假单胞菌（Pseudomonas sp．cn4902）磷酸甘油磷酸酯酶基因克隆与鉴定

假单胞菌（Pseudomonas sp．cn4902）磷酸甘油磷酸酯酶基因克隆与鉴定 假单胞菌(Pseudomonas sp(cn4902)磷酸 甘油磷酸酯酶基因克隆与鉴定 第36卷第4期 2005年7月 海洋与湖沼 OCEANOLOGIAETLIMNOLOGIASINICA Vo1.36,No.4 July,2005 假单胞菌(Pseudomonassp.cn4902)磷酸甘油 磷酸酯酶基因克隆与鉴定* 刘广发张会永谢金镇 (厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室厦门361005) 提要采用随机克隆,功能筛选,逐次排除和同源比较的基因克隆新策略进行克隆假单胞菌 (Pse//,dott/ottsp.cn4902)磷酸甘油磷酸酯酶基因的研究.结果表明,该结构基因长819bp,与 铜绿假单胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶基因的核苷酸一致性达61.5%,氨基酸同源性为56.2%. 该基因已输入GenBank数据库,收录号AF348165.将该基因转化大肠杆菌,受体菌在含NaC1 1.Omo1/L的培养基中甘油含量升高2.9倍,最终菌浓度提高3.6倍.可见这是一个与生物耐 盐性相关的主基因,以其转化,培育耐盐农作物的前景十分光明. 关键词假单胞菌,磷酸甘油磷酸酯酶,耐盐性,甘油,基因克隆 中图分类号Q78 据统计,全球三分之一的土地已经或正在发 生盐碱化.我国有大约6700万ha(1亿亩)盐碱 化土地,随着人口的持续增加和工业发展,人均耕 地面积日趋减少已是不争的事实.如何开发利用 广阔的盐碱地来发展农业生产,提高粮食等作物 的产量已经成为一个关系国计民生的迫切问题. 提高农作物的抗逆性是作物育种的主要目标 之一(林栖凤等,1999;Zhu,2002).通过转耐盐 基因提高植物耐盐性是一条日益受重视的途径 (许祥明等,2000).虽然生物的耐盐性是由多基 因决定的综合性状,但近年来已陆续有克隆生物 的单个耐盐主基因并将它转入农作物,明显提高 其耐盐性的报道(Tarczynskietal,1993;Ruiz etal,2001).克隆基因的经典策略是构建基因组 文库或cDNA文库,然后用已知序列的探针筛库 (Sambrooketal,1989;王在照等,2002).该实验 比较繁琐且只能克隆已知基因.最近作者以随机 克隆,功能筛选,逐次排除和同源比较的策略(刘 广发等,2004)从极端耐盐的假单胞菌中克隆了 磷酸甘油磷酸酯酶结构基因并转化大肠杆菌,大 大提高了受体菌的耐盐性.磷酸甘油磷酸酯酶是 细胞内甘油代谢过程中的关键酶,它单向催化 3.磷酸甘油脱去磷酸基团产生并积累甘油 (Ginzburg,1987),因此磷酸甘油磷酸酯酶结构基 因是一个比较重要的直接与生物耐盐性相关的基 因.本研究中的克隆的基因源白海洋细菌.可以 认为,用类似的手段也可从海洋生物,尤其是原核 生物中克隆耐盐相关基因,从而为培育转基因耐 盐作物,广泛利用沿海滩涂种植经济作物奠定良 好的基础. l材料与方法 1.1假单胞菌基因组DNA来源及处理 碱法提取(Sambrooketal,1989)能在饱和盐 水中生存的假单胞菌(Pseudomonassp.cn4902,本 实验室分离保存)基因组DNA,用Sau3A工部分 酶切,将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳.在 紫外灯下切下含1—9kbDNA片段的凝胶,回收纯 化DNA(上海华舜生物工程有限公司试剂盒). 质粒载体pUC19经BamHI酶切,碱性磷酸酶处 理,电泳后回收.线性pUC19载体与假单胞菌基 因组DNA片段连接,转化E.coliJMl09.转化菌 液涂布于LB琼脂培养基(含Amp10(3'~g/m1),37oC *国家科技部转基因植物专项基金资助,J00一B一014号;厦门大学生命科学学院 细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部 重点实验室项目资助,2004106号.刘广发,副教授,E-mail:liugfls@xmu.edu.cn 收稿日期:2004—05—22,收修改稿日期:200501—18 3l4海洋与湖沼36卷 培养,任意挑取单菌落,提取其中质粒进行电泳观 察. 1.2假单胞菌耐盐相关DNA片段的获取 测定受体菌E.coliJM109对NaC1的最高耐 受水平.将转化子转接在高盐LB琼脂培养基上 (Amp100t~g/m1),37?培养2d,筛选耐盐转化子. 提取其中的重组质粒,酶切,电泳,回收插入的耐 盐相关DNA片段.将该片段分别进行不同酶切, 所得到的各个片段分别与pUC19质粒连接,转化 E.coliJM109,再涂布于高盐培养基上,确定与耐 盐相关的DNA片段. 1.3耐盐DNA片段来源的确认 克隆得到的重组质粒用BamH工完全酶切, 电泳,回收,以该片段作为探针进行DIG标记 (Roche公司),与假单胞菌基因组DNA进行 Southem杂交. 1.4DNA片段的测序与分析 将目的DNA片段与pUC19质粒连接,寄往上 海基康生物公司进行测序,对测序结果用DNAsis 和BLAST软件中的"Searchtheconserveddomain database"进行分析. 1.5磷酸甘油磷酸酯酶基因亚克隆及其耐盐性 和蛋白表达检测 根据测序结果分析,选定其中的ORF3,设计 一 对引物进行PCR扩增.回收PCR产物,与温控 表达载体pBV220(国家海洋局第三海洋研究所徐 洵院士惠赠)重组,转化E.coliER2566,测定转化 子的耐盐水平;培养12h后42~C热休克4h,检测 蛋白表达情况(李永明等,1998). 1.6耐盐转化子生长曲线的绘制及甘油含量的 检测 将耐盐转化子接入含NaC11.Omol/L的培养 基中,每隔6h测定一次培养液的OD值,绘制转 化子在高盐培养基中的生长曲线.根据王剑峰等 (2001)的方法略加修改检测转化子中的甘油含 量. 2结果 2.1假单胞菌部分基因组文库的构建 任意挑取27个转化子,提取其中的(重组)质 粒进行电泳分析.结果发现,多数质粒中含有大 小不同的外源DNA片段(图1),说明DNA连接和 转化的效果较为理想.但有的重组质粒似乎与第 一 列的对照处于同一条水平线附近,这或许说明 它们中无外源插入片段,或者外源片段的分子量 较小,难以看清.图1中各重组质粒经电泳后大 多出现2—3条带,这是天然共价闭合环型质粒与 同一种质粒由于提取过程中某些外因影响而形成 的开环型或线型质粒共存的缘故(吴乃虎, 1998). 12345678910 图1假单胞菌部分基因组文库中 部分重组质粒的电泳鉴定 Fig.1Theelectrophemgramofsomereconstruction plasmidsofpartialgenomiclibraryof Pseudomonassp.cn4902 1:质粒载体pUC19;2一l0:各个转化子中的(重组)质粒 2.2假单胞菌耐盐相关DNA片段的命名 由实验得知,E.coliJM109的最高耐盐性 (NaC1,下同)不超过4.5%,因此本实验将转化子 经含NaCI6.0%的LB琼脂培养基筛选,获得到1 株耐盐性比对照提高约1/3的耐盐转化子.提取 其中的重组质粒,发现其中插入了约8.8kb的 DNA片段(图2),命名为pZY.以数种限制性核 9.4kb—— 6.6kb—— 2.3kb—— Ml2 图2重组质粒pZY酶切鉴定分析 Fig.2Identificationofthereconstructionplasmid pZYdigestedbyXbaI+nI M:DNA/Hindmmarker;1:pZY/XbaI+nI (8.8kb,2.7kb);2:pUC19/BamHI(2.7kb) 4期刘广发等:假单胞菌(Pse,sP.cn4902)磷酸甘油磷酸酯酶基因克隆与鉴定315 酸内切酶对该片段进行酶切,亚克隆,再进行筛 选,最终将与耐盐有关的DNA区域定位在该片段 经BamHI酶切产生的一个约4.2kb的DNA片段 上(未示出),将该重组质粒命名为pZYX. 2.3耐盐相关4.2kb片段来源的确定 DIG标记亚克隆得到的4.2kb片段,与假单 胞菌基因组DNA进行Southern杂交.结果可见, 假单胞菌和重组质粒pZYX都出现明显的杂交信 .coliJM109未见杂交信号,说明4.2kb 号,对照E DNA片段的确源自假单胞菌(未示出). 2.4磷酸甘油磷酸酯酶基因序列及同源性分析 该4.2kb片段经上海基康生物公司进行测 序,发现包含3个完整开读框(未示出),其中 ORF3开读框(命名为PGP)长819bp.经与Gen— Bank数据库中的已知基因序列进行比较后发现, PGP开读框很可能是磷酸甘油磷酸酯酶结构基因 (图3).该基因已在美国GenBank数据库中登记, 收录号为AF348165. PGP:latga…?c-gaggagcctttcatgtcgcccaatccgcccctgcgcattctcgacggtatccgcctggtcgc~ttcg acctcgatggcacgctggI91 Paer:latgagcgctgcggagccgttct-tcgcc-'a-'cgcgcctgc-……cg…cg.tc-…tggtgatgttcgacctggatggcacgctgg~74 PGP:92lggattcggtccccgacc.tggccgctgccgtcga一一一?-tgc-cgccctgcgttcgctgggactc-一 gcgggcgtcgacgaagcgtcggtgl75 Paer:75lcganccgttcccgacc.:a-ccgccgcggtcgacagcatgctcgcca-gc-ttcgggcggccgccggcgggcatcga-gaag-gtc一-??l56 PGP:l76cgcgactgggtgggcaatg-cgtcccgcaagctggtggagcgcgccctgg?… aagcgctcga-cgcgcaagaca?cggacccggagg-257 P.aer:l57cgccagtggatcggtaacggcg'cacgcgtcctggtgcgtcgcgccctggccggaagca?tcgagcacg?acggcatcggtga—ggagga24l PGP:258??-cg-?gctcacga-ggcgtt--tc-tgcatcattatcgcctggc-gccttgtcgcgcgacgcgcctgtaccccggtgtgcg?cgaggcgctc34l P.aer:242aaccgaagc'cgcgctggcgttgttcatggaggcctat-gcc-gacagtcatg-cgctcaccgagg-tctaccccggcgt-cgtcgacaccctc329 PGP:342gaag?ggttgc-.gcgcacgcggtctgacgcggcg-ttcatcgccccgatcctcgaaacgctgggact430 - agcgcttcgtcgctccgctgctggatgagatgaagct418P.aer:330-aagtggct-caagcgcaa-cggcgtggaaatgg PGP:43lgag.cgact-ttttcgacct-gacgctgggcggcgattcgctggcggcgaagaagccagatccggcgcccttgctgcacgtggcatcccgtttc52l P.aer:419ggcg'ctattttcg.ctggatcatcggcggcgacaccctgccgcagcagaagcccgacccggcggcgctgctgttcgtg--atgaagat?505 PGP:522ggggtgacgccgag'?cg?---tctgtctgatggtgggggactcccggcatgacatcgaggccgggcggggtgccggattccgcaccctgg607 P.aer:506''ggctggcatcgagcccgaagatgcgt'tgttcgtcggtgactcgcgcaacgacgtgctcgccgccaaagctgccggcgtgcgctgcgcgg594 PGP:608cggtgccctacggctacaatcacggcgatccggtggcggcgag-?cgcgccggatgccatggt-?t-ga-atcgctgggggaactcgtttagtgt696 Paer:595cgctgacctatggctacaaccacggccggccgat— cgccgaggaagcgcc'ca-'ccctggtcatcgacaac?ctgcgcgacct-gct-.g…677 PGP:697ttttcgatacttgcgtctataaaaccaagtttttgataacgttctgctataacggacagcgttagatgattctgaatgccccct?cgtc--gcgtagag792 Paer:678….c….cttgcgccgaccaggcc…gctgagata~'gtgttgc…?cggac………-gactc-ccntccccctccgaccagcg-agat746 PGP:793CCCtcgcgttgatgcgtgacgtcaagcgttgg?cgatggtga833 Paer:747caagc?-cg?-tg—??-gcg?-gtcagcaaactctggatgaaggtca783 图3PGP开读框和铜绿假单胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶基因同源性比较 Fig.3ThehomologouscomparisonbetweenPGPOpenReadingFrameofPseudomonassp,c n4902andthegene 0fph0sph0glyc0latephosphataseofP.aeruginosa 注:P,一r即铜绿假单胞菌 图3表明,通过GenBank进行生物信息学分 析后发现,PGP开读框与铜绿假单胞菌(Pseu. domonasaeruginosa)的磷酸甘油磷酸酯酶(phospho. glycolatephosphatase,PGPase)基因的核苷酸一致 性达61.5%(570/927),两者之间核苷酸连续相同 的片段最长达20bp(以阴影表示),而且图中方框 所示的核苷酸区段两者的一致性高达9O.5%(38/ 42),6个以上核苷酸连续相同的片段有19个.由 此可见,PGP开读框应该是Pseudomonassp.4902 的磷酸甘油磷酸酯酶结构基因,而且图中的阴影 部分和划方框部分很可能是该基因的高度保守区 域.为了进一步验证上述PGP开读框性质的推 论,将PGP开读框推测的氨基酸序列和铜绿假单 胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶利用美国GenBank中的 "Searchtheconserveddomaindatabase"软件进行比 较后发现,两者的同源性可达56%.如果将PGP 开读框与其他6个物种的磷酸甘油磷酸酯酶的氨 基酸序列进行了比较(未示出),发现这7个物种 的氨基酸一致率也相当高.这进一步说明PGP 开读框很可能就是磷酸甘油磷酸酯酶基因. 2.5PGP开读框亚克隆及其蛋白表达 为了进一步以实验确认PGP开读框的功能, 3l6海洋与湖沼 根据测序分析,设计一对引物对其进行PCR扩 增.回收PCR产物,与温控表达载体pBV220重 组成pBVORF3(未示出),转化E.coliER2566,测 定转化子的蛋白表达情况(图4). 2 图4转化子E.coliER2566/pBVORF3 总蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图 Fig.4SDS—PAGEelectropherogramofthetotal proteinsoftransformantE.coliER2566/pBVORF3 M:蛋白分子量标志;l:对照E.coliER2566/pBV220; 2:转化子E.coliER2566/pBVORF3. 箭头指处为PGP开读框的表达蛋白带 经PCR扩增,凝胶电泳,在重组质粒pBVORF3 中的PGP开读框大小约为850bp(包含终止符后一 小段序列),与预期相符.以pBVORF3转化E.coli ER2566,提取转化子中的可溶性蛋白进行SDS— PAGE电泳后可以明显看到,转化子在大约28kD处 有一条清楚的表达带,其大小和PGP开读框推测值 基本相符(图4). 2.6转化子的甘油含量的测定 依据上述关于PGP开读框功能的分析,对转 化子中的甘油含量进行了测定(表1). 表1说明,在盐胁迫下(1.0mol/LNaC1),转化 子的甘油含量达到7.93fg/cell,约是对照组的2.9 倍(7.93/2.69).本结果进一步证明了PGP开读 框是磷酸甘油磷酸酯酶的结构基因.该基因转入 受体菌后使后者的甘油合成能力有了较大幅度提 高. 2.7转化子耐盐水平的测试 耐盐水平测试表明,转化子可在含NaC1高达 1.3mol/L的LB培养基中生长,而对照组最高耐盐 能力仅为1.1mol/L(未示出).转化子和对照在含 NaC11.Omol/L的LB培养基中的生长曲线见图5. 表1转化子E.coliER2566/pBVORF3的甘油含量 Tab.1TheglycerolcontentoftransformantE.coliER2566/pBVORF3 0612182430364248 t/h 图5转化子E.co/iER2566/pBVORF3在含NaC1 1.0mol/L的LB培养基中的生长曲线 Fig.5ThegrowthcurveoftransformantE.coliER2566/ pBVORF3growingintheLBnlediulncontainingNaC11.Omol/L —— E.coliER2566/pBVORF3: ……. E.coliER2566/pBV220,control 如图5所示,转化子被接入高盐培养基后仅 6h就开始明显增长,36h后基本达到了平衡期. 对照菌直到约24h后才逐渐缓慢生长,42h后达到 平衡期.转化子的生长速度和最终菌浓度远高于 对照组.达到生长平衡期时转化子的生物量约是 对照组的3.6倍.可以认为,正是转化子中拥有 若干拷贝的磷酸甘油磷酸酯酶结构基因,在质粒 载体启动子的带动下转录生成相应的mRNA,促 进了甘油的合成,从而提高了菌体甘油的含量,才 使转化子具有较高的耐盐能力. 3讨论 为了克隆极端耐盐的假单胞菌的耐盐相关基 因,作者采用随机克隆的策略,从构建该菌的部分 基因组文库人手,以转化子耐盐功能提高为筛选 手段,再经系列亚克隆,获得该菌的耐盐相关基 加????加? LLnnmnn 暑8 4期刘广发等:假单胞菌(Pse//,do~r/aff,$sp.cn4902)磷酸甘油磷酸酯酶基因克隆与 鉴定317 因,并经生物信息学查询(包括核酸同源性比较和 多肽保守区域分析)及转化子甘油含量和生长曲 线测定,终于基本确定该基因为磷酸甘油磷酸酯 酶结构基因.作者从检测转化子功能变化人手克 隆耐盐目的基因的技术路线,目标明确,方法简 捷,尚可进一步用于克隆其他耐盐相关基因.依 据同样的原理,本技术经改进,也可被借鉴作为克 隆其他基因的重要手段. 将外源基因组DNA片段插入系列载体中保 存是构建以质粒为载体的基因组文库的基本方 法.检测插入片段大小有以下三种手段:?不酶 切,?单酶切,?双酶切.不酶切指的是将提取出 的(重组)质粒不经酶切直接电泳,只要泳动速度 低于对照就初步表明原质粒中有片段插入.本方 法的优点在于不经酶切,快捷又经济.缺点是在 提取过程中由于外因(如碱变性,剧烈振荡)的作 用,有些质粒的DNA双链之一可能出现断裂,从 而由天然存在的共价闭合环状(CCCDNA)转变成 开环型(OCDNA),甚至完全断裂成线型(少量). 在凝胶电泳中,CCCDNA走在前,OCDNA落于后, 线型质粒位于两者之间(一般情况下),因此电泳 后常见"2—3条带",但它们实际上仍是同一种质 粒的不同存在形式,由此导致不易准确判别插入 片段的大小;如果以一种在原质粒上具有单一识 别位点的内切酶对重组质粒进行酶切,其产物将 可能是一条线性DNA.在Marker存在下与对照 一 同电泳,就能方便地知道插入片段的大小,但上 述酶切产物也可能不止一条(在插入片段具有上 述内切酶位点的情况下);同理,双酶切也存在类 似的情况,出现的酶切片段甚至更多.因此,经综 合考虑,作者选择了不经酶切直接电泳重组质粒 的途径. 机制十分 耐盐性状是一种典型的数量性状, 复杂,涉及多种基因,克隆并转化这些基因已经获 得了一些转基因耐盐作物,如p5CS基因(Kishor etal,1995),BADH合成基因(郭北海等,2000), mtlD基因(Tarczynskietal,1993),nhaA基因 (Ruizetal,2001)等.自然界耐盐生物极其多样, 可以预料,将可能从中克隆更多,更有效的耐盐相 关基因,并用这些基因对农作物进行遗传改造以 造福人类. 参考文献 王在照,相建海,崔朝霞,2002.编码中华绒螯蟹蜕皮抑 制激素基因的cDNA片段克隆和序列分析.海洋与 湖沼,33(4):432--438[WangZZ,XiangJH,CuiC X,2002.Molecularcloningandsequencinganalysisof cDNAencodingpartialputativemolt—inhibitinghormone fromthecrabEriocheirsinensis.OceanologiaetLimnologia Sinica,33(4):432--438] 王剑锋,修志龙,范圣第,2001.甘油转化生产l,3一丙二 醇发酵液中甘油含量的测定.工业微生物,3l(2): 33—35【WangJF,XiuZL,FanSD,2001.Determina— tionofglycerinconcentrationduringthefermentationof glycerintol,3-propanedio1.IndustrialMicrobiology,31 (2):33—35] 刘广发,谭静,陈启伟,2004.假单胞菌甘露醇一l一磷酸 脱氢酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达.海洋与湖 沼,35(2):l83—188[LiuGF,TanJ,ChenQW, 2004.Cloningandsequencingofmannitol一1-phosphatede— hydrogenasegeneofPseudomonassp.cn4902.Oceanologia etLimnologiaSinica,35(2):l83一l88J 李国凤,2O0O.植物抗盐机理的研究进展. 许祥明,叶和春, 应用与环境生物,6(4):387[xuxM,YeH C.LjGF.2O0O.Progressinresearchofplanttoleranceto saltstress.ChinJApplEnvironBiol,6(4):379—387] 李永明,赵玉琪,1998.实用分子生物学方法手册.北京: 科学出版社,69—77 吴乃虎,1998.基因工程原理.北京:科学出版社,l76一 l78 林栖凤,邓用川I,吴多桂等,1999.耐盐辣椒分子育种. 生物工程进展,l9(5):l9—23[LinXF,DengYC, WuDGetal,1999.Molecularbreedingofsalt—resistant Capsicumannuum.19(5):l9—23] 郭北海,张艳敏,李洪杰等,2000.甜菜碱醛脱氢酶(BADH) 基因转化小麦及其表达.植物,42(3):279—283 [GuoBH,ZhangYM,LiHJetal,2000.Transformation ofwheatwithageneencodingforthebetainealdehydedehy— drogenas(BADH).ActaBatanicaSinica,42(3):279— 283] GinzburgM,1987.Dunaliella,agreenalgaadaptedtosalt. 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Nowadays,gene— encodingofPGPasehasbeenperformedforhalophilicstrainPseudomonassp.cn4902isolatedfrom asaltpoolofextremelyhighconcentrationofNaC1,inXiamenCity,Fujian,byafunctionalgenescreeningtechnique describedpreviously(IAuetal,2004). BasedontheknowledgethatthePGPaseiscriticalfortheabilityofsalttoleranceinsomehalophilicorganisms, ourcloningstrategywasoptimizedasfollows.TotalgenomicDNAofPseudomonassp.cn4902wasextractedgently anddigestedpartiallybyarestrictionenzyme,e.g.EcoRI,andthenrunanagarosegelelectrophoresis.Thenthe DNAfragmentsrangedfrom1— 9kbwereretrievedandlinkedwiththelinearplasmidpUC19digestedbythesame enzyme.ThereconstructedplasmidswerefoundandtransformedtoE.coliJM101.Allthetransformantswereinocu— latedontheLBagarmediacontaining6.0%NaC1tofindthesalttolerancecolonies.Thesurvivedcolonieswerese— lectedandculturedinliquidsaltmediaagaintoextractthereconstructedplasmidsthatconsistofgene(s)responsible forsalttolerance.Afterdigestingandsubcloningstepbystep,ashortDNAfragment(openreadingflame)wasfinal— lyfound.Sequencingoftheinsertrevealedan819bpDNAwithanopenreadingflameencodingapeptideof272 aminoacidresidues.BoththeDNAanditsputativeproteinsequenceswereusedwiththe''SearchtheConserved DomainDatabase"usingtheBlastsearchoftheGenBankbyabioinfommticapproach,wefou ndthattheyarehighly homologoustothegeneofphosphoglycolatephosphataseofPseudomonasaeruginosa(61.5%and56.2%atDNA andaminoacidlevels,respectively). Theresultsmentionedaboveindicatethatthisshortsequencemaycodeforaphosphoglycolatephosphatase (PGPase)inPseudomonassp.cn4902.Tosatisfythisguess.welinkedthegenewithahighexpressiontemperature controlplasmidpBV220andtransferredthemintoE.coliER2566. NewtransformantswerefoundandcultivatedinaliquidsaltmediumuntilDD600to0.9— 1.0andthenallthe proteinsandglycerolcontentofthetransformantsweredetected.Aclearproteinbandofabout28kD,whichmatches totheproductoftheclonedgene,couldbeseenafterSDS— PAGEelectrophoresis.Ontheotherhand.itwasshowed thatglycerolcontentinthetransformantswas2.9timesmorethancontro1.Furthermore,thecharacteristicofsalttol— eranceofthetransformantcanbeobservedbetterinitsliquidculture.Thegrowthvstimeplotwasbuiltbyinoculat— ingbothtransformantandcontrolinliquidLBmediasuppliedwith1.Omol/LNaC1andshakingat37?.monitored bycheckingODevery6hin48hgrowthperiod.Thegrowthcurvewasrepeatedthreetimes.Wefoundthatthetrans— formantwasclearlyoutperformedthancontrolbythephenomenathattheformergrew6hafterinoculation,whilethe latterdidsomuchslowerafter24h.Finally.thegrowthrateanditsfinalbacteriaconcentrationweremuchgreater thanthecontrolgroup,whichis3.6-foldshigher.Thisresultindicatedthefunctionofthetransgenebyraisingsalt tolerancelevelofthetransformants. ItisbelievedthatthegeneweclonedisthePGPasegeneofPseudomonassp.cn4902.GenBankhasincluded itwithaccessnl1mbrAF348165 KeywordsPseudomonassp.,Phosphoglycolatephosphatase,Salttolerance,Glycerol,Geneclone