聚唾液酸修饰铜锌超氧化物歧化酶的研究（可编辑）

聚唾液酸修饰铜锌超氧化物歧化酶的研究（可编辑） 独创性声明 .毛 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果.尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外, 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含本人为获 得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示 谢意. 日 签 名: 期: 乃。,? 盐:丝 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定: 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘, 允许论文被查阅和借阅,可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文,并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致. 保密的学位论文在解密后也遵守此规定. 签 名: 导师签名: 盐臣 日 期: 纽:笸:? 聚唾液酸是唾液酸单体以仅.,或/和【.,糖苷键连接起来的线性聚合物,具 有强亲水性、生物可降解性和很好的生物相容性。因其更有效的安全性,聚唾液酸被公 认为传统药物缓释材料聚乙二醇的理想替代材料。聚唾液酸修饰又称为聚唾液酸 化,即在蛋白质或多肽类药物表面通过化学交联的形式共价连接聚唾液 酸,以提高蛋白质或多肽类药物的稳定性和药理学效能。 为了使聚唾液酸纯度满足药用需求,本论文在原有粗品聚唾液酸提纯工艺的基础 上,进一步延伸了聚唾液酸的纯化工艺。发酵液经离心、乙醇沉淀、碱性沉淀和氯代十 六烷基吡啶络合处理得到纯度为%左右的聚唾液酸粗品,粗品溶解后再经超滤 . 和 凝胶层析处理,得到高纯度 离子交换层析和巧 聚唾液酸样品,累积回收率.%。该工艺得到的聚唾液酸蛋白质含量为.× 咖 ,内毒素去除率大于.%,经分析,纯度为.%,峰均相对分 子量为.,各种指标均已达到医药级水平,可用于聚唾液酸化修饰药用蛋白。 本文选用铜锌超氧化物歧化酶.作为聚唾液酸修饰的靶向蛋白,初步测定 其原始酶活为.× / ,经.电泳分析,呈电泳纯,分子量为 。 分别以高纯度聚唾液酸和.为糖链供体和靶向蛋白,本文建立了一条完整 高效的聚唾液酸修饰.的工艺。聚唾液酸经活化后通过共价键连接到表 .凝胶过滤层析对聚唾液酸修饰的进 面的上,再用 甜 行纯化。以修饰酶交联比和酶活保留率为优化目标,通过双指标正交优化实验, 确定了:摩尔用量比:,反应温度?,反应.为聚唾液酸化的 最适反应条件。该工艺下制得的.的平均交联比为.士.,平均酶活保留率 为.士.%。 .电泳分析聚唾液酸修饰前后的分子量从?增大为~ 。用原子力显微镜观察到修饰酶分子粒径为~,约为修饰前的倍。修 饰酶表面有一层云状包覆,呈单颗粒包覆和多颗粒包覆两种显微形态,分别对应单酶修 饰和多酶修饰两种修饰方式。法测得修饰酶氨基平均修饰率为.%,并通过蛋 白残基可及性分析,推测可能被修饰的位点为,,,,。进一步的验证实验 表明,经聚唾液酸修饰后,不仅保留了较高的天然酶活性,而且在酸碱稳定性、热 稳定性和抗酶解稳定性方面明显优于天然酶。 关键词:聚唾液酸;铜锌超氧化物歧化酶;修饰;形态表征;酶活稳 定性、, /仅,止. 弱 坝笋时锄 妙 ’ .? 印 .够 印. 谢廿 , 嬲, ? ,血 切, . 硒嬲 匆嬲: 谢 . 劬 , 诵 啪,嬲 %. 勰如 旬阻 耐 嘶 ? 锄瑚 , 啪 巧 .%. 舀.. , 巧 ?妙 . × 嬲 / ,锄 .%. .% .【. “, 锄 锄 , .勰嬲? 吐哦 也 弱 . 仃 仃 ,谢 盯 时 .× / . 嬲 私 锄 唱 ,廿 嬲 锄 矗弱 . 恤舶耐 嬲,砌 面 】的鲫. 培舡 劬 嬲狐锄 璐璐’柚删鹊:: .. 嬲 母洒 :,?锄 、? .士. ,埘廿豫 .士.% 璐. 埘 也 仃 弱丘~ . 也 ? 弱 ~ .., ,,: 唱 . 舔仕屺 】嬲.%,孤 觚 陀,,,, 够 砌 哆 细鸸犹斌 辩 硒锄劬憎 嬲嘶矗咖弱 . : ;? ;矗;‘ 此蕴;了 哆 目录 目 录 摘要。... 目勇匙. 第一章绪论?.. .聚唾液酸的概述.,聚唾液酸的结构??. ..聚唾液酸的理化性质 ..聚唾液酸的生产纯化方法? ..聚唾液酸用途与衍生化研究现状? ..聚唾液酸修饰优点? .模型蛋白铜锌超氧化物歧化酶概述 ..超氧化物歧化酶的理化特征 ..铜锌超氧化物歧化酶的结构 ..选择铜锌超氧化物歧化酶作为模型蛋白的原因? .课来源.本论文研究的目的和内容? 第二章实验材料与方法??. .实验材料??. ..原料? ..主要试剂..层析材料..主要仪器.实验分析方法?...?. ..聚唾液酸含量测定?. ..聚唾液酸平均分子量分析? ..蛋白质含量测定?. ..内毒素含量测定 ..交联比的测定 .. 酶活及酶活保留率的测定目录 ..蛋白质羰基含量测定??。 ..十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳?..原子力显微镜? .. 蛋白氨基修饰率测定..修饰酶稳定性研究 第三章结果与讨论? . 原料聚唾液酸纯化及聚唾液酸和性质分析..聚唾液酸的纯化?。 ..聚唾液酸的分子量分析?. . .的.分析? .. 初酶活分析?.. . 聚唾液酸修饰.的制备与优化..聚唾液酸的活化?. ..活化聚唾液酸对的修饰 ..活化聚唾液酸修饰.的条件优化?:? ..活化聚唾液酸修饰的工艺? . 聚唾液酸化铜锌超氧化物歧化酶修饰产物的鉴定分析..修饰酶的.电泳分析?. ..修饰酶的原子力显微镜分析??. ..修饰酶游离氨基修饰率测定和修饰位点预测?.. ..修饰酶稳定性研究. 第四章主要结论与展望.主要结论?. .展望?. 致谢。 参考文献??.. 附录..第一章绪论 第一章绪论 随着医药生物技术的快速发展,蛋白质和多肽类药物占审批通过的新药比例 越来越高。但是,这些蛋白质和多肽类药物在常温下稳定性差,不易保存,摄入机体后, 易被体内酶降解,并且通常具有较强的免疫原性,导致其在机体内半衰期较短等缺陷, 这也成了众多蛋白质和多肽类药物广泛应用的瓶颈。目前,最常 用的方法就是对蛋白质 分子进行化学修饰,如在蛋白分子上引入一些亲水性的大分子如聚乙二醇、右 旋糖苷、白蛋白、明胶和淀粉等聚合物【】,来改变其结构和生理生化特性。其中化 是目前化学修饰蛋白及多肽类药物的主流方法,并已获得美国批准 【】。通过修饰可以很大程度上提高蛋白质分子的结构稳定性,降低其在体内的免疫 原性和抗原性,延长其半衰期。但该方法最大的问题是修饰技术用的大分子 不可透过肾脏透析膜排出,降解缓慢,容易在体内膀胱中积累;来自体外系统的 大分子在人或动物体内缺乏相应的降解酶,不具有生物降解性;本身可能形成 新的免疫原,因此尚难评估积累该物质对机体的长期效应【。除此,活化极易水解, 在制备过程中只能存在约.,制备价格极其昂贵,制备工艺中用到的大量有机试剂也 对生物安全性造成隐患。因此急需发现一种来自生物体内,天然安全的可替代修 饰蛋白和多肽类药物的生物缓释材料。在这样的大背景下,科研 工作者发现了聚唾液酸 “ ,的广阔应用价值。 .聚唾液酸的概述 聚唾液酸 ,是一种来自生物细胞表面糖蛋白和糖脂糖链末端的 天然多糖高聚物【,具有链蛋白酶抗性【。年了和【】首先在西办,.砌蛔, ,勋砌”砌幻“阳, .和.中发现该聚合物,以后陆续在心触厂肠加删砌 护口胞,.痧“甩讲 中发现该物质【。近年来,随着对聚唾液酸理化性质、生理功能、 合成与代谢等研究的深入,聚唾液酸在医学等领域的应用越来越广泛。 ,是一类神经氨酸的衍生物【。由 聚唾液酸的降解产物一唾液酸 于唾液酸是动物细胞表面糖蛋白和糖脂的末端寡糖,在细胞粘附和信号识别等生物过程 中起重要作用,可干扰细胞识别和掩蔽其它分子,因此含聚唾液酸或者唾液酸的物质进 入机体则表现非免疫原性【】。 ..聚唾液酸的结构 聚唾液酸由唾液酸.乙酰神经氨酸单体以.,和/或仅.,糖苷键连接起来的 【。 同聚壬酮糖。也可以看成酸性氨基糖,呈高度线性聚合物【,分子量在 聚唾液酸主要有三种结构【】?,如图.所示,其中伍.,糖苷键连接的聚唾液酸末端相 邻的两个单体形成内酯甲单体的羧基和乙单体的号碳位上的羟基脱水缩合形成, 对聚唾液酸的稳定起到一定的作用,所以大多数的聚唾液酸以.,连接的形式存在【。江南大学硕士学位论文 同时人体中只有.,连接的聚唾液酸,所以只有.,连接的聚唾液酸可应用于蛋白 质或多肽的修饰【 。 图?聚唾液酸的三种结构 ?仃? .? ..聚唾液酸的理化性质 聚唾液酸为白色粉末的不定型高聚物,在酸或碱中不稳定,容易降解。聚唾液酸 .,在中性溶液中表面呈强电负性,低黏度,具有很强的水化能力,良好的生物降 解性和天然的生物相容性【。 ..聚唾液酸的生产纯化方法 微生物发酵法是生化反应过程,是目前的主导方法,该方法生产的聚唾液酸结构稳 定,成本低,医用附加值巨大。聚唾液酸以荚膜的形式存在于少数几种细菌细胞表面, 液体培养时,它以粘液的形式释放到发酵液中。幽掣】于年采用觥. . 发酵产聚唾液酸的产量为. /。洲?撕等【于年采用?, 发酵产聚唾液酸的产量为. /。觚等【】于年采用大肠杆菌分批补料 发酵产聚唾液酸,产量为. /。印等【墙】于年通过溶氧反馈发酵产聚唾液酸 第一苹绪论 , 的产量为‖。郭良栋等【】利用 .发酵产聚唾液酸的产量为.‖。目前德国 莱布尼兹大学,已完成 规模发酵和克级水平的提取。印度血清研究所,达到了 规模医药级聚唾液酸的制备。 本实验室对聚唾液酸的发酵生产及提取研究处于绝对的领先地位,有十多年的 积累。詹晓北等【从年开始采用?, 发酵产聚唾液酸,研究了 控制工艺、分批补料工艺和分阶段控制搅拌转速工艺,产量达到 /。同时,本实 验室詹晓北、李文强等【】先后研究了超滤.乙醇沉淀、、乙醇分部沉淀方法提取 聚唾液酸,郁丹风等【】在乙醇沉淀过滤和碱性过滤结合的基础上,根据氯代十六烷基吡 啶与聚唾液酸的特异性络合对聚唾液酸进行进一步分离纯化,纯度达%左右。 本研究室目前已与浙江长兴制药有限公司合作,完成 的中试发酵生产。这些为 修饰蛋白质打下了坚实的基础,因用于药物缓释材料,有必要先制备高纯度聚唾液酸。 ..聚唾液酸用途与衍生化研究现状 聚唾液酸是一类有价值的新型药物前体物质【,,是目前发现的能够替代聚乙二醇 的最好的天然可降解缓释材料【’。聚唾液酸修饰又称为聚唾液酸化,是在生物活性分 子表面通过化学交联的形式共价连接上聚唾液酸。目前全球对于聚唾液酸缓释应用的研 究尚处于起步阶段。伦敦大学的研究小组以聚唾液酸为糖链供体, 成功地将 聚唾液酸分子连接到天冬氨酰酶、干扰素、 胰岛素和人红细胞生长素等’】蛋白质分 子上。研究结果表明聚唾液酸糖基化修饰后的蛋白质分子,在血液中的半衰期大幅提高, 免疫原性和抗体性降低,抗蛋白酶酶解的能力增强。并临床试验了聚唾液酸化干扰素, 发现其效果比化的干扰素的半衰期更长。该研究小组成立公司,最近,该公司与印度血清研究所蛐 合作生产聚唾液酸,并且获得 万美元的风险资金用于开发治疗糖尿病、肺炎球菌感染和丙肝药物的聚唾液酸控释 药物。聚唾液酸应用于蛋白质和多肽类药物的可降解缓释剂已取得良好效果,此类药物 即将上市,争夺全球约亿美元的市场份额。 ..聚唾液酸修饰优点 聚唾液酸用于修饰的优点可通过与聚乙二醇修饰的对比得出,见表.。 表.聚唾液酸修饰与聚乙二醇修饰的对比 一聚唾液酸修饰 聚乙二醇修饰 江南人学硕士学位论文 .模型蛋白铜锌超氧化物歧化酶概述 ,是一类能够催化超氧阴离子发生歧 超氧化物歧化酶 化反应的金属酶。它可用于治疗由氧自由基引起的一系列疾病,如:关节炎、类风湿关 节炎、缺血再灌流综合症等,此外其在抗辐射、抗肿瘤、预防衰老和自身免疫治疗等方 面也发挥着重要作用【引。 .. 超氧化物歧化酶的理化特征 根据活性中心结合的金属离子不同,主要分为三类【】,见表.。其中,铜锌 超氧化物歧化酶. ,亿.具有最深入的研究,结构明 确,应用广泛,来源丰富,故本研究选用猪血.作为研究对象。 表.三类主要的理化特征 . ? .. 铜锌超氧化物歧化酶的结构 年,等【用.衄?.射线衍射晶体结构分析得到.的三维结构, 它是由两个相似的亚基通过非共价键的疏水相互作用和静电相互作用缔合成的二聚体, 每个亚基分子量为,各含一个和一个。年,盯等【】获得 了牛红细胞血.的.分辨率电子密度图,显示出其结构核心是一个 由八股 反平行的折叠围成的圆筒状结构,整个结构中结构占.%,螺旋仅占.%, 其余无序结构占.%。 .的活性中心是以和为双中心的二桥结构.,如图.。 与,,和咪唑环上的原子配位,形成畸变的平面四方 形结构,其轴向位置上还结合着一个水分子,与酶活催化有关;?则与,, 和配位形成变形的四面体结构,一方面调节咪唑基与之间的相互作 用,另一方面起稳定活性中心结构的作用。活性中心的精氨酸和组氨酸对的 催化活性具有极其重要的意义。这两个氨基酸离中心金属离子非常近,而且均带有正电 荷,能诱导底物。进入活性中心,并可在催化过程中提供旷以加快歧化反应速度,如 这两个氨基酸残基被破坏或修饰,将会失活。肽链内部由和的巯基 构成的唯一一对二硫桥,对亚基缔合起重要作用瞰】。 第一章绪论 图 ?的晶体结构咖陀 .? 口 由此可见,位于活性部位的、和觚多位于分子内部,被多个折 叠围成的圆筒状结构所保护,不适合被修饰。形成的巯基对维持.的稳定 性起着重要作用,故不易采用.连接的修饰方法。而表面共有个可被修饰的 赖氨酸,所以本研究选用.连接的方式对表面的游离氨基进行修饰。 .. 选择铜锌超氧化物歧化酶作为模型蛋白的原因 .功能强大,可用于清除氧自由基,在化妆品,食品,医学上用于炎症,肿瘤,抗 衰老,休克,氧中毒,辐射损伤掣】: .存在半衰期短,只有~,口服易被胃蛋白酶水解失活,体内注射易被血浆蛋 白水解酶降解,分子量大不易透过细胞膜,异源蛋白免疫原性等缺陷急待克服【: ..来源丰富,研究较多,实验方法可行,经结构研究,表面具有多个可 修饰位点,同时在化学修饰时,酶构象结构稳定【。 .课题来源 本课题是江南大学自主科研项目基金的资助项目和国家 计划项目的重要组成部分。 .本论文研究的目的和内容 为了解决在医学应用上的缺陷,本研究拟采用聚唾液酸修饰的方法来改变其 表面形态,提高稳定性。通过考察聚唾液酸修饰条件对交联比和酶活保留率的影响,期 望建立一种聚唾液酸修饰蛋白质赖氨酸的方法并对修饰酶进行一系列表征,对其它蛋白 质和多肽类药物的聚唾液酸化亦有很大的参考价值,为蛋白质类新药的开发提供新的理 论指导和技术支持。另外,这种基于体外聚唾液酸化的研究方法,为进一步揭示糖基化 修饰规律提供了新的思路。 本论文的具体研究内容主要分为以下几个部分: 江南大学硕士学位论文 .在原有聚唾液酸发酵和聚唾液酸粗品提纯工艺的基础上,进一步延伸了聚唾液酸 的纯化工艺,以降低样品中蛋白质和内毒素的含量。对纯化聚唾液酸进行纯度、 分子量和分布宽度分析,对模型蛋白.进行初步的纯度、分子量和酶活 力测定。 .对特定分子量的高纯度聚唾液酸进行活化处理,得到活化聚唾 液酸,用于 .的修饰。建立聚唾液酸修饰皿.合成及纯化方法。考察交联比 和酶活保留率两指标,对聚唾液酸修饰反应条件反应温度、反应和与 用量摩尔比进行优化。 .对聚唾液酸修饰的.进行一系列表征。用.电泳、原子力显微 镜表征修饰酶的分子量、分子微观粒径和显微形态,并在此基础上分析 修饰酶的交联比和连接方式。用法测定修饰酶表面游离氨基修饰率,结合 蛋白残基可及性分析,预测修饰位点。从酸碱稳定性、热稳定性和抗酶解稳定性 三方面比较.聚唾液酸化前后的酶活稳定性变化。 第二章实验材料与方法 第二章实验材料与方法 .实验材料 ..原料 .聚唾液酸用微生物发酵法【】制备,所用菌种为大肠杆菌西办,.砌蛔, 作者所在研究室选育‘,引。 .铜锌超氧化物歧化酶由浙江康基生物公司提供,猪血提取物,分子量?。 ..主要试剂 试剂名称 英文名称 纯度级别 购买公司 高碘酸钠 ?.%,分析纯 国药化学试剂 氰基硼氢化钠 分析纯 试剂 乙二醇 分析纯国药化学试剂 聚乙二醇万 分析纯 国药化学试剂 碳酸铵 分析纯 国药化学试剂 十二水磷酸氢二钠 分析纯 国药化学试剂 二水磷酸二氢钠分析纯 国药化学试剂 氯化钠 分析纯 国药化学试剂 一水柠檬酸分析纯 国药化学试剂 硼砂 分析纯 国药化学试剂 氢氧化钠 分析纯 国药化学试剂 间苯二酚 分析纯 国药化学试剂 盐酸 分析纯 国药化学试剂 正丁醇 分析纯 国药化学试剂 . 唾液酸标准品 分析纯丁酸丁酯 分析纯 国药化学试剂 南京建成生物工程研究 酶活试剂盒 生化试剂 所 ,,.三硝基 %,,分析纯 舯试剂 苯磺酸 上海聚源生物科技有限 胃蛋白酶 ,,生化试剂 公司 胰蛋白酶 哪 国药化学试剂 芝/,生化试剂 酒精 工业级 江南大学试剂库 珍珠岩 工业级 信阳崇真助滤剂公司江南大学硕士学位论文 氯代十六烷基吡啶 化学纯 上海青浦试剂厂 牛血清蛋白 生化试剂 国药化学试剂 考马斯亮蓝 分析纯 国药化学试剂 考马斯亮蓝匕 优级纯,生化试剂 北京索莱宝 丙烯酰胺 生化试剂 北京索莱宝 % 三羟甲基氨基甲烷 优级纯,生化试剂 舯公司 十二烷基磺酸钠 生化试剂 北京索莱宝 过硫酸铵 生化试剂 北京索莱宝 %,生化试剂 北京索莱宝 优级纯 甘氨酸 北京索莱宝 生化试剂 分析纯 溴酚蓝 北京索莱宝 生化试剂 生化试剂 .巯基乙醇 北京索莱宝 甘油 分析纯 国药化学试剂 破 标准蛋白 生化试剂 上海生工 三氯乙酸 分析纯 国药化学试剂 甲醇 分析纯 国药化学试剂 冰醋酸 分析纯 国药化学试剂 无水乙醇 分析纯 国药化学试剂 鲎试剂 分析纯 湛江安度斯生物公司 细菌内毒素 分析纯 湛江安度斯生物公司 工作标准品 细菌内毒素 分析纯 湛江安度斯生物公司 检查用水 ..层析材料 ..主要仪器 仪器名称 型号 生产厂家 电子分析天平 梅特勒.托利多仪器公司 不锈钢抽真空漏斗德国公司 第二章实验材料与方法 离心超滤管美国公司 透析袋 × 进口分装分离纯化系统 美国 金达分离纯化系统 . 上海金达生化 数显恒温磁力搅拌器 ?型 金坛市大地自动化仪器厂 摇床 上海国强生化 型 . 旋涡混合器 上海精科实业公司 数显酸度计 .型 中国杭州雷磁分析仪器厂 分光光度计 型 上海精密科学仪器公司 . 数显电导率仪 上海精密科学仪器公司 数显超级恒温槽 . 宁波新芝生物科技公司 真空泵 ..型 浙江黄岩求精真空泵厂 蛋白电泳仪 北京君意东方 . 稳流恒压电泳仪 南京大学 陶尿大字 凝胶成像系统 美国. 高效液相过滤色谱美国 冷冻干燥机 泵 美国原子力显微镜 加拿大 型 冷冻高速离心机 美国鲫公司 . 电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器公司 .实验分析方法 ..聚唾液酸含量测定 间苯二酚法【。 试剂配制:称间苯二酚 去离子水溶解,然后加入. 儿的 用 . 和浓盐酸 ,用水定容至 。 有机溶剂配制:用丁酸丁酯和正丁醇以:的体积比配制。 测定方法:取适量待测液于具塞比色管中,用去离子水稀释至 , 然后加. 试剂,混匀后沸水煮 ,冷却至室温后加. 有机溶剂,剧烈振荡后静置至 分层完全,用吸管吸取上层有机相置于比色皿中,空白作为对照, 在 处测定 吸光值。 ..聚唾液酸平均分子量分析 江南大学硕士学位论文 高效液相凝胶过滤色谱法。 样品处理:样品用流动相溶解,.岬膜过滤。 ×.舢【×;示差检测器, 色谱条件:色谱柱曲俐 流动相为. 蜘:;柱温为?。 儿,流速为. ..蛋白质含量测定 考马斯亮蓝法。 ..内毒素含量测定 凝胶法【】。 ..交联比的测定 交联比:指修饰酶中交联聚唾液酸与的摩尔之比,即平均每个分 子交 联上的聚唾液酸分子数。 测定方法:收集分离纯化后的修饰酶,冷冻干燥复溶后,测定其中聚唾液酸含量 和含量,计算摩尔比即为交联比。 交联比鸳瓣 .. 酶活及酶活保留率的测定 测定原理【】:黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤反应生成的超氧阴离子自由基‘,可 以氧化羟胺类化合物形成亚硝酸盐,经显色剂作用呈紫红色,胁处有最大吸光 值。待测样品中的对’有专一的抑制性作用,使形成的亚硝酸盐含量降低,进 而使比对照管低,再通过公式计算出待测样品中的活力。 测定方法【】见表.: 表? 酶活的测定方法.。。酶活/孵肚肋亟掣?%×半?蛋白含量孵 第二苹买验材料与万法 其中,一个亚硝酸盐单位为抑制率达%所对应的量,蛋 白含量通过考马斯亮蓝法测得。 酶活保留率%燃×。。% 六瓢孵孵’佰 在同等实验条件下测得的修饰前酶活,即天然酶的酶活为对照。 ..蛋白质羰基含量测定 法【。 测定原理:聚唾液酸在活化过程中非还原端的邻二醇结构被氧化为羰基。该基团 可与,一二硝基苯肼反应,在碱性条件下生成红棕色的,一二硝基苯腙沉 淀,此物质用盐酸溶解后在 处有最大吸收峰。用丙醛作标准参照测定聚唾液 酸活化百分率。 儿的试 测定方法:山待测液 /中加入“ 剂用 儿溶解,充分混合,置于黑暗中反应 ,每 漩涡一次,然 . 儿,立即形成红棕色沉淀,用盐酸溶解后测定 。 后加入“ ..十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳? 所用浓缩胶为%,分离胶为%,方法参见文献【。 ..原子力显微镜 原子力显微镜 ,具有原子级的高分辨率,测试成本 低、工作范围大,制样灵活等优点,可在溶液等接近生理环境的条件下进行观察,所以 已被广泛应用于生物相关领域样品的表面分析研究。目前,可用于观察水合活细胞 的结构【,,、测定细胞壁的弹力【,、探测聚合物分子的官能团图像和表面构象【】以 及确定分子识别的位点【’。 原理:当原子之间接近至一定距离时,会有微小的作用力,就是利用探针跟样 品之间这种微小作用力,对样品之间的磁畴分布、聚集状态和表面电荷分布等特征进行 探测,从而反映出样品表面形貌和表面力学性质。 制样:配制浓度大约为 /的样品水溶液,静置一晚,然后将溶液滴加到刚剥 离的云母片上,静置 后,用去离子水冲洗样品表面,用氮气吹干。 ,弹簧系数为 实验条件:室温,常压,针尖为岬单晶硅,共振频率为 /。样品扫描在轻敲模式下操作,像素密度为×,扫描频率为 ,扫描行 数是。 ..蛋白氨基修饰率测定 法【】。江南大学硕士学位论文 测定原理:,,一三硝基苯磺酸钠可与蛋白表面游离氨基发生反应, 生成的三硝基苯酚衍生物,在 处有特征吸收。可以和蛋白任意可接近 并且没有空间阻碍的发生反应,根据此原理对照修饰前后吸光值 即可测出蛋白氨 基修饰率。 . 测定方法:取“一定蛋白含量的待测液,加入 溶液% .%, 和 十二烷基磺酸钠溶液%,保持分钟。然后加入 ?恒温水浴保持,立即于砌处测量吸光值。 氨基修饰率%卜糕×。。% ..修饰酶稳定性研究 .修饰酶酸碱稳定性实验方法 取等量天然酶和修饰酶,溶于 缓冲液中,?水浴保温,定时测定酶活 力,参考人体内环境,值选择.、.、.、.、.、.、.和.。将天然 酶在不同值下时的原始酶活作为%对照,计算酶活保留率。 .修饰酶热稳定性实验方法 .中,于?和?水浴保温,定时 将等量天然酶和修饰酶溶于 取样测定酶活,将天然酶在时的原始酶活作为%对照,计算酶活保 留率。 .修饰酶抗酶解稳定性实验方法 将等量天然酶和修饰酶分别加入人工胃液和人工肠液中,于?保温,定时取 样测定酶活,将天然酶在时的原始酶活作为%对照,计算酶活保留率。 人工胃液的配制:. 的胃蛋白酶加入蒸馏水溶解并定容至“,滴加浓盐酸 调至.,混匀后待用。 人工肠液的配制:称取. 蒸馏水中,用. 儿 的溶于 调至.,加入. 胰蛋白酶,用蒸馏水定容至砌,混匀后待用。 第三章结果与讨论 第三章结果与讨论 .原料聚唾液酸纯化及聚唾液酸和.性质分析 ..聚唾液酸的纯化 本研究室对聚唾液酸的提取纯化工艺进行了一系列研究:用超滤.乙醇沉淀的方 法提取聚唾液酸,纯度约为%,回收率达%;郁丹风等【】研究了乙醇沉淀过滤 和碱性过滤结合的方法,并且根据氯代十六烷基吡啶对聚唾液酸的特异性络 合对聚唾液酸进行进一步纯化,纯度达%左右。本文作者协助张琦考察了超滤技术 【,】和柱层析技术【】去除聚唾液酸中蛋白质和内毒素的效果。 本研究拟在原有提取纯化工艺基础上,将粗提工艺与多级层析技 术相结合,去除 其中的蛋白质和大量内毒素,制备高纯度聚唾液酸用于后期蛋白 药物修饰。 ...聚唾液酸的纯化工艺 发酵液 ’ 去除菌体 离心 ’ 上清液中加入%山的氯化钠,加入倍体积的酒精,静置沉降上 沉淀用去离子水溶解后,加入%的珍珠岩抽滤 ’ ,珍珠岩抽滤 : 滤液调至 ’ 后,加倍用量%的络合,静置沉降 滤液调回 ’ 络合沉淀物用. 儿的氯化钠解离 上 加倍体积的酒精沉淀 ’ 用分析纯乙醇洗涤多次 上 溶解后冷冻干燥 得聚唾液酸粗品 ’ 超滤离心截留分子量为 ’ 嬲 离子交换层析 江南大学硕士学位论文 .,. 儿的线性洗脱, ’ 一 凝胶过滤层析 , . 儿洗脱, 】/ 姗 、 透析脱盐截留分子量为 上 冷冻干燥 得高纯度聚唾液酸 图.聚唾液酸的提取纯化工艺.? 印锄 ...聚唾液酸的纯化效果 从表.可以发现,经处理后得到的聚唾液酸粗品纯度为.%,考马斯亮蓝 法测得蛋白质含量为.× ,鲎试剂法测得内毒素含量为×~ / × ,累积回收率.%。聚唾液酸粗品经多级层析技术纯化后纯度达 / 到.%,其中蛋白质含量为.×。 ,内毒素含量为~ / /『 ,内毒素去除率大于.%,累积回收率.%。 考察各步的聚唾液酸回收率,凝胶过滤层析回收率仅为.%。凝胶过滤层析是 根据聚唾液酸与杂质的分子量不同,利用网状结构的凝胶分子筛来达到分离目的,交 换容量小,稀释程度大。所以在对纯度要求不苛刻的情况下,可省略凝胶过滤层析, 则累积回收率可由.%提高到.%。 表.聚唾液酸的纯化步骤及其纯化效果 ’ 提取步骤 回收率 累积回收率 纯度 嚣 糯熟 .% .% 乙醇沉淀 .% 珍珠岩过滤 .% .% .% .% 碱性过滤 .% .% 络合 .% .% .% .×矿 ×~× ~ 超滤离心 .% .% .% .×? .% .% .% .× ~ 离子交换层析 凝胶过滤层析 .% .% .% .× ~ ..聚唾液酸的分子量分析 用高效液相凝胶过滤色谱唧对分离纯化后得到的聚唾液酸样品 进行分 子量分析,结果如图.所示。结果显示样品中聚唾液酸纯度为.%, 重均分子量 第三章结果与讨论 为.,数均分子量为.,/得聚唾液酸的分布宽度为., 处于丰值的峰端聚唾液酸测得峰均相对分子量为.?。 . . . . . . 图聚唾液酸样品的图谱 .? 陋 锄 .. .的.分析 采用电泳对.进行性质分析,结果见图.。条带为标准 蛋白质酞,条带为还原性条带,条带为非还原性条带。电泳时,经. 巯基乙 醇处理的条带中的.被打开二硫键解离为两个类似的亚基,分子 量约为 ;而条带中仍以二聚体形式存在,分子量约为?,这与 等人【的报道结果一致。从图中可以看出,、条带为清晰的单一 条带,纯度基本 符合聚唾液酸修饰用要求。 霸黔” .???? .?????? ’ ’期瓣 锄黪?一,为单个 营 艮 . 期? 。,。?一为打开二硫键后的个亚基 稿鼬蹴图? 的图谱 :蛋白;:天然酶?::天然酶亚基 ? . 盯;:: 巧;: 巧 江南大学硕士学位论文 .. 初酶活分析 在波长眦下测得测定管吸光值为.,对照管吸光度为.,计算得 的初始酶活为.× / 。 .聚唾液酸修饰.的制备与优化 聚唾液酸修饰又称为聚唾液酸化,其实质是在蛋白表面通过化学 交联的形式共价连 接上聚唾液酸长链多糖。蛋白质分子中常见的用于化学修饰的基团有氨基、羧基和巯基 【引,其中赖氨酸的含量最多,具有较高的亲核反应活性,且都位于分子表面,便于进 行化学修饰,是目前应用最广泛的化学被修饰基团。林大威等【】研究报道表面共 有个可被修饰的赖氨酸。所以,本研究决定采用.连接的形式,将聚唾液酸非还原 端第位碳上的羟基先氧化为醛基再与蛋白质分子表面的游离氨基进行成肽反应,最终 实现的体外聚唾液酸化。该方法修饰概率大,条件温和,可以以较高的反应速率 与蛋白质偶联,目标修饰位点远离酶活性中心,对蛋白酶活的影响小,且操作简便,可 行性大。 本课题以特定分子量的聚唾液酸为原料,第一步对聚唾液酸进行活化处理。第二步 将活化聚唾液酸用于修饰血.,根据分子筛原理利用凝胶层析柱对修饰酶进行分 离纯化。本研究通过考察修饰度和酶活保留率双指标,优化了与原料用量比、 反应温度、反应等修饰条件,以获得合适修饰度、高酶活保留率 的聚唾液酸修饰, 并在该过程中建立完整高效的聚唾液酸化工艺流程。 ..聚唾液酸的活化 ...聚唾液酸的活化 聚唾液酸的活化机理】如图所示,在高碘酸钠的作用下,聚唾液酸非还原末端 .上的邻二醇结构被氧化为活性醛基。该方法简单易行,可选择性地活化聚唾液酸非 还原端,不会氧化环氧基结构和其余羟基,制备的活化聚唾液酸单一结构,利于后期修 饰反应的控制。 第三苹结果与讨论 ...一塑生一.,。, 图聚唾液酸的活化机理 锄. ? 图.为聚唾液酸的活化工艺,冷冻干燥后得到的活化聚唾液酸为疏松的纯白色絮 状晶体。用法分析其活化情况,对照标样丙酮测得活化率为%。 称取 加盖试管 于 上 / 加. 比:,氧化齐过量 上 室温避光振荡 上 加 乙二醇终止反应 ’ 继续振荡 上 在.%中?透析截留分子量姬, ’ 跟踪测定电导率约 脱盐完成 ’ 冷冻干燥 ’ 活化聚唾液酸样品 图.聚唾液酸的活化工艺 ’ . ....活化聚唾液酸的分离纯化 在活化过程中生成的碘酸钠、甲酸和甲醛等小分子杂质以及过量 的乙二醇都可通过 透析膜截留分子量除去。根据透析膜分子量分布曲线,选用 的截留分 子量旨在保证一定交换流速的同时尽量减少活化聚唾液酸的损失。用.% 代替超纯水作为透析液,以减少因浓差极化造成的样品过度稀释,避免涨袋影响脱盐效 果。多次实验的活化收率稳定于%以上,保证了较高的收率。 ..活化聚唾液酸对.的修饰 ...活化聚唾液酸修饰.的实验方案 修饰反应的机理删如图.所示:活化聚唾液酸非还原端的醛基与.表 面的自由氨基发生希夫碱反应,生成反应中间体双键,继而在的作 用下,双键被还原,生成稳定的.交联体。相对于等 是一个温和的还原剂,可以选择性地还原蛋白表面的双键,而不破坏蛋白的自身结构。江南大学硕士学位论文 生成希犬碱 用旧,温和还原 酶活化的????????~????二?????堋一~ 图活化聚唾液酸修饰的机理 .? 儿,加入活化的 修饰方法: 咖溶于磷酸缓冲液一定, 聚唾液酸过量,一定的:摩尔比和 咖,置于密封管中 。 在恒温下振荡 ...修饰酶的分离纯化 经聚唾液酸修饰后的分子量有明显增大,可根据其与未修饰酶、 过量聚唾液酸 和杂质小分子之间分子量的差异选用凝胶过滤层析柱进行分离 纯化。本课题采用 姗× 姗层析柱对聚唾液酸修饰酶混合 砌.凝胶过滤填料, 液进行分离纯化。儿进 凝胶柱用 .,儿. 蜥。表.中列出了与 行平衡,洗脱液为. 儿,洗脱速率为. 在 、姗和衄处的吸光值,其中咖为的特征吸收位置,姗为 蛋白质的吸收位置,根据三者相互间的数量关系,最终洗脱液选 用胁和咖双灯 检测可达到理想的分离效果。 表 与在、和舳的吸收值 ? 锄砌 衄,砌鲫 ?砌 由图.可见,为天然的凝胶过滤洗脱曲线,在 处呈单一对称峰,姗 和眦吸收曲线基本重合:为修饰酶的凝胶过滤洗脱曲线,砌处有一个吸收峰, 峰底较宽,姗和衄吸收曲线基本重合,推测该峰是经聚唾液酸修饰后分子 量增大所造成的前移,且分子量具有一定的分布宽度。武处有一高强度吸收峰, 的吸收明显大于的吸收,分析此峰为过量的聚唾液酸。此外,砌处还有一 眦和眦吸收曲线基本重合的小吸收峰,与中天然酶的出峰位置一致, 所以确定该峰为未反应的。取出峰管及其附近管的洗脱液进行蛋白质含量和聚唾液 酸含量分析,分析结果与在线检测洗脱曲线的结果一致。 第三章结果与讨论天然 修饰 凝胶过滤层析洗脱曲线 图, . ’ 二 盯 伊 . ..活化聚唾液酸修饰.的条件优化 衡量修饰反应前后酶活变化情况是评价化学修饰效果的重要依据。同时,修饰酶酶 活的变化与交联比之间也是相互联系的。等【】的研究发现,交联比越高,聚唾 液酸在表层形成的屏蔽越大,底物与活性位点结合的阻碍作用也越大,使得酶的 活性降低。但适度的修饰反而可以起到稳定酶构象的作用,使之对外界环境的适应性增 强,使酶活更加稳定;理想的修饰也可使酶具有更易被催化的构型。所以有必要对修饰 反应条件进行优化,考察纯化后修饰酶的交联比和酶活保留率两指标,以获得高交联比 的同时尽量减小交联反应对酶活的影响。 江南大学硕士学位论文 通过预备实验,发现交联比和酶活保留率受反应物摩尔比、温度和值等因素的 影响较大,并确定了其水平范围。因此了四因素三水平的双指标正交试验, 对:摩尔比、温度、值三因素进行优化,如表所示。 表.因素的水平 玑 . 锄 、, 首先考察交联比,从表.极差分析可知黜?,即各因素的影响大小依 次为::摩尔比,反应体系的值,反应的温度。因素为空白项,值最小, 仅为.,说明其余各因素间没有交互作用。只考虑提高修饰酶交联比的最佳组合为 ,即::摩尔比为:,反应体系值为.,反应温度为?。 表.实验方案和实验结果分析. 王王王王”一 ?垡 舢聊一舢舢舢聊垒塔汐 四柳啪四四柳柳姗盟嘶懈 . . . . 从图.中可以看出,随着反应体系中:从:增加到:,交联比增长明显, :继续增加,交联比则增长缓慢。这可能是聚唾液酸的强电负性造成的电荷竞争 .的中性条件下,交联比最高,偏酸或偏碱条件 和分子空间位阻共同影响的结果。 下都不利于交联比的提高。分析原因:当反应体系偏酸,蛋白质表面的游离?基与 旷离子结合形成小,不利于聚唾液酸的修饰;在过碱性条件下聚唾液酸则不稳定,笙三兰丝墨兰塑丝 . 容易降解,所以体系也不易过碱。体系温度对交联比也有一定影 响,温度的升高加速了 体系内的分子运动,增加了交联位点间的碰撞机率,因此随着体系温度的升高,交联比 呈增长趋势,从?到?,交联比增长较快,提高了约.,从?到?,交联比 增长则趋于平缓。 图.交联比趋势图..’’ . . 墨 沓 恻 . . . . : 温度? 考察酶活保留率,从表.极差分析可知炒砌》犯,即各因素的影响大小依 次为::摩尔比,反应的温度,反应体系的值。因素为空白项,此处最小, 说明其余各因素间基本没有交互作用。单考虑降低酶活损失,提高酶活保留率,这些因 素的一个最佳组合为,即::摩尔比为:,反应体系的值为.,反 ‘ 应温度为?。 表.实验方案和实验结果分析.乱 屯仉王一 ???????聊?一 盟 ??鱼加甜 四柳珊四四删柳珊皿啪捌 江南大学硕士学位论文 从图.中可以看出,随着反应体系中:从:增加到:,酶活保留率降低 缓慢,:继续增加,酶活保留率则快速降低。随着表面被聚唾液酸修饰的增 加,酶的活性位点被部分屏蔽,酶与底物的结合难度也相应增加。?温度下,酶活损 失最小,随着体系温度的升高,酶活保留率不断降低,且降低的速率有逐步加快的趋势, .中性条件下,酶活保留率达到最大值,但从 这与低温利于酶活保留的机理相符。 可知,因素影响较小。 图.酶活保留率趋势图.. , . . 誉 莓. 跚 莲鹄. 避 . . . . . : 温度? 综合考虑交联比和酶活保留率两个指标,并且从高效节能角度出发,最大影响因素 :摩尔比选用:,反应温度选用?,体系值选用.,即可得到理想的修 饰效果,在保证修饰酶高交联比的前提下尽量减小酶活损失。 在此条件下进行重复验证性试验,结果见表.,修饰酶的平均交联比为.士., 平均酶活保留率为.士.%。 表验证实验结果 ’ ..活化聚唾液酸修饰的工艺 通过正交实验研究了各主要因素对交联反应两个考察指标的影响,确定了活化聚唾 液酸修饰的工艺流程与工艺条件,如图.。该工艺条件下制备的聚 唾液酸样品 经分离纯化后,用于进一步的性状分析和酶活稳定性研究。第三 章结果与讨论 溶于 的中 .,舢/ ’ 加入活化的 :摩尔比为: , 加入 咖后,立即加盖密封 ’【?振荡 得到初样品,.岬微滤膜过滤 上 凝胶过滤层析柱 填料 ., 儿,. / ,双灯检测衄, , 确定收集目标峰,冷冻干燥 酶活保留率和蛋白含量 .原子力显微镜 法 酶活稳定性 计算交联比 分子量 显微形态 表面氨基修饰率 图.聚唾液酸对的修饰工艺..聚唾液酸化铜锌超氧化物歧化酶修 饰产物的鉴定分析 ..修饰酶的.电泳分析 .??. 艄 爨譬 .?.?? , .?...? 一 .???? .?...图.天然酶与修饰酶的.图谱 :蛋白盯;:修饰酶;:天然酶::天然酶亚基,锄 巧 . ? ;: 巧;: ?;: 纠 : 江南大学硕士学位论文 对天然酶和分离纯化后的修饰酶进行.电泳检测。电泳结果如图. 所 示,条带为蛋白破,条带为修饰酶,条带为天然酶,条带为天然酶 亚基。经 聚唾液酸修饰后的分子量明显增大,约为~,表明其水合能力大大 增强, 在凝胶电泳中的迁移速率大大减慢。根据分子量为.,.分子量为 ,可以得出每个分子上连有分子数约为个。 ..修饰酶的原子力显微镜分析 可以得到纳米级的、清晰的生物样品形貌,测算分子的宽度和高度,尤其对 高度可以精确测算,并对生物样品表面电荷分布、聚集状态等结构特征进行评价【】。当 的探针在样品表面扫描时,样品表面的形状以形貌图的形式被记录下来。 图.、和分别为、天然和修饰的图像, 和的视野范围为岬×岬,的视野范围为岬×岬。在显微形态下连 成一片,呈大面积片状形态,则聚集成点状颗粒,经聚唾液酸修饰后的表面 有大片的云状包覆,粒径也有显著增加。具体的连接形态和粒径大小需对修饰酶进行进 一步的放大扫描观测。 图.聚唾液酸、天然和修饰的图谱 聚唾液酸的图;天然的图;修饰的图 锄 , . ?; 拶; 了 图.、和分别为修饰先后的图像,视野范围均为岬×岬, 图、和分别为左侧、和对应直线上的高度分布图。获取 纳米级扫描图像后,用软件程序测量样品的高度,底板为基准零 点。从图上可以 看出,修饰前天然酶呈均匀的小颗粒,分子粒径约为.~.姗。经聚唾液酸修饰后的 表面有一层云状包覆,平均分子粒径增加为~砌,约为修饰前酶分子粒径的 倍。同时也注意到,图.和显示修饰酶横向宽度差异较大,分析是云母 基底表面酶分子的取向不同所造成的。第三章结果与讨论 ; 墨。 盘昂???一.曩?.;??.;??. 啦 鼍:巴??~??. ; :? 主。: 。仝、.。.. 。/、~。. . /‘? 善。: 盔 ; ’, 。 。 童。耳色??。.;??一.;?‘.; 廿 . . . ’’ 呻岫 图?天然与修饰的解析图谱 天然酶;图线上的高度分布图;修饰酶;图线上的高度分布图;修饰酶, 白箭头指向单颗粒包覆形态,黑箭头指向多颗粒包覆形态;图线上的高度分布图 锄.一 锄”北; ?; 可;姗 ; ,,; 结合修饰酶的显微形态以及粒径大小,可知修饰酶有两种修饰方式,一种为单颗粒 修饰,图.中白箭头所指,呈单颗粒包覆形态;另一种为多颗粒修饰,图. 中黑箭头所指,呈多颗粒包覆形态。这是修饰位点数量和电荷排斥等原因共同形成的: 表面有多个可修饰.位点【引,由包覆形态推测进行的是多点修饰。聚唾液酸带 强负电性,由于修饰聚唾液酸相互间的电荷排斥作用,使修饰酶呈现单个酶被多个聚唾 液酸包覆的形态;当酶分子距离较近时,活化聚唾液酸不仅能修饰酶分子,还能发生自 聚合而使多个修饰体连接,发生的是多颗粒修饰,微观形态呈现为多颗粒包覆形态。江南大学硕士学位论文 ..修饰酶游离氨基修饰率测定和修饰位点预测 ...修饰酶游离氨基修饰率测定 经过聚唾液酸的修饰,蛋白质表面游离氨基与聚唾液酸活化醛基发生交联反 应,采用法来测定修饰酶表面游离氨基的修饰率,结果如表.所示。重复实验 显示,在优化条件下制得的修饰酶平均氨基修饰率为.%,即表面平均有. 个氨基被修饰。修饰反应是亲电修饰剂和亲核氨基之间发生交联。分子 中可以被修饰的游离氨基有多达个,每个酶分子上参与修饰反应的游离氨基的数目 以及结合的长链数目都不完全相同,即使是相同的氨基修饰率的蛋白质分子也会 呈现多态性。所以实验所得产物是不同氨基被修饰后的分子组成的混合物。具体 的位点修饰择优性,需要结合蛋白质残基可及性做更进一步的分析。 表.修饰表面氨基修饰率 ....蛋白质残基可及性及其对修饰位点的预测 水分子作环绕蛋白质分子的范德华壳层旋转运动,水分子中心划过的表面定义为该 蛋白的水可及性表面【】,即可及性。它反映了水分子可接近蛋 白质分子的程度,也反映 水分子可接近蛋白质分子中氨基酸残基的程度。相同的残基,其暴露程度越大,它与溶 剂分子接触的面积越大,与溶液中反应物反应的可能性也越大。通过对蛋白质表面性质 的理论分析,确定采用.连接的方式与表面的发生反应;通过. 分子量分析和原子力显微镜分子粒径的分析,可得连接到分子上的长 链数目约为个。林大威等【对.氨基酸残基可及性分析发现,、、 、和的可及性达~,故推测多糖长链就连接在这几位 上。而、的可及性为,与配位的四个氨基酸“,锄。,,。。。 及与配位的四个氨基酸。。,?,伯,。。的可及性都很小,所以、 两个离子完全被埋藏在分子内部。当长链与分子表面的赖氨酸残基结合时,对 活性中心的、离子及其配位的氨基酸影响都不大,所以对酶活的影响较小。 ..修饰酶稳定性研究 ...修饰酶酸碱稳定性研究 本论文主要考察了天然酶和修饰酶在不同值下酶活性的变化趋势;修饰前后最 适值的变化,结果如表.和图.所示。天然酶和修饰酶的酶活变化趋势几乎一 致,酶活稳定性随着酸性或碱性的增加而降低。修饰前后的最适 值范围也没有 .~.范围内,修饰酶的酶活保留 发生变化,其最适范围均保持在中性。在 .条件下,酶活稳定性 率均高于天然酶,尤其在强酸性 .、 .和强碱性 .条件下,后修饰酶酶活保留率分别为%和 显著提高。在强酸性 .和第三章结果与讨论 %,而天然酶活力保留率急剧下降,仅为%和%;处理后,差异更明显, 天然 .碱 酶活力保留率仅剩%和%,而修饰酶酶活保留率仍有%和%。在 性条件下,处理后修饰酶活力保留率约为%,也比天然酶高出近%。 表.修饰酶的酸碱稳定性实验结果 . 仃. 桫 拶 ? ? ? ? 零吾写号《日兽篮 加 ??一击矗曲耻??凼矗硼巧眦. ??一锄.??一鲥 巧睇 图修饰酶的酸碱稳定性 .陀 ..条件下不稳定,分析可能是在该强酸性条件下和 修饰酶在 .和 金属辅基离子的脱落,造成催化活性和结构稳定性的降低【。经聚唾液酸 修饰的表面形成的多糖水化层稳定了的空间结构,阻止了和金 属离子的脱离;相比的电中性,聚唾液酸具有强电负性,可缓合分子表层水溶 液体系的极性,尽量减小酶分子内环境的变化,可起到保护活性中心的作用。 聚唾液酸修饰明显改善了在酸性条件下的稳定性,对于人体服用具有重要 意义。江南大学硕士学位论文 ...修饰酶热稳定性研究 本研究主要考察了修饰前后在高温下酶活的变化趋势和相同处理时间后各自 的酶活保留情况。综合分析表.和图.,可以看出经聚唾液酸修饰的比天然 酶有了更高的热稳定性。如图.所示,天然和修饰在?和?的酶活 变化差异不大,都随着处理时间的延长活力呈下降趋势,处理时 间越长,修饰酶优势越 明显。在?水浴中,.小时时修饰酶比天然酶酶活保留率高出%, 小时时修饰 酶比天然酶酶活保留率高出近%。在更高的?条件下,趋势相仿, 修饰酶比天然 酶酶活保留率高出~%。温度增加对天然酶活的影响远大于