【doc】 传染性法氏囊病病毒五个抗原表位短肽的鉴定与序列分析

【doc】 传染性法氏囊病病毒五个抗原表位短肽的鉴定与序列分析 传染性法氏囊病病毒五个抗原表位短肽的 鉴定与序列分析 第20卷第5期 2005年10月 中国病毒学 VIR0L0GICASINICA 20(5):503-506 Oetober2005 传染性法氏囊病病毒五个抗原表位短肽的鉴定与序列分析 王永山h,范红结,李银.,周宗安,施正良,王选年,张改平 * (1.南京军区军事医学研究所,江苏南京210002;2.南京农业大学动物医学院,江苏南京210095;3.江苏省农业科学院兽医研究所,江苏南京 210014;4.河南省农业科学院生物技术研究所,河南郑州450002) IdentificationandSequencingofFivePeptidesContainingEpitopesof InfectiousBursalDiseaseVirus WANGYong—shan,FANHong—jie,LIYin.,ZHOUZong—an,SHIZheng—liang, WANGXuan—nian,ZHANGGai—ping (1.Milit”rMedicalInstit”teinNanjingMilitaryArea,Nanjing210002,China ;2.CollegeofVeterinaryMedicine,Nanjing AgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;3.InstituteofVeterinaryScience,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences, Nanjing210014,China;4.InstituteofBiotechnology,HenanAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou450002,China) Abstract:FivemonoclonalantibodiestoInfectiousbursaldiseasevirus(IBDV),HNF1,HNF7, B34,2B1and2G8wereusedtoscreenforbindingpeptidesfrompeptide12一 merphagedisplayli— brary.Afterthreeroundsofpanning(absorption—elution—amplification),s ixtypositivemono— clonalphages(twelveforeachmonoclonalantibody)wereselectedandthephagedisplayed12一 peptidesweredetectedandidentifiedwithindirectELISA(Avalue>1.OO)andcompetitiveinhi— bitionELISA(inhibitionrate>409/6).Theresultsindicatedthat12一 peptidescontainedepitopes ofIBDV.Thirty—fivepositivemonoclonalphagesweresequenced,andthesequencesofnucleo— tidesandaminoacidsofthefivedifferentepitopesonIBDVweredeterminedandanalyzed.Com— parisonwithsequencesofIBDVregisteredinGenBank,fourcontinuousamin oacidresiduesLeu— Ala-Ser—Proof2B1selectedpeptidewashomologywiththesequenceencodedbygenomefragment Afrom536to539.ButHNF1,HNF7,B34and2G8selectedpeptideshadnomorethanthree continuousaminoacidresiduessimilaritywiththesequencesofIBDV.Theresultsindicatedthat theepitope2B1waslinearandtheotherswereconformation—dependent. Keywords:Infectiousbursaldiseasevirus(IBDV);Epitope;Analysis 摘要:以5株传染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)单克隆抗体HNF1,HNF7,B34,2B1和 2G8作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行3轮”吸附一洗脱一扩 增”淘洗,从每株单克隆抗体筛选到的噬菌斑中 随机挑取12个单克隆蓝色噬菌斑,合计6O个,用间接ELISA,A 值大于1.00;用竞争抑制ELISA分析,单克 隆抗体和IBDV抗原均能竞争抑制筛选12肽与固相包被单克隆抗 体的反应,抑制率大于4O,表明在该12肽内 含有IBDV抗原表位.选取35个单克隆噬菌斑,测定噬菌体gill部分 基因的核苷酸序列,确定了这5个含有不同 IBDV抗原表位12肽的核苷酸和氨基酸序列.进一步将其与 GenBank中IBDV基因组编码蛋白的氨基酸序列进 行比较,发现2B1筛选肽有4个连续氨基酸残基Leu—Ala—Ser—Pro 与IBDV基因组A片段编码多聚蛋白的第536— 599氨基酸残基一致,推测2B1为线性表位;而HNF1,HNF7,B34和2G8筛选肽均没找到有3个以上连续氨基酸 残基与IBDV蛋白序列相同之处,推测可能是构象依赖性表位. 关键词:传染性法氏囊病病毒(IBDV);抗原表位;序列分析 中图分类号:R373文献标识码:A文章编号:1003—5125(2005)05—0503,04 收稿日期:2005—03—17,修回日期:2005—04—11 *基金项目:江苏省自然科学基金(BK2003011);国家自然科学基金(30571371) **通迅作者:王永山(1963一),男,山东省籍,研究员,博士,主要从事动物病毒学与分子生物学研究. Correspondingauthor.Tel:025—86050698;E—mail:wangyongshan2OO 1@yahoo.corn.cn 504中国病毒学第2O卷 传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病 毒(Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)所致,以 侵害雏禽淋巴组织尤其是中枢免疫器官——法氏囊 为主要特征的传染病. IBDV属双RNA病毒科,基因组包括大(A)小 (B)两个片段,有五种病毒蛋白:VP1,VP2,VP3, VP4和VP5.VP1由B片段编码,为病毒自身编码 的依赖RNA的RNA聚合酶.其它四种病毒蛋白 由A片段编码的多聚蛋白加工而成,VP2和VP3 是病毒的主要结构蛋白,构成病毒衣壳,VP2相对 含量较多,中和抗原表位主要存在于VP2上,且多 为构象依赖性,用构象依赖性中和抗原表位诱导的 中和抗体能被动地保护宿主不受IBDV感染,VP4 为病毒自身蛋白酶,VP5的功能尚不明确_】.大 肠杆菌表达的VP2免疫原性较差,表明VP2的后 加工过程对VP2的结构形成至关重要口]. 对IBDV的抗原表位分析已有进展.目前,在 VP2上至少已经发现了3个构象依赖性中和抗原 表位,在VP3上也发现了1个线性中和抗原表位 c4-63 ,更多的表位有待进一步分析. 本研究旨在运用国内建立的5株IBDV单克隆 抗体(mAb),从噬菌体展示随机12肽库中筛选含 有IBDV抗原表位的短肽,分析其序列,为IBD多 表位疫苗的研制奠定基础. 1与方法 1.1单克隆抗体 IBDV单克隆抗体HNF1和HNF7由河南省 农业科学院生物技术研究所制备;B34由中国兽药 监察所陈光华研究员惠赠;2B1和2G8由本课题组 制备;B34和2G8对IBDV具有中和作用口.;单 克隆抗体腹水经盐析和DEAE一纤维素纯化.HRP一 羊抗M13单克隆抗体为AmershamPharmaciaBio— tech公司产品. 1.2随机肽库 噬菌体展示随机12肽库试剂盒(Ph.D.一12 PhageDisplayPeptideLibraryKit)购自美国NEW ENGLANDBioLabs~公司.随机肽库噬菌体滴度 1.5×10”pfu/mL,随机多样性2.7×1O.转化子, 受体菌E.coliER2738,测序引物(一96gIIIsequen— cingprimer):5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG一 3. 1.3肽库的生物淘洗 所用溶液无菌处理,并在空气净化条件下进行. 分别用纯化单克隆抗体HNF1,HNF7,B34,2B1和 2G8包被微孔板,浓度100/~g/mL,15%L/~L,4?过 液,用1牛血清白蛋白(BSA)封闭,PBST(含 0.1Tween一20)洗涤6遍,加入含2×10pfu噬 菌体的肽库原液,室温置1h;PBST洗涤10遍;用 100/~L0.2mol/LGly-HC1(pH2.2)洗脱8min;加入 15L1mol/LTris—HC1(pH9.1)中和洗脱液.用常 规方法滴定洗脱液中的噬菌体,计算噬菌体的产出 率:产出率()一洗脱噬菌体数(Output)/淘洗用 噬菌体数(Input)×100.将洗脱液接种到20mL 新鲜培养的E.coliER2738培养液中,37?振荡培 养4.5h,4.C,10000r/min离心10min,收集上清 液,加入1/6体积的PEG/NaC1溶液(含20 PEG8ooo和2.5mol/LNaC1),4?过液,4?,10000 r/min离心15min,用1mLTBS重悬沉淀,按照上 述方法用PEG/NaC1再次沉淀,最终用200~LTBS 重悬沉淀,滴定后置4?保存.将单克隆抗体的包 被浓度降低至50~g/mL,洗涤用的PBST中 Tween一2O的浓度提高到0.5,按上述步骤再淘洗 2次.经过3次淘洗后,从每株单克隆抗体筛出的 噬菌斑中随机挑取单克隆蓝色噬菌斑12个,5株单 克隆抗体合计60个(12个单克隆噬菌斑×5株单克 隆抗体),扩增.用免疫学方法分析筛选肽与IBDV 抗原表位的相关性. 1.4噬菌体短肽的ELISA检测 分别以5株单克隆抗体HNF1,HNF7,B34, 2B1和2G8包被ELISA板,包被浓度5~tg/mL,1 BSA封闭,加入对应单克隆抗体筛出的单克隆噬菌 体扩增培养物,室温放置60min,洗涤,加入HRP一羊 抗M13单克隆抗体,进行间接ELISA.检测在筛 选12肽内是否存在IBDV单克隆抗体结合位点. 1.5单克隆抗体竞争抑制检测 为验证筛选肽的特异性,分别以5株单克隆抗 体包被ELISA板,以对应游离的单克隆抗体作为竞 争抑制物,分别与对应单克隆抗体筛出的噬菌体培 养物共同反应60min,洗涤,加入HRP一羊抗M13单 克隆抗体,进行竞争抑制ELISA.计算抑制率,分 析筛选12肽与单克隆抗体结合的特异性. 1.6IBDV竞争抑制检测 与上述单克隆抗体竞争抑制检测相似,只是以 游离的IBDV作为竞争抑制物,分别与对应单克隆 抗体筛出的噬菌体培养物共同反应.计算抑制率. 进一步验证筛选12肽内的IBDV抗原表位. 1.7序列分析 根据ELISA和竞争抑制试验分析结果,从每株 单克隆抗体挑出的12个单克隆蓝色噬菌斑中选定 王永山,等:传染性法氏囊病病毒五个抗原表位短肽的鉴定与序列分 析505 7个,5株单克隆抗体合计35个(7个单克隆噬菌斑 ×5株单克隆抗体),制备单链DNA模板,测序,分 析.进一步将其与GenBank注册的IBDV基因组 编码蛋白的氨基酸序列…:进行比较.测序由上海 博亚公司完成. 2结果 2.1肽库的生物淘洗 分别以HNF1,HNF7,B34,2B1和2G8作为筛选 分子,对噬菌体12肽库进行3轮”吸附一洗脱一扩增”淘 洗.3轮淘洗的产出率呈指数增加,从第3轮淘洗得 到的噬菌斑中随机挑取12个,合计6O个(12个单克 隆噬菌斑×5株单克隆抗体),扩增,扩增后的噬菌体 滴度均在10pfu/mI以上.5株单克隆抗体在肽库 的生物淘洗过程中没有明显的差异(表1). 表1用IBDV单抗对噬菌体展示12肽库的生物淘洗 Table1Bio—panningofphagedisplay12-peptidelibraryby monoclona1antibodytoIBDV #Approximately(Unit:pfu).Withoutevidentdiversityinthe panningforfivemonoclonalantibodyHNF1,HNF7,B34,2B1and 2G8. 2.2噬菌体短肽的ELISA检测 用5株单克隆抗体作为筛选分子,分别从第3 轮淘洗得到的噬菌斑中随机挑取12个扩增,合计 6O个单克隆噬菌斑(12个单克隆噬菌斑×5株单克 隆抗体),用问接ELISA检测,A值均大于1.O0. 表明,在5个筛选12肽内均含有单克隆抗体结合位 点. 2.3单克隆抗体竞争抑制检测 5株单克隆抗体在试验中的抑制率均可达到 4O.表明,游离单克隆抗体可以竞争抑制筛选肽 与固相包被单克隆抗体的反应.由此证明:在5个 筛选12肽内均含有单克隆抗体特异结合位点. 2.4IBDV竞争抑制检测 IBDV抗原在试验中的抑制率达到4O以上. 表明,游离IBDV也可以竞争抑制筛选12肽与固相 包被单克隆抗体的反应.进一步证明:在5个筛选 12肽内均含有IBDV抗原表位. 2.5序列分析 将测定的35个单克隆噬菌体(7个单克隆噬菌 体×5株单克隆抗体)gIII基因部分核苷酸序列用 生物信息学软件DNASIS(DNASISforWindows V2.5,HitachiSoftwareEngineeringCo,Ltd.)分 析并进一步推导筛选12肽的氨基酸序列.5个含 有不同IBDV抗原表位12肽的序列分别如下: HNFlCCTAAGACTCATAATTCTGGTCGTTCTAATGTGGAT ProLySWhrHiSAsnSerGlyArgSerASIIValAsp HNF7ACGCTTCAWCTGCCGCAWTTGTGGCGGCCTCTTTCT WhrLeUHiSLeUProHiSLeUTrpArgProLeuSer B34CATAATGCGAAGWATGTGTCGGCTGAGTCTTGGGGG HiSAsnAlaLysWYrValSerAlaGlUSerTrpG1Y 2B1CATCCGGATAGTATTCATCCGTTTCTGGCGWCTCCT HiSProASPSerIleHiSProPheLeuAlaSerPro 2G8GATACTCTTCATGGGCATGGWWWWACWAATTGGTTT ASPWhrLeuHiSG1YHiSG1YPheWhrAS1/WrpPhe 将上述5个12肽的氨基酸序列分别与GenBank中 IBDV基因组A片段(GenBank登录号:AF443294, AF362776,AF454945)和B片段(AF362774, AF455136)编码蛋白的氨基酸序列进行比较,发现 2B1筛选肽有4个连续氨基酸残基Ieu—Ala—Ser— Pro与IBDV基因组A片段编码多聚蛋白的第536— 599氨基酸残基一致,推测2B1为线性表位;而 HNF1,HNF7,B34和2G8筛选肽均没找到有3个 以上连续氨基酸残基与IBDV基因组编码蛋白氨基 酸残基相同之处,推测可能是构象依赖性表位. 3讨论 IBD是危害养鸡业的主要传染病之一,变异株 和超强毒株的出现使该病的防控难度加大,目前虽 然研制了多种商品化的弱毒疫苗和灭活疫苗,但其 安全性和制造工艺尚有不尽人意之处,如为抵抗超 强毒的攻击,使用中强毒力的毒株研制活疫苗,给 IBD的防控带来极大的隐患,灭活疫苗存在着抗原 制备的困难.因此,国内外学者一直在探索免疫原 性好且安全性高的新型疫苗,从重组亚单位疫苗[3] 506中国病毒学第2O卷 到病毒载体疫苗和核酸疫苗u,均存在着表达 量低,保护率低,免疫程序复杂以及难以工业化生产 等缺点. 蛋白质分子上的抗原表位(亦称抗原决定簇)是 蛋白质抗原性的物质基础.近年来研究发现的模拟 抗原表位,本质上是构象依赖性表位,虽然模拟表位 的氨基酸顺序与蛋白质分子一级结构的氨基酸顺序 截然不同,却可以引起特异性的免疫反应,因此,在 免疫应答中的地位极为重要.用常规基因克隆表达 方法研制的重组亚单位疫苗,尽管人们采用多种方 法进行复性,仍然难以完全恢复到天然的构象,导致 部分构象依赖性抗原表位丢失,其中可能是中和抗 原表位,从而影响到机体产生完全有效的保护性免 疫应答,这是影响其免疫效果的重要原因. 噬菌体展示技术已经广泛用于病毒的抗原表位 分析,随着对病毒抗原表位研究的进展,已经发现在 一 些分子量较大的病毒保护性免疫原中除与免疫保 护有关的中和表位外,还有非中和表位,抑制性表位 甚或是毒性表位,这些表位会影响疫苗的免疫效果. 已有实验l_1显示,单一中和表位的免疫原性较弱且 保护活性不完全,串联的抗原表位可以增强抗原的 免疫原性,因此发展多表位疫苗有利于提供更完全 和更有针对性的免疫保护.但并不是拷贝数越多越 好,只有串联适量的拷贝数,才能够刺激机体产生最 大量的中和抗体.此外,抗原表位,连接方法以及表 达系统等都会影响到多表位疫苗的免疫效力,表位 的加工效率也是影响多表位疫苗免疫原性的重要变 量.待这些问题解决后,该技术将成为研制基因工 程疫苗的新方法. 本试验用5株IBDV单克隆抗体从噬菌体展示 随机12肽库中获得了5个含有IBDV抗原表位的 短肽,其中1个线性表位,4个构象依赖性表位,佐 证了有学者认同的在病毒抗原中存在着大量的构象 依赖性表位. 参考文献 [1]FaheyKJ,McWatersP,BrownMA,etal,Virus—neutrali— zingandpassivelyprotectivemonoclonalantibodiestoinfec— tiousbursaldiseasevirusofchickens[-I].AvianDis,1991, 35:365-373. 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