转甜菜碱醛脱氢酶基因植物的耐盐性研究

转甜菜碱醛脱氢酶基因植物的耐盐性研究 一 遗传,24(1):54,58,1997 AataC-~ne~t/ea67~ca /嘶J 转甜菜碱醛脱氢酶基因植物的耐盐性研究 刘风华-郭岩?谷冬梅肖岗陈正华陈受宜.一— ……究…京…S6Ic,3, A摘要将山菠菜甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因经农杆菌介导转入草莓,烟草,转基因植 渗漏值说明在盐胁迫下转基因植 关键词山菠粲BADHcDNA,_------?- 环境因子,干旱,低温,高 迫,细胞内往往积累一些小分子有机化合物,甜菜碱就是其中之一.藜科,早熟禾科, 紫苑等在干旱或盐碱胁迫下甜菜碱的积累更为明显甜菜碱除定位在叶绿体外还存在 于微粒体和胞浆中,已知在胁迫下,除参与渗透调节外,还对三羧酸循环的主要酶和末 端氧化关键酶有保护作用【9】.植物中甜菜碱的生物合成经两步氧化得到,其中涉及胆碱 单氧化物酶和甜菜碱醛脱氢酶(BADH,ECl-2,1.8).这两个酶的活性都受盐诱 导_I”.Saneoka等人证明,含甘氨酸甜菜碱的玉米在盐胁迫下比缺失型所受损伤明显下 降. 我们前已报道从耐盐性很强的藜科植物山菠菜(帅幻fhortensis)中克隆了BADH cDNA,并在大肠杆菌中得到表达口.本文报道了BADHcDNA在烟草和草莓中的表 达,盐胁迫实验证明转基因植株的耐盐性明显高于对照. l材料和方法 1.1材料草莓(Fragariachiloensis),哈尼品种.烟草(Nicotianatabacum), 革新1 号. TaqDNA聚合酶由本组自制,PCR引物由本组合成,双元载体pBin438由方荣祥 教授惠赐,农杆菌菌株由朱桢教授惠赐,一P—dCTP为NEN公司产品. 1.2方法 1.2.1DNA提取质粒DNA提取和纯化按Sambrook方法进行l,植物 总DNA提取 按我们以前的方法进行. 1.2.2植物表达载体的构建和农杆菌转化BADHeDNA植物表达载体的构建按常 规方法进行(图1),双元表达载体pBin438含双重35S启动子和翻译增强子TMV的 0片段,用BamHI和KpnI将BADHc.DNA片段从克隆质粒中切出来后插入pBin438 中,所得到的表达质粒再直接转导农杆菌AGL1p~. 本课题为国家高技术资助课题.本文于1995-09-29收到,1996-06—05修回 国通讯联系人 1期剖风华等:转甜菜碱醛脱氢酶基因植物的耐盐性研究 图I双元载体构建围 Fig.1Strt~’tuneofNnary”dg~Ol” LB l2-3植物的转化,再生和筛选将无菌草莓分生组织块和约5mm大小的无菌烟草 叶片分别浸入稀释5倍的AGLI农杆菌液中,约30min后取出放在无菌滤纸上,吸去 菌液.草莓接种在MSI培养基(MS基本培养基+10mg/L6一 BA+O.5mg/L2, 4一D),烟草接种在Ms2培养基(MS基本培养基+Img/L6一BA+0.1mg/LIAA)中 共培养3天后转入筛选培养基(草莓:MS1+2Omg/L卡那霉素+600rag/L头孢霉素; 烟草:Ms2+100mg/L卡那霉素+6o0mg/L头孢霉素).对照除不用农杆菌浸染外其它 各步骤相同.再生苗平均25天在相同的筛选培养基上重复筛选4,5次后,抗卡那霉 素植株进行农杆菌检菌和耐盐性鉴定. 1.2.4BADH活性分析】2g植物组织在液氮中研磨后,室温下加入蛋白提取液 (50mmol/LHepes/KoHPI-t8.0,lmmol/LEDTA,5rranol/LD’IT)抽提,4?下 14000ipm离心10rain,蛋白浓度用紫外分光光度计280rim比色测定. 酶活性渊定反应体系为:50retool/LHepes/KOH 【pH&0J,5retool/LDTT, lmmol/LElYfA,lmmol/L甜菜碱醛,1rtmaol/LNAD及酶提取液1.Omg蛋白,总体 积1.0mI,37?反应10ram,紫外分光光度计340nm比色测定.上述反应体系下每分 钟消耗lnmol的AD定义为1个酶活力单位. 1.2.5转基因植株的分子检测转基因植株的PCR检测,Southern杂交,Northern 杂交均按常规方进行【1. 1.2.6植物叶片相对电导率的测定17]称取0.5g新鲜叶片,加5ml超纯水,分成两等 份,一份于25?,40rpm振荡4h,另一份于沸水浴中加热5min,分别用 DDB一6200型数字电导仪测定溶液电导率,前者为Re’,后者为Rc,相对电导率为 Rc/Re’×100% 1.2.7植物大分子渗漏值的测定根据Leopeld方法略加修改进行,用打孔器自新 鲜叶片钻取5个圆片(O.5cm),加入超纯水2ml,室温下40rpm振荡4h后紫外比色 测定OD吸收,得到的是总渗漏值. 2结果 2.1转基因植株的筛选共培养后的草莓分生组织块在添~n6BA10mg/L,2,4一D 0.5n培/L卡那霉素20mg/L600mg/L头孢霉素的MS培养基上,培养20天后再生小 芽,这些小芽在附加30mg/L卡那霉素的无激素的MS培养基tMso)中lO天后部分形成 小植株,在含50rag/L卡那霉素MS培养基中筛选3代后,共得到l7 株卡那抗性植株,共 转化的烟草叶片在附加O.1mg/LIAA,lmg/L6一BA的MS培养基中3o天 遗传24卷 后再生成小植株在100mg/L卡那霉素浓度上共得l2株烟草抗性植株 2.2卡那霉素抗性植株的耐盐性鉴定转化植株均表现出一定的耐盐性,其中草莓对 照在O.4%NaC1培养基中20天后全部死亡,而12株转基因草莓生长基本正常(图版 I一1)其中7株在O.7%NaC1培养基中仍可缓慢生长(图版I一2).转基因烟草在1% NaC1水平上和对照无明显差异;在2%NaC1水平上,转基因植株可在MS0培养基中生 根,对照植株不能,但生长基本正常(图版I一3,4).转基因和对照植株的耐盐性随着在含 NaC1培养基中继代次数的增多而增加,这在烟草中尤为显着. 2.3转基因植株检菌将筛选5次的卡那霉素抗性植株切碎,在YEB培养基中28? 下振荡培养两天,培养基中未见农杆菌生长,将上述液体培养物涂在YEB固体培养基 上,28?培养2天,未见农杆菌生长说明所检测的植株无农杆菌污染 2.4转基因植株的PcR检测用山菠菜BADHcDNA扩增引物对转基因植株进行 的PclR检测说明,l7株抗卡那霉素草莓和l2株抗卡那霉素烟草均有约1.0kb的扩增条 带而对照植株没有(图版I一5) 表1转基因草莓烟草BADH活性测定 Table1BADHenzymeaofuans~plants 对照 Ntmlberoftmnsgemc 12345 CK 烟草Tobaccon?4004555l0 草莓s?a州0.4525ln0l50430 表2转基因草莓,烟草的相对电导率和大分子渗漏值 Table2Thetelati~de~-oniccondt~-tivityandn-~nbranepermeabilityof?m S目m1cplants 植株号对照 l2345 NumberofplantsCIK? 大分子渗漏值 Laakagerateofn3l041m29n2l0230l9 草莓 ??an?lol酬 - 鬯l相对电导率 c/n’toer~s Retati~dectronicn43039n性0l7029 eon&~-tivity 大分子渗漏值 烟草I栩karateof029n370篮0笠n170M Nieottana??anmOl0:uI嚣 相对电导率 Relati~demonic042051n37nl502l023 conductivity 1期刘风华等:转甜菜碱醛脱氢酶基因植物的耐盐性研究57 2.5转基因植株的BADH活性测定选耐盐性检测中表现较好的转基因烟草和草莓 各5株进行BADH活性测定,其活性单位为在给出的反应体系下,每10min产生lnm NADH定义为1个酶活力单位.测定结果示于表1.由表l可见,对照未能测出BADH 活性,转基因株中均能测出BADH活性,但有较大的个体差异. 2.6转基因植株Northern杂交分析对检测到BADH活性的转基因烟草和草莓进行 Northern杂交分析,其中烟草和草莓各有2株酶活较高的植株检测到转录体(图版I一6). 27转基因植株相对电导率和大分子渗漏值的测定取上述转基因草莓,烟草各5株进 行盐胁迫下相对电导率和大分子泄漏值测定(表2).转基因植株的电导率和大分子渗漏 值低于对照,表明转基因植株受盐害程度低于对照. 3讨论 Lone和Zhao指出,外源甘氨酸甜菜碱能提高植物对盐和冻胁迫的耐性, Holmstrom【1995)等人将大肠杆菌中涉及甜菜碱生物合成第二步反应的甜菜碱醛脱氢酶 (BADH)基因(BetB)转人烟草并证明了无论导人的基因中是否带有叶绿体转导肽基 因,均能在转基因植株中表达,并提高其抗胁迫能力.我们从耐盐植物山菠菜中克隆 了BADHeDNA,在大肠杆菌中检测了它的表达活性?.本文中用含组成性表达双35启 动子的植物双元表达载体pBin438经农杆菌介导将BAD|{基因导人草莓和烟草,得到 了能耐0.4%,0.7%NaO的转基因草莓与耐2%NaC1的转基因烟草,此结果与 Holmstrom等人的结果基本一致. 在转基因植株的筛选中,我们先将转化植株经3,5次卡那霉素筛选后再直接经盐 胁迫筛选,选择耐盐性提高的植株,进行分子鉴定.PCR检测表明,所选的植株均有 外源基因插入.检菌实验表明,在转化植株中投有农杆菌污染,因此PCR所扩增的片 段的确来自导入植物中的BADH基因这一程序缩短了转基因植株的筛选,同时也说 明由胁迫选出的转化植株的耐盐性由转基因所致,而不是对胁迫的适应. BADH活性测定说明,对照未能测到&}H活性,而选取的耐盐草莓和烟草各5 株均能检测到.然而,无论是转基因草莓还是烟草,个体间BADH活性差异很大(表 1),这些差异可能是由外源基因嵌入染色体的位点不同所致.&}H活性与转基因植株 的耐盐性是否相关,有待进一步证明. 膜的大分子渗漏值和相对电导率与所取材料的生长状态有很密切关系,为了实验的 准确,我们尽量选取相同生长状态的叶片进行测定.从表2看,在胁迫下,大多数转基 因植株的膜损伤小于对照,同时与转基因植株的BADH活性似呈正相关 烟草长期以来作为模式植物广泛用于植物基因工程.本文表明,在组培过程中,随 继代培养次数增加,其耐盐性也有很大增加,可从O5%NaO升高至1.5%NaO,甚至 在2.0%NaO下也能存活(不能长根),而相对来说草莓,油菜等这种现象较不明显,草 莓在十多代的继代培养中,仍不能在附加0.2%NaO的Ms0培养基中正常生长,其耐 盐性本底远低于烟草.因此烟草作为耐盐基因工程的模式植物是不恰当的.转基因草莓 的农艺性状及田间抗逆性试验正在进行中. 致谢方荣祥教授提供表达载体pBin438,朱桢教授提供农杆菌,作者深表谢意 遗传24卷 参考文献 1肖岗,张耕耘,刘风华等科学通报,1995,帅【8j:741,745 2陈受宜等植物,1991,569,573 3李太元,田颖川,秦晓峰中国科学(B辑),1994,24(276,282 4谭常,扬惠东,余叔文.植物生理学实验手册,1955,上海植物生理学会 缩,上海:科学技术出版社,67 5l-Iirof~liS-(3hieN,DTHaImdPIamP0I,1990,1117..631,638 6HNm~mK—O.B,WelinAMmTilePla~tJ.,1994,6【5k749,758 7LepoldACRPw?g?1984,GH(.Salinity目扣 ?inPlan~Wiley~NewYorkPP67 8MI,JSH,Kt~tlRGWyaJoaes,el:JExD.Bet,1987,强479,490 9MeCueKF,ADHansonTE~I-I,199emePlantsWithB~[1ItelINA LIUFenghuaGUOYahGUDo~meiXIAOGang CHENZhenhuaCHENShouyi (1nscit~eof&,,a掰l日’o/Science盈罾1~101) Atriplexhortan~BADH 【batainealdehydedehydrogenase)cDNAwastranfferredinto 日ra?七 errvandtobaecobyagrobactefium-mediatedtransformation.Thesalt-toleranceof transgenicplantswasmuchhthantheircontrol.expressi0n0fBADHgenewas deteO.edinthetransformedplantsbyNorthea~blotaddBADHenzyme-assay.Therela- tiveelec~onic,conductivityandme~branepermeabilitydemonstratedthatthed[标签:快照]