荧光定量PCR检测细菌染色体上基因拷贝数

荧光定量PCR细菌染色体上基因拷贝数 荧光定量PCR检测细菌染色体上基因拷贝 数 2OO6年4月第26卷第4期ChinJMicr~iolInemmol,April2006rVol26tNo.4 . 免疫检测. 荧光定量PCR检测细菌染色体上基因拷贝数 刘广文闫梅英梁未丽高守一阚飙 【摘要】目的建立一种以细菌染色体上1个已知拷贝管家基因作为基准,通过荧光定量PCR 检测其他被检基因拷贝数的方法.方法利用荧光定量PCR检测El110r型霍乱弧菌染色体上目的基 因zot与基准基因thyA的Ct(thresholdcycle)值差值,根据已知拷贝数菌株N16961的两基因Ct值之差 来推算待测菌株中zot基因的拷贝数.结果利用thyA基因作参照,确定11株E1Tot型霍乱弧菌中 zot基因的拷贝数在1,5个之间,对较少拷贝数的检测与Southemblot确认的相同,对多拷贝数检测 优于,Southernblot的判定.结论本方法可以准确检测菌株染色体上的基因拷贝数. 【关键词】荧光定量PCR;基因拷贝数;霍乱弧菌 1hecopymtmher0fthegtmeinchrmnmmne0fstraindetectedbytherealtimeqIl衄titativeP【删 C.tt/t/ng-~,?M~y/ng,4^『G,G40Shou-y/,uvB/ao.Nat/ona//nst/tuteforCommm/mb/eD/s — easeControland尸,删咖,l,StatejLaboratoryforlnfect/ous西尸,删肌砌,landContro/,aC~for D/smseContro/and~/lt/on,&,,206,C轴m G陀删姗皿撕:B/ao,Ema//:kanb/ao@/cdc.cn 【AI,sI瑚d】 ObjectiveToestabhsharealtimequantitativePcRmethodfordetectinggenecopyllun~rs inchromosomeDNAofbacteria.MethodsCtvaluesofgeneszotandthyAofmrcho/erae81rainsaredetect— ed.andthedifferenceofCtvaluesbetweenthesetwogenesiSidentified.rI11ecopynumberofgenezotofone straini8determinedwiththereferenceofCtvaluedifferenceofstrainNl6961.ResultsCopynunlbersofzotgene amongllofdetectedm砌 cho/eraeElrI10rstrainsweredeterminedfromlto5withthyAasthereference.It showedthattheestablishedmethodiSasgoodasSouthernblotintermsofdetectinglowcopynumbersofgenes, andi8betterfordete~highcopyIlllnlbers.Cllmdll~Ollt111equantitativePCRcallbeap~edtoaccurately detectcopynumbersofgenesinchromosomeDNAofbacteriastrains. 【Keywords】RT_P(;Genecopynumber;Wb砌chderae 多拷贝基因在细菌中广泛存在,而且多是些可 移动的遗传成分,它们在细菌的遗传,进化及致病过 程中具有重要作用,构建这类重复基因成分的物理 图谱是研究其结构和功能的一个重要方面.在分析 中往往需要测定这些重复片段的基因拷贝数,但是, 当基因为规则的串连拷贝重复,尤其超过两个以上 时,利用Southernblot等技术分析物理图谱难以确定 具体的拷贝数. 荧光定量PCR是一种准确可靠的可以定量检 测基因拷贝的方法,具有快速灵敏和高通量的特点, 而且该方法无需对扩增样品进行任何后续处理过 程,避免了PCR产物的污染问题【1J.目前较为广泛 地应用于对基因表达量的测定,即mRNA的定量检 测,以及对一些肿瘤相关基因,病原体,转基因等进 基金项目:国家十五科技攻关计划课题资助(2003BA712A05. 04);国家重大基础研究项目(973)课题(G1999054m2) 作者单位:102206北京,中国疾病预防控制中心传染病预防控制 所,传染病预防控制国家重点实验室 通讯作者:闻飙,FJmstil.,kanbiao@iedc.an,电话:OlO1嗍58 行检测.荧光定量PCR分析时的一个主要参数就 是Ct(thresholdcycle)值,即每个反应管内的荧光信 号到达设定的域值时所经历的循环数.研究表明, 当固定荧光信号值后,每个的ct值与该模板的 起始拷贝数的对数存在线性关系乜】.本研究中,我 们用细胞内染色体上的一个管家基因作基准,检测 同细胞染色体上的另一个基因拷贝数.与传统的利 用内标做标准曲线来绝对定量不同,我们是通过荧 光定量PCR建立了一种检测细菌中基因拷贝数的 方法:选取细菌基因组中结构一致,拷贝数已知并且 恒定的管家基因作为基准,利用荧光定量PCR检测 同细胞内目的基因的拷贝数.该方法是根据参照的 管家基因和待测基因的扩增Q值来确定后者的拷 贝数,无需绘制标准曲线绝对定量,只根据相对的 Q值差便可得出目的基因的拷贝数.同时由于管 家基因与待测基因在同一个细菌细胞的染色体上, 因此对待测基因拷贝数的分析是在一个独立的反应 体系内进行的,即针对一次用于检测的DNA样品进 行检测. 免疫学杂志2OO6年4月第26卷第4期 ChinJMicmbiolInmmnol,April2006,Vol26,No.4 霍乱弧菌染色体中有携带霍乱毒素基因的溶原 性噬菌体基因组,并且该基因组可在染色体 上出现多拷贝的串联重复b].我们以霍乱弧菌中单 拷贝管家基因thyA为内标基因【4检测了ElT0r型 霍乱菌株中CTX~P基因簇的拷贝数.我们以C? 基因簇核心区的zot基因作为检测的目的基 因【5],利用这种荧光定量PCR方法对菌株内 基因簇的拷贝数进行了测定,并且用杂交补充验证. 材料和方法 菌株:见表1.我们还包括了一些没有C 基因组的E1Tor型菌株,如40-42,93097,Ku40等作 为检测zot基因的阴性对照. 仪器及试剂:荧光定量PCR仪为RocheLightCy— cler;荧光探针及引物由上海基康公司标记合成;限 制性核酸内切酶,ExTaqDNA聚合酶及Pc体系由 TaI(aRa宝生物工程有限公司提供;核酸纯化用QIA— GEN试剂盒;地高辛(DIG)标记与检测试剂盒购自 德国Roche公司. 表1实验中所用的霍乱弧菌日Tot型菌株 1曲k1.Irtbr/odlDl阴ElTorstab 荧光定量VCS._thyA基因上游引物序列为:5一 ACATGGGACGCGTGTATGG-3,19bp,下游引物序列 为:5'-ATATGACCACCATCAGGC~AGC一3,23bp.荧 光探针用FAM标记,序列为:5FAM—TIEAGC~一 TAGAGC33W,-3,61bp;zot基因的上游引物序列为: 5'-C,~CAGATGCGACCACAT-3,18bp,下游序列为: 5'-GCAC3W,GGCGAGAAAGGA一3,18bp.FAM标记的 荧光探针序列为:5FAM—ATCGATAAAGAGAAACGC一 3,57bp.两对引物的理论Tm值为58?,59?. 扩增体系:25体系中含dNTP0.3mmol/L,Md5 mmol/L,引物各0.2tanol/L,荧光探针0.24tanol/L, ExTaq酶0.05.扩增参数:92?预变性5min; 92?30S,60?30S,4o个循环. 加样方法:在每次扩增时,将共有的反应组分配 好后加入模板(加入量为预实验中获得的在检测线 性范围内的模板量),充分混匀后,等量分为检测 thyA基因与zot基因的两个反应体系,加入各自的 引物和探针,混匀后再分装做平行检测.这样既保 证了模板一致,同时也可检测荧光定量PCR的稳定 性.每株菌进行6,9次重复检测. ACt值的校正:检测各菌株thyA基因与zot基 因的ct值,以thyA基因的ct值减去zot基因的ct 值得到两基因Ct值的差值,记为ACt.每个菌株每 次平行检测2个基因均获得一个原始ACt,然后将 该菌株每个重复实验的所有ACt的均数作为该菌株 的平均ACt.菌株N16961全基因组序列已测定,其 2个基因拷贝数均为1,该菌株的ACt值可认为是由 于两基因扩增效率和引物序列等系统误差造成的, 将其作为ACt的本底,即将N16961菌株的ACt值调 整为0,其他菌株也做相应校正:把被检菌株的平均 ACt值减去N16961的平均ACt值,得到的便是被检 菌株的校正ACt值(adjustedACt,缩写为adACt). zot基因拷贝数的换算:由于霍乱标准株 N16961中zot基因为单拷贝,而thyA基因在霍乱弧 菌中高度同源且为管家基因,因此不同菌株的 adACt值可以代表单拷贝的zot基因达到该菌株内 zot基因相应拷贝数(CN)时所需的PCR扩增循环 数,根据PCR的倍数扩增原理,CN=1X2拙,可以 计算出zot基因在菌株中的拷贝数,最后用取整函 数ROUND得出具体拷贝数. zot基因杂交探针的制备:以N16961为模板进 行PCR,所用的上游引物序列为:5'-AAACCTI'. GAACGCATAGC-3,下游序列为:5'-GCCCATAGAC— CACGATAA-3,产物长度为846bp.将扩增产物回 收纯化,然后依照试剂盒进行DIG随机引物法标记. 酶切及杂交检测:打点杂交时,集1.5ml菌液 溶于50的三蒸水中,然后水煮10rain,冰浴10 min,再离心取上清作为杂交模板,取5模板点于 硝酸纤维素膜上,烤干后进行杂交显色;Southemblot 时,染色体经PstI酶切后按照操作进行杂交显 色?. 统计学方法:数据用SPSS11.5软件进行处理分 析.P<0.05为差异有统计学意义. 结果 l-荧光定量l_【检iN!耐基因的特异性:并非 ChinJMicr~idInmamol,Aofil2OO6,vd!N01璺 所有ElT0r型霍乱菌株均含有?基因组,在我 们分析的l4株菌株中,利用标记的zot基因探针通 过染色体DNA的打点杂交检测这些菌株,同时将这 些菌株利用的扩增zot的荧光PCR体系进行检 测,发现在zot基因探针杂交阴性的3株菌中,荧光 定量PCR检测zot基因的Ct值大于36,zot基因探 针杂交阳性的11株菌株荧光定量PCR检测zot基 因的Ct值小于24,因此两者检测结果完全一致. 2.荧光定量PCR检测菌株thyA基因和zot基 因的Ct值结果:数据处理只针对11株zot阳性菌 株.将每株各次的ACt值取均数作为该菌的平均 ACt,结果其标准差均小于0.2,同时所有菌株的 thyA基因及阳性zot基因的Ct值均小于25,表明本 实验数据可靠】.图1显示了部分菌株的单次实时 PCR荧光曲线图. lO0 90 80 70 60 50 40 30 20 l0 0 l0o 90 80 70 60 50 40 30 20 l0 0 l00 90 善; 60 耋:3.0l0 0 0510l52025303540 Cyclenumber 图13株酉株的实时PCR荧光曲线图 啦!.mlawtsaalceOllrV~efreallimePCRefthree strains 3.根据校正的ACt值对菌株进行zot基因拷贝 数分析:对11株阳性E1Tor型霍乱弧菌的ACt数据 分析见表2,zot基因的拷贝数结果见图2. 4.不同zot基因拷贝数菌株之间差异的统计学 检验:根据以上结果,我们按zot基因拷贝数对数据 重新分组,然后进行组间adACt值的统计学检验. 结果为不同拷贝数的菌株之间差异都具有统计学意 义,均P<0.05,表明本实验中得到的菌株zot基因 拷贝数结果具有统计学意义. 5.Southernblot分析菌株的zot基因拷贝数: 霍乱弧菌染色体经PstI酶切(PstI在c1x基因组 内有1个酶切位点,但不在zot基因内)后与DIG标 表2ElTor型霍乱弧菌蜘与删f基因的ACt值数据 分析 Table2.Anal~sefda恤ACtef姆Ageneandzo~gene .mV.cJIanElTo~strains 12345678910l1 EcholeraeE1T0rSHRill 图2检测的ElTot型霍乱弧菌的zot基因拷贝数结果 啦2.Copynmnber0fzotgmeind~efmltV.c=II strains 1:N16961;2:DllS;3:Wujians2;4:2001-6;5:23-62;6:2477; 7:63-12;8:86015;9:93284;10:97-84;11:98185 记的zot探针杂交,结果见图3.表明通过荧光定量 PCR方法计算出的zot基因拷贝数,当为1,2个拷 贝时,Southernblot也可以检出;而基因拷贝数多于3 的菌株2001-6,Southemblot仅显示了2条杂交条带, 是因为?在染色体上的多拷贝串联重复,少于 用荧光定量PCR方法检测计算的拷贝数.如果当 基因组呈规则的序列一致的串连拷贝重复且大于2 个时,利用内部切点消化进行Southemblot,则会产 生相对分子质量大小相同的片段相互重叠,难以用 Southemblot确定拷贝数.因此该方法比杂交的检 出范围广.荧光PCR未检测到zot基因的40-42菌 株杂交结果为阴性. 讨论 本文将荧光定量PCR应用于对核酸DNA基因 654321O 写暑aq茸暑二0U (×103) 23.O 9.4 6.6 4.4 生2OO6年4月第26卷第4期ChinJMicrobiolImmunol,April2006,Vol26,No.4 圈3霍乱弧菌的z.ot探针Soulhernblot结果 Fig3.Southernblothybr~bafionofV'~r/ocho/erae strai~withfprobe 1:NHind?;2:N16961/PstI;3:2001-6/PstI;4:23—62,Pst I;5:93284/PstI;6:Dll8/PstI;7:40-42 拷贝数的检测中,与传统的利用内标和标准曲线对 基因进行绝对定量不同】,我们是通过选定一个在 同类菌株中结构保守,含量恒定的基准基因,并且与 被检基因位于一个细胞的染色体上来检测目的基因 在基因组中的拷贝数含量.我们选择在同一染色体 上的已知拷贝数的管家基因作基准,其优势是被检 基因与基准基因由于共同存在于同一染色体或同一 个细胞内,因此无需考虑加入反应体系的DNA模板 的绝对量,尤其是不同批次实验之间的差异,便可使 两基因在PCR反应中的初始模板含量相同,每个反 应都是独立并直接获得拷贝数结果的,不必考虑不 同批次的实验的可比性. 该方法适用的前提是基准基因与被检基因扩增 效率应可比.基准基因稳定存在于同类菌株的染色 体上,而且拷贝数相同,它与目的基因的引物扩增条 件和扩增效率在理论上应差别不大;同时在体系中 模板量要有较合适的浓度,以保证在荧光定量PCR 检测的线性范围之内.通过检测菌株中两基因的 ct值,根据PCR扩增原理计算目的基因的拷贝数, 可以为绘制基因的物理图谱提供依据. 在霍乱弧菌中,溶原性丝状噬菌体CIX~p可携 带霍乱毒素的编码基因】,整合于染色体上的 CIX~p基因簇可被诱导为噬菌体颗粒【5】.利用荧光 定量PCR分析CIX~p在不同菌株的拷贝数,同一细 胞内zot与thyA基因拷贝数之比与ACt呈二倍指数 关系,由于标准株N16961的两基因拷贝数均为1, 将其ACt作为系统误差对其他菌株的ACt进行校 正,便可用于推算其他菌株目的基因zot的拷贝数, 也就是基因簇的拷贝数.此结果能为下一步 霍乱弧菌中?基因簇物理图谱的绘制提供依 据,补充Southernblot不能确定重复串联拷贝的不 足.在低拷贝数时Southemblot结果与该方法测出 的拷贝数相符.对于某些含多拷贝的菌株,Southem blot不能准确判断拷贝数,原因可能是由于目的基 因串联排列导致酶切片段的重叠,其直观结果便是 杂交条带少于荧光定量PCR检测的拷贝数目. 本设计思路在应用过程中,需要有合适的基准 基因,如选用管家基因或菌种内的高度保守的并且 拷贝数已知的基因.通过可以检测低拷贝基因的荧 光定量PCR【1,我们建立的这种相对比较ACt的方 法,消除了不同基因扩增效率之间的系统差异,利用 基准基因含量恒定的性质得出菌株的目的基因拷贝 数与ACt之间的关系.荧光定量P(不能取代其 他的Southernblot等分析n】,但由于具有高通量,高 灵敏性及数据处理简便,可靠等优点,本方法更适用 于对大量菌株进行的多拷贝基因的精确检测及筛 选,可便捷地为基因组物理图谱的构建提供有价值 的信息. 参考文献 1HeidCA.StevensJ."vakKJ,eta1.R朋lmqu~tafivePCR.Ge- rmRes.1996,6:98&994. 2I-Egu~R.Foc~erC,DcG.eta1.KiIlcPCRanal~s:- time~omtofing0fDNAamplificationre0m.Biotechnol,1993,11 (9):1026-1030. 3NandiS,MaitiD,SanaA,eta1.G呵lesis0fvariants0fVibr/odugeme O1biotypeE1Il僭:role0ftheCTXOarrayanditsp08id?inthege- nollle.Microbiol.2003.149:89-97. 4MoronaR,YeadmJ,ConsidineA,eta1.Constmction0fplasmidvec- totswithanon-antibioticselectionsystembased?theEsdeddliacoli thyA铲ne:applicationtocholeravaccinedevdopment.‰,1991, 107(1):139.144. 5WaldorMK,RubinEJ,PearsonGDN,eta1.Rs~jlafiqn,replication, andintegrationfu/lctioll$0ftheV'dv/ocho/eraecrxoal?encodedbyre- gi?RS2.MolMicrobial,1997,24:917-926. 6黄培堂等译.分子克隆实验指南.第三版.北京:科学出版社, 2002. 7lRbrlerB,Baldwin1T.Use0freal-timePCRfordetemlir.iIlgcopynuln- betandzygosityin曲n昭?icplants.PlantCellR印,2004,23(5): 263.271. 8GibsonUE,HeidCA,WflliaHbPM.Anovelmethodforrealtimequan. titativeRT-PCR.Genc~neRes,1996,6(10):995.10o1. 9WaldorMK,M~alanos叮.Lrsosenicconversionbyamm0IIsplIdge 豇lc0dingcholeratoxin.Scieace,1996,272:1910-1914. 10TeoIA,ChoiJW,MorleseJ,eta1.LightcyderOptilniT~OHfor lowcopynumbertalgetDNA.Jhnnmm~lMethods,2002;27O(1):119? 133. (收穑日期:2005-06-16)