组的黄瓜种质 D0351(白色果皮,小果型)与翠玉8号(绿色果皮,华北 型)与631(绿色果皮,华南型)进行研究,通过对亲本,F】, 单株进行形态学标记,发现以下规律. 3.1.1控制黄瓜嫩果白色果皮颜色的基因为隐性基因 对"姗,'试验中黄瓜嫩果绿色果皮品系631与黄瓜嫩 果白色果皮品系D0351的组合,黄瓜嫩果绿色果皮品系 631与黄瓜嫩果白色果皮品种翠玉8号的组合.各组合 群体出现2种表现型,分别为绿色和白色;其分离比率 接近孟德尔单基因控制性状的分离比率3:1.其中绿色 表现型又可分为2个等级:绿色与浅绿色;按此级别的划 分进行统计,各表现型分离比率为9:3:4,而不是典型 的孟德尔分离比率9:3:3:1.表明控制黄瓜嫩果白色 果皮性状的基因"叫"对控制黄瓜嫩果果皮绿色的基因 " Yg"为隐性;并且""LU"与其它修饰基因问存在互作,互作 类型为隐性上位.是质量性状遗传6种类型基因互作中 的一种.这与前人的研究结果(侯峰,1999)不甚一致;但 与Youngner(1952)报道的黄瓜嫩果绿色果皮性状由"Yg" 基因控制,"Yg"对于控制黄瓜果皮颜色呈现深绿色的基 因表现为隐性,对于控制黄瓜果皮颜色呈现浅绿色的基 因表现为上位性以及Cochran(1938)报道的果皮颜色白 色"训"隐性于绿色的论断相近.在Elston(1973)提出了1 对主基因+多基因混合遗传模型的基础上,盖钧益 (1997)等提出主基因+多基因混合遗传模型看作是植物 数量性状遗传的普遍性模型,将单纯多基因,单纯主基因 看作是特例,并发展了一套QTL遗传模型的分离分析方 法,并将其应用到黄瓜果皮颜色遗传规律的研究中,该模 型不适用. 3.1.2控制黄瓜嫩果白色果皮遗传规律的基因"叫"与其 它性状之间的遗传关系在黄瓜嫩果绿色果皮品系631 与黄瓜嫩果白色果皮品系110351的组合与黄瓜嫩果绿色 果皮品系631与黄瓜嫩果白色果皮品种翠玉8号的组合 的群体中,均发现控制黄瓜果皮颜色的基因"Yg","' 与"Tu"(果实有棱状突起),"Se"(shapeoffruitend,暂命 名)问在代群体中的基因型分离比率分别为9:3: 3:1,符合孟德尔的独立遗传分离比率,即基因"Yg"与 " "LU"与基因""及"Se"之问的遗传关系为独立遗传.这 部分研究内容未见报道. 3.2AFLP分子标记结果 在连续4a的植物形态学研究和田问调查的基础 上,该试验认为,黄瓜嫩果绿色果皮的遗传模式为2对基 因共同控制的质量性状遗传,即基因互作中的隐性上位. 吴为人等认为,用混合分离分析(BSA)快速寻找连锁 的分子标记,然后用Mapmaker/Exp软件构建局域连锁 图,已成为定位单个主基因的常用方法.但由于基因互 作的遗传模式与单基因差异很大,因此针对单基因定位 的方法和软件不能简单地应用于互作基因的定位;目前 还没有提出快速筛选与互作基因连锁的分子标记的试验 方法以及同时分析多个分子标记与互作基因问连锁关系 的统计方法和计算机软件.试验中使用Mapmaker3.0/ Exp软件获得的结果,还可以继续完善. 参考文献 [1]池秀蓉,顾兴芳,张圣平.黄瓜无苦味基因的分子标记研究[J].园 艺,2007,34(5):1177—1182. 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InheredityofWhiteSkinColorCucumberImmatureFruitandAFLPAnalysis SUNXiao-dan,,SHANGQing-mei,QINZhiwei (1.CollegeofHorticulture,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,Heilongiiang150030;2.Life~qciences,HeilonNiang[Jniversity,Harbin,Heilongjiang 150086) Abstract:Bythemethodsofmorphologyobserve,analysisofclassicalgenetictraits,AFLPmolecularmarkers,the inheritancelawofwhiteskincolorcucumberimmaturefruitwerestudiedinthelevelofmorphologicalandmolecular markers.Theresultsshowedthatwhiteskincolorcucumberimmaturefruitcharacterswasarecessivegenefrom1"删" controI:AFLPmarkersshowedthatcombinationof631(yellowskintypes)× D0351(milkyskintypes),E35M51, E63M79,E63M91wasdividedintoa1inkagegroup;E33M49,E63M85,E43M61,E62M47,E37M85,E56M90was dividedintodifferentlinkagegroups.eachofthetotalgeneticdistanceof51.3cMand114.6c M.combinationof631 (yellowskintypes)× D0351(milkyskintypes),E37M31,E49M70,E55M90,E32M47,E36M60wasdividedintoa linkagegroup,E34M59,E63MS0wasdividedintodifferentlinkagegroups,thetotalgeneticdistanceofeach132.1cM and24.9eM.Which,inthecombinationof631(yellowskintypes)XD0351(milkyskintype)tomarkthecourseof F2populations,labeledprimersE43M61geneticdistancewas5.2cM;inthecombinationof631(yellowskintypes)× jade8(milkyskintype)tomarkthecourseofF2populations,labeledprimersE34M59geneticdistancewas5.6cM; thatthesetwomarkersandeontrolofwhiteskincolorcucumberim_maturefruitoftherecessivegene"w"wasIinkage. Keyword:cucumber;immaturefruitwhiteskincolor;inheritance;AFI 140