巨细胞病毒感染与血清结合珠蛋白表型的相关性

巨细胞病毒感染与血清结合珠蛋白型的相关性 巨细胞病毒感染与血清结合珠蛋白表型的 相关性 doi:10.3969/j.issn.10130—4&4X.2010.09.017 巨细胞病毒感染与血清结合珠蛋白表型的相关性 石蕊蓝三春王军扈江伟陈虎 (军事医学科学院附属医院造血干细胞移植科,北京100071) 中国图书分类号R730.3R392.11文献标识码A 巨细胞病毒(CMV)是人群中常见的一种疱疹病 毒,我国正常人95%血清学检查CMV—IgG呈阳性. 异基因造血于细胞移植术(allo—HSCT)后机体免疫系 统功能处于抑制状态,细胞免疫功能远未恢复,细胞 免疫功能的缺陷导致机体本身潜伏,供者细胞及输 血获得的巨细胞病毒复燃.巨细胞病毒感染引起的 死亡占allo.HSCT相关死亡的60%,问质性肺炎的死 亡率可达80%I2J.结合珠蛋白(HP)是清中a,球 蛋白组中的一种糖蛋白,受HPI及HP2等位基因控 制,在人类中主要有j种常见表型即:HP1—1,HP2—1, HP2—2具有遗传多态性.近年来大量研究表明,结 合珠蛋白的不同表在各种疾病中的分布不同,对 疾病的发生,发展具有潜在的易感及保护作用.心 血管疾病,免疫性疾病(HIV),寄生虫(疟疾)等甚至 将其列为预测疾病发生及预后的重要因素之一.其 不同表型问在免疫调节,抗炎症,抗氧化,结合血红 蛋白等作用上的不同,预示其在炎症的发生及发展 上均存在差异.国外及国内多种感染性疾病(结核, 细菌,真菌)均研究过其相关性_3j,但造血干细胞移 植后这种特定免疫抑制状态下感染的研究还属首次 报道.本文检测allo—HSCT后巨细胞病毒感染患者 HP表型并研究其与正常人表型分布之间的差异,现 报道如下. 1资料与 1.1病例 1.1.1临床资料巨细胞病毒感染组:所有病例均 来自于解放军军事医学科学院附属307医院移植科 确诊恶性血液系统疾病,按FAB诊断标准诊断14 例为急性髓性白血病,7例为急性淋巴细胞白血病, 7例为慢性粒细胞白血病,1例再生障碍性贫血,5 作者简介:蕊(1981年一),女,在读硕士,医师,主要从事造血干 细胞移植研究,E.mail:shmi@live.cn; 通讯作者及指导教师:陈虎(1962年一),男,博士,主仟医师,主要 从事造干细胞移植研究,Email:chenhu217@ ya}loo.con1.cn 国免疫学杂志2010年第26卷 文章编号1000-4S4X(2010)09一O836-03 例骨髓增生异常综合征,1例非何杰金式淋巴瘤. allo—HSCT后CMVDNA及CMVpp65检测阳性患者 35例.35例allo—HSCT出现CMV感染发生在移植 后+42,+68天.移植后平均第l6天造血恢复(粒 细胞>0.5X109)常规应用环孢霉素作为免疫抑制 剂预防移植物抗宿主病(GVHD),其中18位男性中 位年龄36岁,17位女性中位年龄4l岁.采取ED— TA抗凝外周血2ml,抽取500全血提取DNA,其余 全血离心机1900r/rain15分钟,提取血清装入EP管 一 80?冻存.正常人组:血库提取20名男性及20名 女性EDTA抗凝外周m2rT1l,处理方法同. 1.1.2蛋白垂直电泳系统购自BIO—BAD公 司,普通PCR仪购自Biometra公司,PVDF膜购自索 来宝公司,Taqpolymerase酶购自TaKaRa,ECL显色 液购自北京中山生物公司,胶片购自Koda公司,引 物合成于Invitrogen公司,羊抗人多克隆抗体购自 Sigma公司,抗羊二抗购自BioRad公司. 1.2实验方法 1.2.1蛋白免疫印迹分析(Westernblot)取5l 血清蛋白质样品加入25l2Xloadingbuffer及20 PBS放人EP管混匀100~C加热5分钟,冷却后取l5 l用15%SDS—PAGE分离后转移至聚偏氟乙烯膜 (PVDF膜),5%脱脂奶粉室温封闭2小时,羊抗人多 克隆抗体(1:20000)4ciC过夜,l%rrBsT洗PVDF膜 30分钟X3次,再加入抗羊二抗(1:5000)室温孵育 1小时后,用1%TB洗膜30分钟x3次.将化学 发光剂试剂盒中的A和B两种试剂按等比混匀加 至膜上,显影并用凝胶成像系统拍照采集图像. 1.2.2PCR基因组DNA完全按照DNAKIT (Biomed)提取,上下游引物A(5一GAGGC~AGCT1V,C— CT1TCCATFG一3),B(5'-GAGATIT13GAGCCCTGGCTG GT.3)用于扩增1757bpHpl及3481bpHP2基因; C(5一CCTGCCTCGTATI'AACTGCACCAT一3)和D(5. CCGAGTGCTCCACATAGCC-3)用于扩增349bpHP2 基因.501体系包括各2A,B或C,D引物,0.5 t*lTaKaRaTaqPo1)anerase,5/,1PCRbuffer,8 DNTP,2l基因组DNA,20.5l双蒸水.起始95o【= 石蕊等巨细胞病毒感染与血清结合珠蛋白表型的相关性第9期 2分钟,变性95%1分钟,退火及延伸69%2分钟, 终止72%7分钟. 1.3统计学分析利用SPSS13.0=进行fisherexact检验, P<0.05为差异有显着性,P<O.01为差异极显着性. 2结果 2.1基因型及表型通过PCR方法利用引物A,B 扩增全血提取的基因组DNA,产物为1757及3481 bp分别包含Hpl及Hp2亚基,c,D扩增后为产物 349bp仅包含Hp2亚基.产物通过1.0%琼脂糖凝 胶电泳.分别得到Hp2.1,Hp2—2及Hp1—1基因型 (图1).同时,通过免疫印迹分析(Westemblot)确定 UI.JU 2一l2—2l—l bp 3481 1757 349 图1PCR检查确定结合珠蛋白基因型 Fig.1Haptoglobingenotyping Note:HpgenotypingbasedOffcombinationoftheresultsoftwoseparateDNA amplificationreactionsinvolvingprimersAandBinthefirstreaction (1ane2,4,6)midpfime~CandDinthesecondreaction(】Rile3,5, 7)T}1ereactionsiOlaBe2and3contalnedDNAfromtheiodividual withgenotypeHp2-1;Thereactionsinlane4and5containedDNA fromtheindividualwithgenotypeHp2-2:Thereactionsinlanes6and 7containedDNAfromtheindividualwithgeno!ypeHp1—1Lane1. DNAsizemarker300—5000bp. 图2Westernblot检查确定血清结合珠蛋白表型 Fig.2Serumnpphenotypedeterminedbyimmuoblot Note:Polyelonalantitx~dyagainsthumanHpWaSusedtobindingtheHpon theblots.Lane1istheHpproteinstandardcontainingHp8chains,d1 ando2chains.Lane1-14showstheserumHpphenotypefrompatient1 topatient14listedinTable2.PatientswhohaveHpBchainanda1 chainindicateaHp1—1type;PatientswithHppchainanda2chainare Hp2-2typeandpatientswithalltheHppchain,a2chain,olchainin— dicateaHp2—1type. 表1表型频率分布对比 Tab.1StatisticalcomparisonoftheHpgenotypeinthepa- tientsandcontrolgroups 表型及基因型是否一致(图2),将提取的血清蛋白 经过加热后,进行15%SDS—PAGE,再将蛋白转印于 PVDF膜上,抗体结合后显影,可见8链(39kD),a2 链(17kD),a1链(10kD)(图2).HI)基因型及表型 结果未见差异. 2.2统计学结果通过fisher检验比较Hp不同表 型在CMV感染患者及正常人间的频数分布(表1), P=0.02<0.05,差异显着. 3讨论 HP是一种广泛存在于人类和许多哺乳动物的 血清和体液中的糖蛋白,位于第16号染色体a2基 因位点,受HP1和HP2等位基因控制在人群中呈孟 德尔共显性遗传.研究证明,HP在各型的人群分布 存在着明显的种族差异和地域差异,在人类遗传学, 免疫遗传学,法医学等方面被认为是一种极其重要 的遗传学标志.人群中HP2—2型在非感染性疾病 (心脏病,糖尿病),感染性疾病(结核病),免疫性疾 病(HIV)易感性及死亡率均较高_4J.功能而言, HP2—2较其他表型具有较低的抗氧化性,较低的血 红蛋白结合能力及较高的免疫反应性.免疫方面 HP具有调节辅助性T淋巴细胞1(Th1)因子及辅助 性T淋巴细胞2(Th2)因子的功能.HP2—2型不仅抑 制CD4T淋巴细胞对Th2因子(IL一4,IL-5,IL一10及 IL一13)的释放,另外严重减少内毒素刺激后单核细 胞对FIL一10及IL一12等Th2因子的合成,对 TH1因子的作用则不明显,表现为过激的免疫能 力[引.移植过程中放化疗,感染,应激等因素产生大 量的非配对电子如:活性氧自由基(ROS),活性氮自 由基(RNS),过氧硝酸根(ONO0一)等导致细胞膜,蛋 白质,核酸,脂肪等大分子的损伤.体内通过Vita— rainC,VitaminE,谷胱甘肽等维持细胞的氧化还原 稳态.Tseng等l.j证实HP具有表型依赖的较Vita rainC更强的抗氧化能力,其中HP1.1>HP2.1> HP2.2.铁离子是细菌,病毒,寄生虫等生长的重要 元素之一,HP能够结合体内外出血产生的游离血红 心 H 蛋白防止亚铁离子的流失,作为体内加强铁利用的 一 种方式.HP2—2型在3种表型中能力最低,大量 游离血红蛋白的存在不仅导致肾脏的损伤同时给微 生物生长提供优越的滋养环境l.Delanghe等【J通 过Westernblot检查确定653例HIV(人类免疫缺陷 病毒)感染患者血清结合珠蛋白表型分布(17.6% Hpl一1,49.9%Hp2—1,32.5%Hp2—2),通过Kaplml— meier(生存曲线)分析,HP2—2型患者的死亡率与其 他组比较(P=0.0001,RR=1.78,95CI=1.25, 2.54),H1)2—1及HP1—1中位生存时间为11年,HP2—2 型的中位生存时间仅仅为7.3年.184例HIV感染 患者及204例正常人血清铁,转铁蛋白饱和度,铁蛋 白水平比较,H?感染患者浓度明显高于正常人 (P=0.0001),其中HP2—2型患者血清铁,转铁蛋白 饱和度,铁蛋白水平最高,VitaminC水平最低.治 疗前HP2—2型血浆HIV一1RNA水平与其它(HP2—1, HP1—1)比较(P=0.03).即HP2—2型的HIV感染患 者预后较差,病毒复制较迅速.较高的铁累积量及 较低的VitaminC水平,导致氧化压力增大,可能为 刺激病毒迅速复制的直接原因.He等E9j研究HBV (乙型肝炎病毒)病人疾病相关的蛋白表达谱改变时 发现Hp血清水平明显升高,p链,改变明显. HP2—2型在免疫调节,抗氧化,血红蛋白结合能力等 方面的作用对巨细胞病毒感染的发生,发展,预后均 有重要的影响.目前,评估移植后巨细胞病毒感染 的危险因素包括供受者移植前CMV血清学检查是 否为阳性,是否存在急,慢性GVHD等.虽然,在移 植前对血清学阳性的供受者采取相应治疗,以及移 植后存在急,慢性GVHD患者CMV感染给予足够的 关注,CMV感染阳性率有所下降.但在造血干细胞 ? 消息? 中国免疫学杂志2010年第26卷 治疗的临床实践中仍然有患者死于cMV引发的间 质性肺炎,重度肠炎等.预示着仍有一些潜在因素 影响着cMV的发生,发展.结合珠蛋白是否是CMV 发生,发展的潜在危险因素,以及对m)2—2型移植后 患者给予常规预防治疗是否能够进一步减少CMV 的感染率及死亡率. 4参考文献 1徐志松,周建英,黄河.异基因骨髓移植后不同时期感染并发症 的临J术研究[J].中华血液学杂志,2004;25(8):496-498. 2陈力'平.高度重视造血干细胞移植后臣细胞病毒感染[J].中国感 染控制杂志,2005;11(3):193—197. 3VanVlierbergheH.IangloisM.Haptnglobinpolymorphismsandimn homeostasisinhealthandindiseaselJj.ClinChimActa,2004;345(1. 2):3542. 4MeneghinA,HogaboamCM.hffectiousdiseasetheinnateimmunere— spnnseandfibrosis[J].ClinInvest,2007;117:530.538. 5ArredouaniM,MattjoksP,VanHoeyveldEeta/.Haptoglobindirecflyaf一 ~ectsTcellsandsuppressesThelpercellstype2eytokinerelease[J].Im— munology,2003;108:144—151. 6rse"gCF,LinCC,HuangHYeta1.Anfioxidantroleofhumanhap— toglobinlJJ.Protc~)mics,2004;4:2221.2228. 7Kristian~nM,GravcrsenJH,JacobsenCela1.Identificationofthe haemoglobinscavengerreceptor[J].Nature,2001;409:198—201. 8DelangbeJR,[~gloisMR,BoelaertJReta1.Haptoglobinpolymor— phism,ironmetabolismandmortalityinHIVinfectionlJj.AIDS,1998; 12:1027—1032. 9HeQY,LauGK,ZhouYeta1.SerumbiomarkersofhepatitisBvilMsin— feetedliverinflammation:proteomiestudylJj.Proteomies,2003;5:666— 674 [收稿2010—04—09修回2010-05—08] (编辑倪鹏) 中国免疫学会血液免疫分会成立临床流式细胞术学组 中国免疫学会血液免疫分会7月23日正式批准在中国免疫学会血液免疫分会设 立临床流式细胞术学组,并于2010年8 月1日在北京大学人民医院召开第一次筹备会议,定于2010年9月11日在北京 召开首届临床流式细胞术学组成立大会. 中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组筹备组 2010年8月2日