【word】 双波长高效液相色谱法测定复方芦丁片中维生素C和芦丁的含量

【word】 双波长高效液相色谱法测定复方芦丁片中维生素C和芦丁的含量 双波长高效液相色谱法测定复方芦丁片中 维生素C和芦丁的含量 ? 30?安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2012Jan;16(1) 双波长高效液相色谱法测定复方芦丁片中 维生素C和芦丁的含量 孙银华 (安徽省马鞍山市药品检验所,安徽马鞍山243000) 摘要:目的建立复方芦丁片中维生素C和芦丁含量的测定方法.方法采用高效液相色谱法,甲醇.05mol?L磷酸二氢 钾缓冲液[磷酸调节pH=(3.0?0.1)](45:55)为流动相;流速1.0ml?min,;检测波长为254nm和355nm双波长测定.结 果维生素C在19.392,242.400mg?L范围内呈良好的线性关系,r=1.0000,平均回收率为99.14%,RSD:0.69%(n= 5);芦丁在9.3613—117.0165mg?L范围内呈良好的线性关系,r=0.9996,平均回收率为98.63%,RSD=1.19%(n=5). 结论该方法简便,准确,重复性好,能同时测定复方芦丁片中维生素C和芦丁的含量. 关键词:高效液相色谱法;复方芦丁片;含量测定;芦丁;维生素C DeterminationofvitaminCandrutinincompoundrutin tabletsbyHPLCwithdual-wavelength SUNYinhua (MaanshanInstituteofDrugControl,Maanshan243000,China) Abstract:0bjectiveToestablishamethodforthedeterminationofvitaminCan drutinincompoundrutintablets.MethodsThesep— arationwasperformedonHPLC.Themobilephasewasmethanol—potassiu mdihydrogenphosphatesolution(0.05mol?L)(adjusted pHto3.0?0.1withphosphoricacid)(45:55)ataflowrateof1.0ml?min,.The detectionwavelengthwasat254nmand355nm. ResultsThelinearofvitaminCwasintherangeof19.392—242.400mg?L(r= 1.0000).Theaveragerecoverywas99.14% andRSDwas0.69%(n=5).Thelinearofrutinwasintherangeof9.3613, 117.0165mg?L(r=0.9996).Theaveragereeov— crywas98.63%andRSDwas1.19%(n=5).ConclusionThemethodisconvenient,rapid,accurateandreproducible.Itcanbe suitableforthesimultaneousdeterminationofvitaminCandrutinincompoundrutintablets. Keywords:HPLC;compoundrutintablets;determination;rutin;vitaminC 2.7.2异喹啉物回收率试验取异喹啉物对照品贮备液,分 别精密取0.16,0.2,0.24ml,置20ml量瓶中,分3组(高,中, 低),共9份,每份按处方比例加入辅料及格列喹酮,再加入流 动相适量使溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,得续滤液,按上述 色谱条件测定.结果平均回收率为1130.3%,RSD=0.38%(n = 9).结果见表2. 2.8有关物质测定按2.2.2制备供试品溶液;精密量取1 ml,置100ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,作为对照溶液; 另取异喹啉物对照品,用流动相溶解制成每1ml中含10g 的溶液,作为异喹啉物对照品溶液.取供试品溶液,对照溶液 与对照品溶液各20l,分别注入液相色谱仪,记录色谱图至 格列喹酮峰保留时间的2倍,未知杂质采用自身对照法,异喹 啉物采用外标法测定.测定三批样品,结果见表3. 表3样品有关物质测定结果及比较 结果表明异喹啉物两种方法测定结果相差不大,总杂质 相差较大,异喹啉物测定用外标法测定,在230nm和310nm 对照品和样品同时测定,只要灵敏度符合要求均能测出.通 过专属性试验可知未知杂质在310nm波长处吸收很小,有的 检测不出.在230ntn波长处测定能较好的反应样品的有关物质. 3讨论 有关物质测定波长的选择应是主要杂质的最大吸收,而 不是主药的最大吸收,通过降解试验考察降解杂质有6个,每 个杂质的最大吸收不同,但各杂质及格列喹酮的最大吸收均 在215,230nm之间,并且比310nm大很多;同时考察了220 rim,测定杂质结果与230nm相当,但波长小,噪声增加,所以 确定测定波长为230nm. 参考文献: [1]陈震.有关物质的研究与申报[J].药品技术审评论坛,2010 45. (3):39— [2]谢沐风,罗霞萍,陈亚美.如何建立HPLC法测定有关物质的方 法[J].中国药品,2002,3(6):6—8. [3]牛海军,邵旭,查贝贝.RP—HPLC法测定牡荆素原料中的有 关物质[J].安徽医药,2011,15(1):34—5. 【4]李玮,陈柏林.氟罗沙星注射液中高分子杂质测定[J].安徽 医药,2011,15(1):38—9. [5]张射兵,刘实,卢洲,等.RP.HPLC法测定三氟柳原料的有 关物质fJ].安徽医药,2010,14(8):897—9. (收稿日期:2011—08一O1) 安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2012Jan;16(1)?31. 复方芦丁片含有芦丁和维生素C两种成分,主要用于治 疗脆性增加的毛细血管出血症,也用于高血压脑病,脑出血, 视网膜出血,出血性紫癜,急性出血性肾炎,再发性鼻出血,创 伤性肺出血,产后出血等的辅助治疗.原标准是卫生部药品 标准化学药品及制剂第一册,其维生素C含量测定是碘液滴 定法,大量实验数据表明…,用碘滴定法测定维生素C含量 波动较大,人为影响因素较多,如颜色的判断,操作速度的快 慢等;其芦丁含量测定采用的是uV法. 近年采用HPLC测定芦丁含量的报道较多”,然同时 测定复方芦丁片中芦丁和维生素C的含量未见报道,笔者采 用高效液相色谱同时测定复方芦丁片中维生素C和芦丁的 含量,此法简便,准确,现报道如下. 1仪器与试药 1.1仪器Waters2695高效液相色谱仪(美国Waters公 司),Waters2998PhotodiodeArrayDetecer二极管阵列检测器 (美国Waters公司),Empower色谱工作站(美国Waters公 司);SunfireC】8(5txm,4.6mmx150mm)色谱柱(美国Wa— ters公司);JK一120超声清洗器(上海金棋实业公司超声电子 工程部);BP211D电子天平(德国Sartorius公司). 1.2试药维生素C对照品(中国药品生物制品检定所,批 号:100425—200702,标示含量为100.0%);芦丁对照品(中国 药品生物制品检定所,批号:100080-200707,供HPLC法测 定);甲醇为色谱纯,余试剂为分析纯(国药集团化学试剂有 限公司);复方芦丁片(上海朝晖药业有限公司,批号090902; 江苏方强制药有限责任公司,批号20090424;江苏亚邦爱普 森药业有限公司,批号1003005). 2实验方法与结果 2.1色谱条件与系统适应性色谱柱:SunfireC(5txm, 4.6mmx150mm);流动相:甲醇_o.05mol?L磷酸二氢钾 缓冲液[磷酸调节pH=(3.0?0.1)](45:55);流速1.0ml? min,;柱温:30oC;进样量为20l,检测波长为254am和355 nm双波长测定;理论板数按维生素C峰计算不低于2500;按 芦丁峰计算不低于3500,维生素C与芦丁分离度大于15. 2.2对照品溶液的制备精密称取维生素C对照品12.12 mg置25m1量瓶中,加水10ml超声使其溶解并用水稀释至 刻度,摇匀,作为贮备液?;精密称取芦丁对照品12.93mg置 50ml量瓶中,加甲醇2Oml超声使溶解并用甲醇稀释至刻 度,摇匀,作为和贮备液?.精密量取贮备液?和贮备液?各 5ml置50ml量瓶中,用50%甲醇稀释至刻度,摇匀,作为混 合对照品溶液. 2.3供试品溶液的制备取复方芦丁片20片,精密称重,研 细,精密称取相当于1片的重量,置100ml量瓶中,加50%甲 醇60ml,超声使溶解,并用50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤 过,精密量取续滤液5ml置50ml量瓶中,并用50%甲醇稀 释至刻度,摇匀,用0.45m微孔滤膜滤过,取续滤液作为供 试品溶液. 2.4线性关系考察精密量取对照品贮备液?和贮备液? 各1,2,3ml,分别置25m1量瓶中,用50%甲醇稀释至刻度, 摇匀;再精密量取对照品贮备液?和贮备液?各3ml置10 ml量瓶中,用50%甲醇稀释至刻度,摇匀;再精密量取对照品 贮备液?和贮备液?各3ml,混匀.维生素C浓度分别为: 19.392,38.784,58.176,145.440和242.400mg?L,:芦丁浓 AU 0.40 0.30 0.20 O.10 O.O0 0.002.004.O06.00/rain A对照品(254nm) AU 0.060 0.040 0.020 0.000 B对照品(355nm) 0.002.004.O06.00/rain C供试品(254nm) AU 0.040 0.030 0.020 0.O1O 0.000 0.002.O04.O06.O0/min D供试品(355nm) AU 0.060 0.040 0.020 0.000 E空白 图1双波长法测定复方芦丁片含量的HPLC色谱图 度分别为:9.3613,18.7226,28.0840,70.2099和117.0165 mg?L,.按”2.1”项下色谱条件精密量取上述溶液各20 l,注入液相色谱仪,在254nm波长处记录维生素C色谱图, 在355nm波长处记录芦丁色谱图.维生素C峰面积分别为: 994426,2006917,3014770,7479992和12505558;芦丁峰 面积分别为:309198,614460,902562,2262303和3881 525.以浓度为横坐标(),各色谱峰面积为纵坐标(y),进行 线性回归,得回归方程.维生素C标准曲线方程为:Y=51 547X+2420.5,相关系数r=1.0000,线性范围为19.392, 242.400mg?L,;芦丁标准曲线方程为:Y=33097X一17 130,相关系数r=0.9996,线性范围为9.3613,117.0165 mg?L,. 2.5精密度试验取混合对照品溶液,在上述色谱条件下, 连续进样5次,以各组分峰面积分别计算,结果维生素C峰面 积分别为:2070405,2066239,2069153,2076801和2086 710,RSD为0.40%;芦丁峰面积分别为:753841,751785,753 808,756298和759580,RSD为0.40%.表明本方法精密度 ? 32?安徽医药AnhuiMedicalandPharmaceuticalJournal2012Jan;16(1) 良好. 2.6重复性试验取同一批号的样品5份,按供试品溶液制 备项制备及上述色谱条件测定,结果维生素c标示量含量分 别为99.25%,101.11%,100.73%,100.46%,100.73%平均 值为100.46%,RSD=0.71%(n=5);芦丁标示量含量分别 为98.84%,100.46%,101.55%,99.80%,100.96%平均含量 为的100.32%,RSD=1.05%(n=5),表明本法测定样品重 复性良好. 测定,记录峰面积,维生素C峰面积分别为:2070450,2056 822,2045890,2017659和1996745;芦丁峰面积分别为: 753841,753546,756790,746981和745932.其峰面积RSD 分别为1.47%和0.63%,结果表明供试品溶液在10h内稳 定. 2.8加样回收率试验精密称取已知含量的样品(批号: 090902)5份,分别精密加入同一对照品溶液,按供试品溶液 的制备方法及上述色谱条件测定.计算回收率,结果见表1. 2.7稳定?I生试验取混合对照品溶液,分别于1…248,10h实验表明,本法准确性较好. 表1加样回收率试验(=5) 2.9样品含量测定取3批样品分别按上述方法制备及色 谱条件测定,以标准曲线方程计算含量,其中芦丁的含量以峰 面积计算的无水芦丁的含量与1.089相乘所得的结果,并与现 行标准测的维生素C含量和芦丁含量进行比较,结果见表2. 表2复方芦丁片含量测定结果(标示量的百分含量%) 3讨论 3.1流动相的选择参阅相关资料J,试验中选择甲醇一 0.1%冰醋酸(10:90)为流动相,结果维生素C峰前面有一个 小峰,分离度达到要求,但提取PDA光谱图该峰与维生素C 光谱图一致;选择甲醇一水(50:50)的0.0025mol?L樟脑磺 酸溶液为流动相,结果维生素C峰与芦丁峰中间有一个倒置 峰,影响维生素C峰的积分以及和芦丁峰的分离度;选择甲 醇.05mol?L磷酸二氢钾缓冲液并调节比例为(45:55) 维生素C和芦丁分离效果好,保留时间,对称因子,塔板数均 符合要求. 3.2检测波长的选择采用PDA检测器,采集210—400nm 3D图谱,提取维生素C色谱峰处的光谱图,表明其在245am 波长处有最大吸收,提取芦丁色谱峰处的光谱图,表明其在 255nm和355am波长处有最大吸收.参阅相关资料J,维 生素C的测定多选择254am波长作为检测波长,但试验发现 此波长处维生素C和芦丁的响应值相差较大,在同一色谱图 中无法同时很好地显示维生素C和芦丁峰形,而在355nm波 长处维生素C基本无吸收,故在254nm和355am波长处双 波长同时测定,记录峰面积,比较峰面积大小,确定254nm为 维生素C检测波长,355nm为芦丁检测波长. 3.3溶剂的选择芦丁水溶性较差,可溶于甲醇,乙醇,原标 准采用60%乙醇作为溶剂,维生素C在水中易溶,在乙醇 中略溶,结合流动相综合考虑,在配置对照品贮备液时分别用 甲醇和水作为芦丁和维生素c的溶剂,在配置混合对照品时 采用50%甲醇作为溶剂,样品采用50%甲醇提取并超声10 min即可将芦丁与维生素C溶解. 参考文献: [1]陈再洁,郑建明,王智.高效液相色谱法测定维生素c片中 Vc含量[J].分析仪器,2008,l(6):37—9. 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