【doc】微囊化人胎肾上腺皮质细胞的制备及其形态,功能的研究

【doc】微囊化人胎肾上腺皮质细胞的制备及其形态,功能的研究 微囊化人胎肾上腺皮质细胞的制备及其形 态,功能的研究 ' l68. ,蹭,(7. 中华器官移植杂志1999年7月第20卷第3期ChinJOr~aanTransvlant.July1999,20,No3 微囊化人胎肾上腺皮质细胞的制备 及其形态,功能的研究?27一; 用铮陈宝公俞耀庭姚东 ———, ,——,'? 【摘要】目的研究微囊化^胎肾上腺皮质细胞的制备及其功能,并进行形态学观察.方法 将人胎肾上腺皮质制成单细胞,再用具有良好生物相容性的海藻酸钠聚赖氨酸一海藻酸钠(APA)微 囊包裹,制成徽囊化肾上脖皮质细胞.将分离的肾上腺皮质细胞和微囊化肾上腺皮质细胞分组进行 培养,测定培养22,46,7lJ小时的培养液中的皮质醇含量,在取培养液的同时加人含促肾上腺皮质激 素(125ng/L)的培养液刺激培养2小时,即培养中的24,48,72小时再取培养液测定皮质醇含量.结 果形态学观察发现机械法分离的肾上腺皮质细胞存活率为92%,制备成微囊后的肾上腺皮质细胞 存活率为83%;微囊化肾上腺皮质细胞形态完整,肾上腺皮质细胞均匀地分布在APA微囊内,微囊 面光滑完整;两个培养组的皮质醇含量变化的差异无显着性(P>005),微囊对 肾上腺皮质细胞 l面哪Is 删U竹.了'ANW,CI-IENGBoogong,eta1DepartmentofGeneralSurgery,FirstCentral Hosl~tal0厂了,了,300192 【Abstract】 ObjectiveTostuffythepreparationofmicmencapsulatedhumanenabryoadrenalcortical ceilsandtheirmorphdo~vandfunctions.MethodsSinglecoalfmhtm~anembryoadrenalCOdexwas made,enwrappedwithbetter~olngical0onsist~talginatepoly-L-Iysi1gina(APA)andmicroencapsu一 1atedadrenalcorticalcellsweredevelopedTheisolatedadrenal~3rticalcdls(gm~pA)andmicroencapsu一 1atedadr且 lcorticalcelts(groupB)we.culturedseparately.ThecortisolIevdsintheculturefluidat 22nd,46fh,70thhwered~emainedinthetwogroups.respectively.AlterAcTH(125ng/L)addition Intothecultatreflutdforstimulatingculturefor2h,thecortisolIevds1ntheculture玎 uidat24th.48fh earl72ndhweremeasuredagainResellsMorpholqg~cafly.t似a1饨U邸 rviva1rateoftheembryonic adre~cel1sw砸 92%byusingFilethaniCalmethods.whilethesurvivalofmicixxmeapslIlatedcellswas 83%Microencapsulateda~enalcells'shapewasintact,evenlydistributinginAPAThe轧 Lrfaceofmi croertcaps?? ~m-,cothThecortisollevelsintwogripshadnOsignifi~ntdifferenceMicroencapsulation hadno00usnfluellCe? adrenaleellacti~fity.CoaclusionThemicroencapsulationhadnOharmfultO thesurvivalandsecretionfunctionofadreamlcd1s 【Key咐出】AdrenalCOIqA2Xce?,culturedAd嗍lcodexhora~nesBiceompatible materlals' 文献报道微囊化胰岛细胞移植治疗糖尿病大鼠 获得良好效果一.根据上述资料,我们制备出微 囊化肾上腺皮质细胞,并在体外培养中观察皮质醇 的分泌情况,以及在促肾上腺皮质激素(A{H)刺 激下皮质醇分泌量的变化和肾上腺皮质细胞形态学 的变化,为临床微囊化肾上腺皮质细胞移植奠定基 础 车研究为天津市科学拄木委员会21世纪青年基金资助项目(基金编号: 9737065l1) 作者单位:300192天津市第一中心压院外科(躅铮谭纬陈宝公):南 开大学分子生物学研究所(俞耀庭,姚东) 材料与方法 一 ,人胎肾上腺皮质细胞的分离 1.肾上腺皮质的切取:6个月龄以上水囊引产 死胎1l具,娩出后立即4?保存,2小时内无菌下 完整切取双侧肾上腺,立即置于生理盐水中.切除 肾上腺髓质,并将皮质置于含Hanks液的培养皿中 剪成2rnln×2rnln×2[rffll小块. 2.肾上腺皮质单个细胞的制备:将上述肾上 腺皮质组织块置于200目铜网上,边研磨边用 Hanks液冲淋,所得滤过液即为肾上腺皮质细胞团 中华器官移植杂志1999年7月第20卷第3期ChinJOt'.~artTransotant,J山 y1999,20,No3 样匀浆.在4+C下以500r/min~速离心,30秒,弃 去上清液,留取沉淀物,如此反复3次.沉淀物用 Hanks液稀释后再以400目铜网研磨过滤1次,所 得过滤液即为肾上腺皮质单细胞悬液(图1). 3.细胞计数及浓度调整:将单细胞悬液500 r/min离心5分钟,弃去上清液,加入含10%小牛 血清的RPMI1640培养液悬浮细胞,吸取1滴至 血细胞计数板上计数.调整细胞浓度为1×10个 /ml. 二,微囊化肾上腺皮质细胞的制备 将分离的细胞1000r/min离心5分钟.弃去 上层培养液,加入适量的15g/L海藻酸钠溶液,使 细胞密度为2X10个/rrd,混台均匀后,按孙绵 方Ll的方法制成包裹肾上腺皮质细胞的海藻酸钠 聚赖氨酸一海藻酸钠(APA)微囊.此前已对该囊壁 进行了各种物理及化学性能测定,证实该膜可允许 培养液中营养物质,A口,H,皮质醇自由通过,但相 对分子质量较大的物质如牛血清白蛋白(BSA),IgG 都不能透人,达到免疫隔离的. 三,肾上腺皮质细胞和微囊化肾上腺皮质细胞 的培养及AcTH刺激试验 在24孔培养板的第1,4孔中加入细胞浓度为 1X100个/rrd的肾上腺皮质细胞悬液1rrd,在第5 , 8孔中加入培养液0.5rrd,再加入微囊化肾上腺 皮质细胞至1rI1l,其细胞浓度约为1X10个/ml. 将培养板置于体积分数为5%的COz培养箱中 37?下培养,22小时后,各孔均抽取培养液0.5 ml,一20?保存,待测定,同时向各孔注入含125 ng/LACrH的培养液0.5rrd,2小时后抽取各孔中 的培养液0.5rrd,20?保存,待测定.此后重新 注入普通培养液05ml,分别于46和48,70和72 小时重复上述步骤. 四,培养液中皮质醇的测定 由天津医科大学内分泌研究所用放射免疫法测 定. 五,形态学观察 取单细胞悬液1滴,加4g/L的台盼蓝溶液1 滴,3分钟后光镜下观察(图2).另外数100个微 囊放人试管中,用镊子将微囊挤破,释放出囊内的 肾上腺皮质细胞,台盼蓝染色,计数(图3).肾上 腺皮质细胞微囊外表面扫描电镜观察见图4.肾上 腺皮质细胞微囊边缘及中心冰冻切片见图5,6. 结果 采用本法分离,肾上腺皮质细胞的存活率为 92%,微囊包裹后肾上腺皮质细胞的存活率为 83%.肾上腺皮质细胞不同培养时间的皮质醇分泌 量和ACTH刺激后皮质醇分泌量的变化见图7.微 囊包裹的肾上腺皮质细胞不同培养时间的皮质醇分 泌量和ACTH刺激后皮质醇分泌量的变化见图8. 经统计学处理,两个组各培养时间的皮质醇分泌量 及ACrH刺激后的皮质醇分泌量,差异无显着性 (P>0.05). 图7肾上腺皮质细胞不同培养 时间的皮质醇分泌量 图B微囊包裹的肾上腺皮质细胞不同 培养时间的皮质醇分泌量 讨论 分离肾上腺皮质细胞的方法有酶法和机械法两 大类.酶法的分离结果受消化酶的浓度,消化时问, 试验条件等许多因素的影响,且由于细胞微囊化后 要应用于人体移植,因此如用酶法分离,不易保证 酶不被带人机体,引起不良反应.而机械法具有制 备时间短,方法简单的优点.本文的方法分离的肾 上腺皮质细胞游离,完整,存活率>9o%,这与胚 胎肾上腺皮质的结缔组织少有关. 我们对微囊化肾上腺皮质细胞的形态进行了观 察,结果显示肾上腺皮质细胞均匀地分布在APA 微囊内,微囊表面光滑完整,微囊内细胞存活率> 80%,说明微囊形成过程对细胞的损害不大. 一 一i0.,_u一??《} 170中华器官移植杂志1999年7月第20卷第3期 ChinJOmanTransolant.Jub1999,Vol20.No3 培养不同时间,微囊化和非微囊化肾上腺皮质 细胞皮质醇分泌量的变化相似,开始保持较稳定的 水平,之后开始下降,但直到70,72小时仍可检测 到一定量的皮质醇,并表现出对ACrH刺激的反 应.说明徽囊不影响肾上腺皮质细胞的分泌功能. 微囊化肾上腺皮质细胞的皮质醇分泌水平较游离细 胞分泌的水平低是由于在实验时虽然尽可能地 使微囊化肾上腺皮质细胞与游离细胞的密度相似, 使其具有可比性,但是微囊材料所占用的体积必将 使微囊组细胞数减少;另外,微囊过程中一部分细 胞失活,也影响皮质醇水平. 本研究为短期观察,微囊化肾上腺皮质细胞长 期的体内外观察,微囊化细胞分泌的激素量能否满 足机体的需要,移植后其分泌的皮质激素能否减轻 微囊周围的炎性反应都在进一步研究中] (本文图1,6见封三) 参考文献 1孙绵方一种新型的生物人工肝——做囊肝细胞中国生物医 学工程.1989.4:221 2Petm~oP.Cappa[A,RuiuG.etCellmlcloencapsulafion:a n唧methodTransplantProe.1994.26:35073508. 3CadicC.Vitielk~S.GinH.eta1.Embeddedadrma]ceUsgraftre ducedIocalandearlynonspecfficinflammatorvphenomenawhichfd lowagarosebeadsimpl~atafion(fTmrtsplam.1992,I:349354. 4AbobakrAMFreeandrcdcroeneapsulatedadrenalcellspr,xlucesiml— lar..nls0lresponseswhenst?ulatedbvACWH:aninwtrost1]dv ImJArtlf()疆ans,1994.17:171—174 (收稿:1998.11.25.惨回:19994/3.25) 无肝素血液透析治疗血友病甲伴急性肾功能衰竭一例 昊彼得马旭东沈长福连学坚陈文腾 患者为男性,19岁.l1年前曾确 诊为血友病甲.此后反复关节肿痛,皮 肤青紫,牙龈出血及鼻衄,均于输血后 症状缓解人院前3天患者左下腹疼 痛,并可触及包块,B型超声波示腹腔 包裹性积液:人院第3天出现呕血,排 黑便,24小时尿量<100ml,血肌酐为 14OOpa~ol/L,尿素氮为329mmol/L, K为58mmol/L,coe结合力为l7 rrm~ot/L.粪潜血试验阳性,诊断为失血 性休克,急性肾功能衰蝎.即急诊行无 肝素血液透析,透析机为Gmnbm AK1o0型,碳酸盐透析液,透析器为 BeLLm血仿膜空心纤维管,面积1.4mz. 方法:(1)用含肝素3000U/L的生理 盐水预冲动,静脉管道及透析器,开始 透析时排放预冲液;(2)血液流速250 , 300ml/min;(3)每2o分钟用生理盐 水快速冲洗血路及透析器….每次透析 3小时,隔天1次,共行无肝素血液透 怍者单位:363000福建省.漳州市医院内科 析4次.透析后第2天尿量达800m【, 此后尿量渐增,血液透析后第6天尿量 达3500ml.共输新鲜血2000rrd,血装 冷沉淀22单位.人院第14天复查血肌 酐为100,,maot/L,尿素氨为77mmd /L,K一为3.5mmol/L.尿量为2030 mI蒯.患者共住院21天,肾功能完全 正常出院. 本例因失血性休克导致肾前性急性 肾功能衰蝎,具有无尿,高钾血症,高尿 酸血症等高分解代谢特点,为急诊血液 透析治疗的适应证1:血液透析时需用 较大口径的l6号针行动脉,静脉穿刺, 才能建立有效的循环血路(血流量>200 mt/min).另一方面,血液透析时需全 身肝素化,以防止血液在体外循环中凝 固.普通肝素可加剧血友病患者出血的 危险.但如不抢救,患者致命性的危险 首先来自高钾血症和急性肾功能衰蝎. Koene等【3报告1例血友病甲井尿毒症 患者接受血液透析治疗1年后,成功地 施行了肾移植,为防止出血,在透析及 ? 短篇报道? 手术期间.每周补充凝血因子?6000 u.权衡利弊,我们决定采用无肝素血 液透析技术,同时于透析前及透析后输 注大量的新鲜血及冷沉淀,以提高患者 的凝血因子?浓度,在透析结束后延长 穿刺点的压迫时间,防止局部出血.这 样既安全有效地治疗了急性肾功能衰竭 和高钾血症,又避免了出血危险.经过 4次无肝素血液透析,患者安全进人多 尿期,肾功能恢复正常. 参考文献 ?一 1孙世澜主编血稚净化手册武汉:湖北 科学技术出版杜,1994391.392 2叶任高,沈清瑞主编肾脏病诊断与治疗 学北京:人民卫生出版社.1994685. 689 3KceneRA,【r【agPG.JamenJL,et St~ccesdulhemodialysisandrenaltrmasplan- tatmninapatMmwith~hi[iaAProe EurDialTransplantAaacc.1977,14:401— 406 (收稿:19981126)