寒露林蛙的核型和Ag_NORs研究

寒露林蛙的核型和Ag_NORs研究 寒露林蛙的核型和 Ag2NO Rs研究 3 3 王丽 , 陆宇燕 , 李丕鹏 , 周正彦 , 王勇 ()沈阳师范大学中国特有两栖爬行动物繁育和保护研究中心 ,辽宁省生物进化与生物多样性重点 ,沈阳 110034 摘要 :采用常规骨髓细胞制片法对产于湖南省双牌县的寒露林蛙的核型及 NOR s位点进行了观察和分析 。结 果表明寒露林蛙与分布于我国南方的其他林蛙相同 : 2 n = 26 , N F = 52,为 5 + 8 核型模式 。寒露林蛙核型为 14M +10SM + 2 ST,无次溢痕 , NOR s位于第 11对染色体长臂的中部 。通过比较分析我国 2n = 26的 6种林蛙的核型等细胞 遗传学信息 ,本文结果支持形态分类和分子系统发生的研究结论 ,认为寒露林蛙是一有效种 。 关键词 : 寒露林蛙 ; 核型 ; A g2NOR s; 林蛙 ; 中国 ( ) 文献标识码 : A 文章编号 : 1000 - 7083 2009 05 - 0704 - 03 中图分类号 : Q95915 C y togen e t ic S tud ie s on the Han lu Brown Frog ( R a n a h a n lu ica ) 3 3 WAN G L i, LU Yu2yan, L I P i2p eng, ZHOU Zheng2yan, WAN G Yong ( Cen te r fo r Ch ine se Endem ic H e rp 2b reed ing and Con se rva tion R e sea rch and L iaon ing Key L ab of Evo lu tion and B iod ive rsity, )Shenyang No rm a l U n ive rsity, Shenyang 110034, Ch ina ( Abstract: In this wo rk, we p resent fo r the first time cytogenetic data of the Hanlu brown frog R ana han lu ica Shen et a l1, ) 2007 co llec ted from the typ e loca lity, Shuangp a i Coun ty, H unan P rovince, sou the rn Ch ina. The ka ryo typ e and NOR loca l2 itie s we re de sc ribed and comp a red w ith o the r Ch ine se b rown frogs. R ana han lu ica had sim ila r cytogene tic info rm a tion to the o the r b rown frogs wh ich had 26 ch romo som e s: 2 n = 26 w ith 5 la rge2sized p a irs and 8 sm a ll2sized p a irs, and N F = 52. The ka ryo typ e of R. han lu ica wa s 14M + 10SM + 2ST, and no seconda ry con stric tion wa s ob se rved. A g2NOR s we re loca ted a t in te r R. han lu ica suppo rted the taxonom ic In comp a rison w ith o the r b rown frogs from Ch ina, the cytogene tic da ta from 11q. and mo lecu la r p hylogene tic ana lysis fo r th is sp ec ie s and ind ica ted tha t R. han lu ica wa s a va lid sp ec ie s. Key word s: R ana han lu ica; ka ryo typ e; A g2NOR; b rown frog; Ch ina ()(林蛙 W ood frog主要分布于欧亚大陆 ,它们以 林蛙属的新种 ,与昭觉林蛙和峨眉林蛙相似 沈猷慧 ) 具有背侧褶 、鼓膜部位有黑色斑块 、非繁殖期主要生 等 , 2007 。为了进一步明确寒露林蛙的细胞分类学 活于山林 中 , 与 其他 无尾 两栖 类 有 着 显 著 的 区 别 。 特征及其与相似林蛙的关系 , 本文对 其 核型 和 A g2 因其 体 色 大 部 分 为 棕 褐 色 , 而 又 被 称 之 为 棕 蛙 NOR s进行了研究 。 () B rown frog。林蛙属 R ana 已知有 40余种 ,由于一 与方法1 些物种在外部形态特征上具有很大的相似性 ,故给 寒露林蛙采自湖南省双牌县 , 2 ?1 ?。染色体 (分类研究带来了很大的困扰 刘承钊等 , 1961; 谢锋 (标本制 作 按 常 规 骨 髓 细 胞 蒸 汽 固 定 法 吴 政 安 , 等 , 1999、2000; Kim et a l1, 2002; 陆 宇 燕 , 李 丕 鹏 , ) ) 2005; F ro st et a l1, 2006 。近年来随着对两栖类动物 1982 ; A g2NOR s染色采用快速 、简便的核仁组织区 () 普查的深入 ,不断有发现林蛙新种的报道 ,并对其形 的一步 染 色 法 谭 安 鸣 等 , 1986 ; OL YM PU S B 50 2 态特征 、细胞遗传 、蛋白质和 DNA 分子水平等方面 D P70 数 码摄 像显 微镜 观 察 , 计数 100 个中 期 分 裂 ( 相 ,确定其二倍体数 ;核型分析选择 10 个分散好 、图 做了大量深入的探讨 陆宇燕 ,李丕鹏 , 2002、2005; , 2007;沈猷慧等 , 2007; Che et a l1, 像清晰的分裂相 ,拍照 、放大 、测量 ,利用 SPSS 13. 0 李树深 2007; L u et ) 统计软件计算染色体的相对长度 、臂比和着丝粒指 a l1, 2007; L i et a l1, 2008 。 数 ,并进行数据的统计分析 。染色体类型的划分参 寒露林蛙 R ana han lu ica 是 2007 年发表的一个 (型染色体 ,但在相对长度上存在着明显的差异 差值 2 结果 ) 3. 56 ,故 极 易 区 分 ; 对 于 B 组 的 8 对 染 色 体 来 在 2. 1 体细胞染色体数目 (说 ,尽管在相对长度的总数值上较为接近 差值仅为 2 ,相邻染色体在相对长度的数值上仍然具有显著性 通过对 100 个骨髓细胞中期分裂相的观察与计 ) 2 n = 26 , N F = 差异 , P < 0. 05 , 但它们间隔性地 分别 属 于 M、SM ,寒露林蛙的体细胞染色体数目为 数 52。和 ST,因此还是易于区分 。 2. 2 核型分析在所观察寒露林蛙的分裂相中 ,均未发现雌 、雄 寒露林蛙染色体组型如图 1 和表 1。由表 1 可 异形性染色体 ,也没有发现有较为明显的次缢痕 。 见 ,除 No s. 2、4、7、10、12 为 亚 中 部 着 丝 粒 染 色 体2. 3 银染 ( )( )银染结果显示 :在 No. 11长臂中部 ,存在着一对 SM 和 No. 9 为亚端部着丝粒染色体 ST外 ,其余 () ()7 对均为中部着丝粒染色体 M 。根据染色体相对 明显深染的斑点 ,即核仁组织区 NOR 的存在位点 , in te r () 标记为 11 q图 2 。长度 ,可将寒露林蛙的染色体分为 A、B 两组 。A 组 包括 No s. 1 ,5 , 为 大 型 染 色 体 ; B 组 包 括 No s. 6 , 13 ,为小型染色体 。核型模式为 : 14M + 10 SM + 2 ST。 图 1 寒露林蛙的核型 F ig. 1 Karyo typ e of R ana han lu ica 表 1 寒露林蛙核型数据 Ta b le 1 D a ta ana ly sis of ka ryo type in R a n a h a n lu ica 图 2 寒露林蛙银染 相对长度 着丝粒指数 臂比 类型 箭头示 NOR s位于第 11 对染色体长臂的中部No. ( ) ( ) () ( ) RL C IAR Typ e F ig. 2 Silve r2sta ined karyo typ e of R ana han lu ica A rrow s po in t to NOR s in the cen trom e ric region s on the long a rm s of ch ro2 1 ?1. 27 ?2. 30 ?0. 12 14. 53 43. 63 1. 30 M mo som e 11 11. 98 ?0. 81 35. 21 ?2. 09 1. 85 ?0. 17 SM 2 11. 11 ?0. 98 40. 46 ?3. 92 1. 49 ?0. 23 M 3 10. 71 ?0. 66 32. 56 ?3. 49 2. 10 ?0. 32 3 讨论 SM 4 9. 77 ?0. 53 42. 08 ?2. 90 1. 39 ?0. 17 M 5 6. 21 ?0. 41 39. 15 ?1. 77 1. 56 ?0. 11 分布于我国大陆南方的林蛙主要有镇海林蛙 、 M 6 5. 85 ?0. 38 31. 95 ?3. 44 2. 16 ?0. 34 ()峨眉林蛙 、昭觉林蛙 费梁等 , 2005; L i et a l1, 2005 5. 58 ?0. 40 39. 24 ?2. 63 1. 56 ?0. 17 SM 7 ()以及近年来发表的新种寒露林蛙 沈猷慧等 , 2007 5. 36 ?0. 42 24. 54 ?4. 12 3. 17 ?0. 63 M 8 ()和猫儿山林蛙 L u et a l1, 2007 等 ,它们同属于长肢 5. 32 ?0. 42 33. 60 ?2. 34 1. 99 ?0. 22 ST 9 4. 98 ?0. 35 38. 75 ?2. 87 1. 59 ?0. 20 () 林蛙种组 费梁等 , 2005;陆宇燕 ,李丕鹏 , 2005 。分 SM 10 4. 41 ?0. 43 34. 62 ?4. 11 1. 93 ?0. 34 子系统发生研究表明寒露林蛙与镇海林蛙 、峨眉林M 11 () 蛙和昭觉林蛙的关系较近 沈猷慧等 , 2007 。 已有SM 12 研究表明林蛙根据体细胞染色体数目 ,可 13 4. 21 ?0. 42 40. 65 ?2. 67 1. 47 ?0. 17 M ( 分为 2 n = 24 和 2 n = 26 两 大 类 陆 宇 燕 , 李 丕 鹏 , ) 在 A 组的 5对大型染色体中 , No. 1 由于其相对 2005;李树深 , 2007 。本文结果首次表明寒露林蛙 2 n = 26 , N F = 52 ,为 5 + 8 核型模式 ,与 2 n = 26 的林 长度是整个染色体中最大的 ,与 No. 2 相差 2. 55 ,且 () 两者分别属于 M 和 SM 型 ,故极易区分 。虽然 No s. 2 蛙的核型特点相同 李树深 , 2007 。此外 ,与寒露林 蛙邻省分布的猫儿山林蛙 R ana m aoershanensis也具 ,5染色体在相对长度的数值上较为接近 , 但由于 ( ) 有 2 n = 26 的特征 L u et a l1, 2007 , 这说明我国南它们间隔着分别属于 M 和 SM 型染色体 ,所以也较 705 多样性研究的意义 [ J ]. 四川动物 , 24: 271 ,275. ( 方的背侧褶平直或微弯曲的林蛙 长肢林蛙种群物() 沈猷慧 ,江建平 ,杨道德. 2007. 中国林蛙属 无尾目 : 蛙科 一新种 2 )( ) 种 具有相同的染色体数目 2 n = 26 。( ) 寒露林蛙 R ana han lu ica sp. nov[ J ]. 动物学报 , 53 3 : 481 ,488. 谭安 ( 鸣 ,吴 政 安 , 赵 尔 宓. 1986. 快 速 、简 便 的 核 仁 组 织 者 区 A g2 对我国 2 n = 26 的林蛙细胞分类学研究已积累 )( ) NOR s的一步染色法 [ J ]. 两栖爬行动物学报 , 5 1 : 72 ,74. () 了较丰富的资料 李树深 , 2007 ,与这些林蛙的核型 吴政安. 1982. 两栖类骨骼细胞的染色体标本制作法 [ J ]. 遗传 , 4 ( ) 1 : 38 ,39. 比较表明 :寒露林蛙与分布于台湾的长肢林蛙 、新疆 谢锋 ,叶昌媛 ,费梁 ,等. 1999. 中国东北地区林蛙属物种的分类学研 的中亚林蛙和东北不同地理居群的黑龙江林蛙的核 究 [ J ]. 动物分类学报 , 24: 224 ,232. ( ) 型等完全不同 ,而与曾晓茂等 1998 报道的四川盐 谢锋 ,叶昌媛 ,费梁 ,等. 2000. 中国西北地区中国林蛙各居群的分类 学研究 [ J ]. 动物分类学报 , 25: 228 ,235. 源的 昭 觉 林 蛙 、峨 眉 山 的 峨 眉 林 蛙 及 陈 文 元 等 曾晓茂 ,叶昌媛 ,费梁. 1998. 四种林蛙核型及银带研究 [ J ]. 动物学 ( ) 1988 报 道 的 峨 眉 林 蛙 具 有 相 同 的 核 型 : 14M + ( ) 研究 , 19 5 : 412 ,414. ( 10 SM + 2 ST 但 3 种染色体类型的所属染色体的顺Che J , Pang JF, Zhao EM , et a l. 2007. Phylogene tic R e lation sh ip s of ( ) ) the Ch ine se B rown F rogs Genu s R ana Infe rred from Pa rtia lM itochon2 序上存在着差异 ,这点可以说明寒露林蛙与峨眉林 d ria l 12 S and 16 S rRNA Gene Sequence s[ J ]. Zoo logica l Sc ience, 24: 蛙 、昭觉林蛙亲缘关系较近 。而这 3 种林蛙在次溢 71 ,80. 痕和 NOR s位点等方面存在的较大差异说明寒露林 F ro st DR , Gran t T, Faivovich J , et a l. 2006. The amp h ib ian tree of life 蛙还是有别于昭觉林蛙和峨眉林蛙 。通过对寒露林 [ J ]. B u lletin of the Am erican M u seum of N a tu ra l H isto ry, 297: 1 , 蛙核型和 NOR s位点的观察 , 支持分子系统发生和 370. Kim JB , M in M S, Yang SY, et a l. 2002. Genetic re la tion sh ip s among 形态分类认为其是一个新种的结论 。 ( ) Ko rean b rown frog sp ec ie s A nu ra, R an idae, w ith sp ec ial refe rence 4 参考文献to evo lu tiona ry d ive rgence s be tween tow a llied sp ec ie s R ana dybow skk i and R. huan renensis[ J ]. Zoo logica l Sc ience, 19: 369 ,382. 陈文元 ,王子淑 ,王喜中 ,等. 1983. 四川六种蛙染色体组型的比较研 L evan A , F redga K, Sandbe rg AA. 1964. 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