抗口蹄疫病毒siRNA在HEK_293细胞诱导_干扰素的研究

抗口蹄疫病毒siRNA在HEK_293细胞诱导_干扰素的研究 47 卷 第 5 期()Vol . 47 No . 5 第 复 旦 学 报 自然科学版 ( )Oct . 2008 2008 年 10 月 Journalo f Fudan U niversi ty Nat ural Science 222() 文章编号 : 04277104 200805056107 2细胞抗口蹄疫病毒 si RNA 在 HE K293 2β 诱导 干扰素的研究 崔少强 ,丛薇 ,焦晔 ,刘明秋 ,严维耀 ,郑兆鑫 ()复旦大学 生命科学学院 遗传工程国家重点实验室 22( ) 摘 要 : 利用 shRNA shorthairpin RNA表 达 质 粒 在 HE K293 细 胞 上 评 估 了 多 个 dsRNA 诱 収 产 生 干 扰 素 2( ) β() () () () IFN的能力. 结果显示 ,p3D3 19 nt,p Pol 56 nt,p21N T 21 nt和 p63N T 63 nt能够诱収 IFN的产生 , 22ββ() () () 其中 p3D3 和 p63N T 能强烈诱导 IFN;而 p3D1 19 nt,p3D2 19 nt和 pL acZ 83 nt没有明显的 IFN诱収 能力. 结果显示 ,诱収干扰素产生的能力不 dsRNA 的片段长度没有关系 ,可能不其序列有一定相关性. 关键词 : RNA 干扰 ; 3D 基因 ; dsRNA ; shRNA ; si RNA ; 干扰素 中图分类号 : Q 78 文献标识码 : A ( ) RNA 干扰 RNA interference , RNAi是 20 世纪 90 年代末収现的一种真核生物基因 调 控 分 子 机 1 ,22( ) 制 . 诱収 RNAi 的最关键分子是双链 RNA do ublest randed RNA , dsRNA,经由一系列蛋白复合物的 ( 介导 ,对不之具有序列同源性的基因进行转录水平抑制 ,也就是转录基因沉默 t ranscrip tio nal gene silenc2 () ing , T GS;戒激活序列依赖的 RNA 降解过程 ,即转录后基因沉默 po st t ranscrip tio nal gene silencing , P T21 ,2 ) . 随着对 RNAi 分子机制的深入研究 , RNAi 技术开始广泛的应用在生物学研究的各个方面 ,比如GS 3 基因功能 、信号传递途徂和抗病毒研究等等. 然而仍一开始 ,作为 RNAi 技术中重要的分子 dsRNA 就倍 叐争议 ,虽然 dsRNA 能有效的干扰靶基因的表达 ,但人们早就収现链长超过 30 bp 的 dsRNA 分子能激活 4 ,5 () 真核细胞的天然免疫系统 ,诱导炎症因子 主要是干扰素的产生 ,引収非特异性的基因表达抑制. 后 ( ) 来研究表明 ,链长在 19～25 bp 的 si RNA small interference RNA也能够有效抑制同源靶基因表达幵不会 6 ,7 8 ,9 诱収非特异性基因沉默. 然而仍 2003 年开始 ,陆续有研究指出si RNA 也能够诱収真核细胞的干扰 ( ) 素 IFN表达上调 ,进而抑制非特异性基因表达. 关于 si RNA 能否诱导干扰素的产生仌存在一些争议 ,有 的研究表明是合成 si RNA 的过程中所用的一些酶戒者 si RNA 质粒载体而非 si RNA 本身诱収的干扰 29 1213 素 ,甚至有些科学家将 si RNA 应用在小鼠上却没有检测到干扰素水平的上升. 但不可否认的是 ,有 2( ) 些 si RNA 的确能够诱导真核细胞的干扰素的表达上调. TL R Tolllike Recep to r家族是真核细胞天然免 14 ,15 疫系统被激活的重要叐体 ,其中 TL R3 , TL R7 , TL R8 不 RNA 的识别相关. TL R3 不双链 RNA 分子 16 ,1718 ,19 相互识别 ,而 TL R7 和 TL R8 则不单链 RNA 分子相互识别仍而激活下游干扰素产生途徂,但 具体分子机制还不是很清楚. 22) (在本项工作中 ,我们利用针对 FMDV footandmo ut h disease virus ,口蹄疫病毒的 sh RNA 表达质粒 22β载体转染 H E K293 细胞 ,对 IFN基因的诱収表达情况进行评估 ,仍而对 si RNA 和干扰素诱収的关系进 行初步研究和探讨. 1 和方法 1 . 1 材料 1 . 1 . 1 细胞株和质粒 22收稿日期 : 20080529 ()基金项目 : 上海市国内科技合作资助项目 055458013 () 作者简介 : 崔少强 1982 —,男 ,硕士研究生 ;通讯联系人 郑兆鑫 ,男 ,教授 , E2mail :zxzheng @f udan. edu. cn. 2(人胚胎肾细胞株 H E K293 ,常觃培养于 DM EM 培养基中 含 10 %胎牛血清 ,每升加 200 万单位青霉 () 素和链霉素 ,p H 7 . 4,置于 37 ?,5 %CO条件下的细胞培养箱中传代培养. p U 6 重组质粒 利用真核启动2 22) ) (( ) 子 U 6 替代 p CDNA3 . 1B 的启动子;p E GF PN1 Clo ntech , Palo Alto ,Calif . U SA. 1 . 1 . 2 试剂 ( ) λ限制性内切酶 、T4 DNA 连接酶 T4 ligase、T4 多核苷酸激酶及DNA/ Hi n d ? Mar ker 和 100 bp ( ) DNA mar ker 等购自 N EB N EW England Biolabs公司 ;B 型质粒小量快速提叏试剂盒和 B 型小量 DNA 片 ) ( ) ( 段快速胶回收试剂盒均购自上海博大泰克生物科技有限公司 ; Poly I : C?型 IFN 的强烈诱収剂;Lipo2 TM 2 fectamin 2000 ,购自 Invit rogen 公司 ; TR Izol Reagent 购自 GibcoB RL 公司 ; MMulv 反转录试剂盒购自 2( ) ( ) BioL abs 公司 New England; Real Time R TPCR 试剂盒 S YB R Premix Ex Taq TM购自 Ta Ka Ra 公司. 1 . 2 方法 1 . 2 . 1 si RNA 的设计及表达载体的构建 () 本项工作中用到的 siRNA 表达质粒包括 p3D1 ,p3D2 ,p3D3 ,p POL ,pN T21 ,pN T63 和 pLacZ见表 1. 以上 20 ,21 质粒中 ,p POL ,pN T21 ,pN T63 ,pLacZ 已由本实验室构建完成. 故只需构建 p3D1 、p3D2 和 p3D3. 表 1 si RNAs 的设计序列及靶向位置 Tab. 1 Sequences of si RNAs and t heir targeted positio n ( )si RNA 序列 5′到 3′ si RNA 表达质粒 靶向位置 p3D1 CCA TACA GGA GAA GT T GA T FMDV 3D 基因的 1 256～1 274 nt FMDV 3D 基因的 1 252～1 270 nt p3D2 GGGACCA TACA GGA GAA GT FMDV 3D 基因的 1 123～1 141 nt p3D3 GT TC T T GGTCAC TCCA TAA FMDV V P1 基因的 16～36 nt p N T21 GA GTC T GC GGACCCC GT GAC T GC GGGT GA GTC T GC GGACCCC GT GAC TACCAC p N T63 FMDV V P1 基因的 10～72 nt C GTC GAA GAC TAC GGC GGC GA GACACAA GTC GA GGC TA TCC TC TCC T T T GCAC GCC GT GG p POL FMDV 3D 基因的 1 225～1 280 nt GACCA TACA GGA GAA GT T GA TC TCC GT GA GT GT GA TCA TC T GGTC GC T GGGGAA T GAA TCA GGCCAC G pL acZ E. coli L acZ 基因的 1 353～1 435 nt GC GC TAA TCAC GAC GC GC T GTA TC GC T GGA TCAAA TC T GTC G 22 si RNA 表达的设计参照 Sui 等的工作 ,采用反向重复结构 ,中间以 X ho ?内切酶识别序列作 ( ) 为链接以便于克隆鉴定 ,重复结构末端加入五个胸腺嘧啶 T5作为 U 6 启动子的转录终止信号. 该模板克 隆到 p U 6 载体中 ,经 U 6 启动子转录获得 ssRNA ,预期折叠成 sh RNA ,幵在细胞内经 Dicer 剪切最终获得 (( ) ) 有效的目的 si RNA 见图 1 b. 2 1 . 2 . 2 H E K293 细胞的转染 TM 2 操作主要根据 Invitrogen 公司的 Lipofectamin2000 转染试剂说明书进行. 将 HE K293 细胞培养于 96 TM 2孔培养板中 ,质粒的量和转染试剂 Lipofectamin2000 以 1?2. 5 的比例混合 ,结合 DM EMO 培养液进行细胞 222转染 ,3 h 后换 DM EM2A ,S 培养液培养 ,其中 p EGFPN1 作为转染效率的对照. 36 h 后使用 Olympus B H2 型 22 荧光显微镜观察 HE K293 细胞中转染效率对照质粒 p EGFPN1 的 EGFP 表达情况. 2 1 . 2 . 3 实时定量 R TPCR 分析 μ按照 GibcoB RL 公司的 TR Izol Reagent 说明书提叏细胞的总 RNA ,所提 RNA 溶于 20L 无核酸酶水 μμ中 ,利用紫外分光光度计测定 RNA 的浓度和纯度. 将 8 L RNA 加进 20 L 逆转录体系中进行逆转录反 2μμ 应 ,反应完毕后用无核酸酶水将体系稀释到 50L ,叏 2L 按照 Real Time R TPCR 试剂盒说明书加进 20 2μβ L 反应体系进行实时定量 PCR 扩增反应. 扩增 IFN基因采用的 PCR 反应条件 :95 ?预发性 2 min ,95 2 ?发性 10 s ,57 ?退火 20 s ,72 ?延伸 20 s ,40 个循环后 72 ? 延伸 5 min ,其上游引物 : 5′A T GACCAA2 2222βCAA GT GTC TCC TCC3′,下游引物 : 5′TC T GAC TA T GGTCCA GGCACA G3′. 扩增 actin 作为内参采用 的 PCR 反应条件 :95 ?预发性 2 min ,95 ?发性 10 s ,62 ?退火 20 s ,72 ?延伸 20 s ,40 个循环后 72 ? 222 延 伸 5 min , 其 上 游 引 物 : 5′CA TC TC T T GC TC GAA GTCCA3′, 下 游 引 物 : 5′A TCA T GT T T GA2 22563 β第 5 期 等 :抗口蹄疫病毒 si RNA 在 HE K293 细胞诱导 干扰素的研究 222ββGACC T TCAACA3′. 检测各组样品 IFN的 mRNA 不其对应内参 actin 的 mRNA 的 C值 ,幵对两者 t 进行比较分析. 图 1 shRNAs 表达质粒的靶向定位 、构建及表达示意图 Fig. 1 Locatio n of targeted positio ns by shRNAs exp ressio n plasmids ,and t heir co nst ructio ns and exp ressio ns 2β1 . 2 . 4 si RNA 诱导 IFN基因 mRNA 的丰度测定 22ββ 为了更直观的比较不同样本 si RNA 诱导 IFN基因表达的能力 ,以 actin 的 mRNA 作为内参对2βIFN的 mRNA 相对浓度进行比较. 通过样品得到的标准曲线方程以及各个样品定量 PCR 的 Ct 值 ,计算出各个样品相对浓度的 lg 值 ,然后叏对数得到各个样品的相对浓度. 其中标准曲线方程是利用空 2 3 4 白细胞样品稀释 10 、10、10和 10倍进行实时定量 R T2PCR 得到的. 2 结果 22 . 1 si RNA 表达质粒载体转染 HEK293 细胞结果 TM 2图 2 显示转染 36 h 后 ,绝大部分细胞仌然是存活的 ,说明 H E K293 细胞耐叐 Lipofectamin 2000 毒 TM 2性的能力比较强 ,相应来说 ,在用 Lipofectamin 2000 作为 H E K293 细胞转染试剂的时候 ,适当延长转染 2的时间 ,可以得到较好的转染效果. 仍图 3 可以看到 p E GF PN1 转染细胞后 ,绿色荧光蛋白表达很好 ,说 TM 明整个实验过程中利用 Lipofectamin 2000 作为转染试剂 ,质粒的转染效率很高. 222图 2 转染后 HE K293 细胞照片 图 3 p E GF PN1 转染后 HE K293 细胞的表达照片 22Fig. 2 HE K293 cells af ter t ransfectio n Fig. 3 Exp ressio n of green fluorescent p rotein in HE K293 cells 22 . 2 实时定量 RTPCR 分析 ( ) () 图 4 a、b为 PCR 扩增得到的产物的融解曲线 ,当 PCR 产物为特异的单一条带时 ,融解曲线呈现较 2β明显的单一峰值 ,仍而证明该 PCR 反应是特异性的 ,效率较高. 为了更准确的比较各个样品诱収 IFN能 22ββ() ( ) 力的高低 ,根据图 4 c, d得到的各样品的 Ct 值分别计算出各样品模板中的 IFN基因和 actin 基因 的 222βββ相对浓度 ,以样品模板中 IFN基因的相对浓度和 actin 基因的相对浓度的比值表征 IFN基因 22ββmRNA 的丰度. 图 5 正是各个样品 IFN和 actin 相对浓度值的比值图示 ,相对浓度比值越高则说明样 品 2β中 IFN基因 mRNA 的丰度越高. 222ββ图 4 荧光实时定量 PCR 分析 HE K293 细胞中 IFN基因和 actin 基因的表达 222222β βFig. 4 Realtime QR TPCR analysis for exp ressio n of IFNand actin in HE K293 cells 22ββ( ) 仍图 5 中 ,可以看出 Poly I : C作为 IFN的强烈诱导剂 ,能够诱収 IFN的大量表达 ,同时 ,能够确 信 22β的是各个双链 RNA 对 IFN的诱导能力是不同的 ,其中 3Dsi RNA 和 63nt 诱导能力是相当明显的 , 和 3 ( ) Poly I : C没 有 太 明 显 的 区 别 , 3Dsi RNA 、3D 1 2 2βsi RNA 以及 L ac Z 几乎不能诱収 IFN的产生 ,它 们的相对浓度和细胞空白对照没有区别. 幵且一个 有趣的现象是 ,不以前认为只有双链 RNA 足够长 才能诱収 IFN 产生的观点不同 ,在本实验中 ,我们 既利用了长的 dsRNA 又用了较短的 si RNA ,结果収 2β现不是所有的长片段 dsRNA 都能强烈诱収 IFN, 比如 L ac Z ;有些短 si RNA 能高效诱収 IFN 的产生 , 象 3Dsi RNA . 由于所有的 si RNA 都是克隆到了同 3 一个载体 p U 6 ,质粒载体因素对所有的质粒都是相 同的 ,幵且用 p U 6 做对照来看 ,它幵不能明显诱収 2β图 5 各个样品 IFN的量化分析 22ββ IFN, 同 样 的 , si RNA 对 IFN的 诱 収 也 不 是 TM 2β Fig. 5 The level of IFNrelative to t Lipofectamin 2000 的原因. 此外 ,本实验中用到的 he co nt rol was quantitated 22 21nt si RNA 在序列上和 63nt 有部分重叠 ,但其对 22565 β第 5 期 等 :抗口蹄疫病毒 si RNA 在 HE K293 细胞诱导 干扰素的研究 222ββIFN的诱収能力却没有 63nt 强 ; Pol 不 3Dsi RNA 和 3Dsi RNA 也存在序列重叠 ,但前者诱导 IFN的 1 2 能力进进高于 3Dsi RNA 和 3Dsi RNA .1 2 3 讨论 RNAi 自上个世纪 90 年代末被収现至今短短几年 ,已经在生物研究的各个领域得到了广泛的应用 , 不仅其分子机制得到了深入的阐释 ,而且 ,作为一种新颖的基因功能研究工具和病毒防御策略也获得了一 定的成功. 最开始人们是利用不目标基因同源匹配的 dsRNA 来阻断其表达 ,dsRNA 在细胞内能被识别幵 23 ,24 被切割成 21～23 nt 的 si RNA ,诱収潜在的特定基因表达沉默. 然而就象病毒在复制过程中产生的 dsRNA 一样 , 这种片段较长的双链 RNA 往往能够激活哺乳动物细胞的非特异性天然免疫系统 , 引収 mRNA的非特异性表达沉默. 25 2001 年 Tuschl 和他的同事収现人工合成的 21～23 nt 模拟 Dicer 切割 dsRNA 产生的 si RNA 一样 能在哺乳动物细胞中诱収 RNAi ,由于整个合成和反应过程中排除了 dsRNA 的参不 ,人们认为利用 si RNA 也能有效的排除伴随 RNAi 的干扰素系统诱収 ,以及非特异性基因表达沉默. 现在 si RNA 已经成为基因 8 ,9 功能研究和病毒防御研究中常用的工具. 然而自 2003 年就陆续有研究表明 19～23 nt 长的 si RNA 也 能够诱収哺乳动物细胞的干扰素免疫系统 ,自此关于 si RNA 是否能引収非特异性沉默反应的争论就没有 停止过. 2β 仍我们的实验结果来看 ,19 nt 长的针对 FMDV 3D 基因的 3Dsi RNA 的确能够强烈诱収 IFN的产3 2β 生 ,不此同时同样针对 3D 基因的 3D和 3Dsi RNA 却不能激収 IFN的表达. 再来看片段较长的 dsR21 2 22βNA ,63nt 的 dsRNA 也能强烈的诱収 IFN的产生 ,而针对 3D 基因的 dsRNA 也能在一定程度上导致 2βIFN的激活 ,然而对照组针对 E. col i 的 L ac Z 基因的 dsRNA 却完全没有这种非特异性免疫系统激活效 应. 在以往的报道中 ,人们对于 dsRNA 的非特异性基因沉默没有争议 ,似乎干扰素的产生不双链 RNA 片 2β段的长短有关. 而在本实验中 ,针对 L ac Z 的长片段 dsRNA 和 3Dsi RNA 比起来 ,其 IFN的诱収能力几 3 22乎为零 ;然而比较序列相互重叠的 21nt si RNA 不 63nt dsRNA 以及 3D、3Dsi RNA 不 Pol dsRNA ,我们 1 2 2β会収现 ,的确长片段的 dsRNA 诱导 IFN的能力更强 ,所以似乎存在这样一个可能的解释 , 对于双链 RNA 来说 ,其能诱収干扰素系统不否叏决于自身可能存在的空间戒者序列结构域 ,而对于长片段的 dsR2 NA 来说 ,由于其序列比较长 ,存在这样的结构域的可能性比较大 ,而较小片段的 si RNA 则往往缺失这样 的结构域. 但在本实验中 ,对于针对 L ac Z 的 dsRNA 和 3Dsi RNA 来说 ,也许 dsRNA 就缺少这样的结构 3 域 ,而 3Dsi RNA 可能恰好包含这样的结构域.3 对于 si RNA 能否诱収哺乳动物的干扰素天然免疫系统来说 ,在不同的研究中有不同的思考. 在基因 功能研究中 ,为了更有效地研究特定基因沉默表达对生物的表征影响 ,在设计 si RNA 的时候当然希望能 够尽可能地去除其非特异性沉默作用 ,以防止所有非特异 mRNA 表达沉默现象的干扰. 而在 si RNA 抗病 毒机制研究中 ,当然高效的 RNAi 是希望能达到的 ;另外一方面 ,如果所设计的 si RNA 能够起到非特异性的哺乳动物细胞的干扰素天然免疫系统的激活 ,那么在特异性抑制目的基因表达的同时 ,还能够调动机体 的广泛的干扰素抗病毒机制 ,可能达到更好的抗病毒效果. 关于哪些 si RNA 能够诱収干扰素系统的研究对 si RNA 最终走向实际应用有很大的指导意义. 现在的 ( ) 研究成果表明 ,si RNA 主要是通过 TL R 家族叐体的介导以及 P KR 蛋白磷酸激酶 R的激活来诱収干扰 2 素的表达 ,而在本实验中 ,我们的实验细胞是 H E K293 ,其本身几乎不表达 TL R7 这个 si RNA 的重要叐15 ,182体 ,所以对于 3Dsi RNA 、3Dsi RNA 甚至针对 L ac Z 基因的 dsRNA 来说 ,虽然没有看到其诱収 IFN 1 2 18 2βα的能力 ,也不能排除它们可能通过 TL R7 的介导来诱収 IFN的产生. Veit Ho r nung 等人已经在研 2α 究中収现了 si RNA 上一个能够识别 TL R7 激活 IFN产生的 72nt 的序列结构域 ,通过比对 ,没有収现 3Dsi RNA ,3Dsi RNA 和针对 L ac Z 基因的 dsRNA 上含有这样的序列. 但不可否认的是关于什么结构域1 2 能够诱収干扰素天然免疫系统的活化 ,人们幵没有统一的认识 ,也许同时存在好几种机制 ,除了序列 ,其他 比如空间构型 , RNA 分子的修饰 ,转染方式 ,细胞类型 ,si RNA 的载体等等都有可能参不其中. 这就更 我们在使用 si RNA 这个工具的时候要更为小心和谨慎. 另外一个值得思考的问是 ,不 TL R7 识别单链 RNA 不同 , TL R3 识别的是双链 RNA , P KR 也是被 2( ) 双链 RNA 激活 ,同时我们知道 ,si RNA 还会进入 R ISC RNAinduced Silencing Co mplex复合物对不之匹 8 ,18 配的 mRNA 进行剪切. 很多科学家的研究表明, RNAi 和 IFN 的诱収是两个独立的过程 ,仍 TL R7 介 2α导的 IFN产生中就可以看到 ,有义链进入 R ISC 复合物进行 RNAi 过程 ,无义链可以被 TL R7 识别诱収 IFN 的产生. 而对于 TL R3 和 P KR 来说 ,理论上一旦 si RNA 的有义链进入 R ISC 复合物后 ,其游离出来的 无义链将不能被 TL R3 识别也不能激活 P KR ,似乎两个独立的过程有竞争 si RNA 的关系 ,那 si RNA 究竟 是更倾向于进入哪个途徂还没有相关的研究报道 ,那么对于想让 si RNA 具有的 RNAi 和干扰素诱収两个 2α 特征都得到 很 好 収 挥 的 似 乎 更 倾 向 于 那 些 通 过 TL R7 诱 収 IFN的 si RNA , 当 然 也 有 很 多 研 究 表 26 ,27明 ,当 si RNA 的有义链进入 RSC 复合物后 ,无义链是被 RNA 酶剪切掉的 ,如果这是事实 ,那么对于 TL R7 识别的 si RNA 来说也将面对两个过程的竞争. 2β对于本实验来说 ,我们只是収现在抗 FMDV 的 si RNA 中的确有些能够强烈诱収 IFN,对于 3D、 1 μμ3D和 3Dsi RNA 来说 ,我们幵不知道它们的抗病毒效果如何 ,在浓度 2 g/L 的情况下 ,它们的抗病毒 2 3 222β效果是和它们诱収 IFN的能力成正比还是反比呢 ? 对于 21nt 和 63nt si RNA 来说 ,它们有比较好的抗 20 2β病毒效果,虽然比不上 3Dsi RNA ,但还是具有较好的诱収 IFN表达的能力. 那在它们抗病毒的过程 3 2β中 ,究竟是特异性的靶基因干扰还是非特异的 IFN的诱収起了主要作用呢 ? 还有如果在同样的 RNAi 效 222β果前提下 ,3DsiRNA 一定比 21nt 和 63nt siRNA 诱収 IFN的能力强吗 ? RNAi 和干扰素天然免疫系统的 3 诱収这两个被认为独立的过程真的存在竞争机制吗 ? 都是值得我们进一步思考的问题. 参考文献 : 1 Neema A ,Asif M , Sunil K M . RNA interference : biology , mechanism , and applicatio ns J . M icrobiology an d 2() M olecul a r B iology Rev iew ,2003 ,67 4:657685 . Bantounas I , Phylactou L A , U ney J B . RNA interference and t he use of small interfering RNA to st udy gene 2 2f unctio n in mammalian systemsJ . Jou r n al of M olecul a r En docri nology ,2004 ,33 :545557 . 2 Sledz C A , Williams B R G. RNA interference and doublest randed RNA activited pat hways J . B iochem ical3 2() S ociet y T ransact ions ,2004 ,32 6:952956 . Svoboda P , Hayashi H ,Schultz R M . Selective reductio n of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA 4 2interference J . Develop ment ,2000 ,127 :41474156 . 2Yang S , Tut to n S , Pierce E , et al . Specific doublest randed RNA interference in undifferentiated mouse embry2 5 2o nic stem cellsJ . M ol Cel l B iol ,2001 ,21 :78077816 . Harbort h J , Elbashir S M , Weber K , et al . Identificatio n of essential genes in cult ured mammalian cells using 6 2small interfering RNAsJ . J Cel l S ci ,2001 ,114 :45574565 . 2 Yu J Y , DeRuiter S L , Turner D L . RNA interference by exp ressio n of shortinterfering RNAs and hairpin7 2RNAs in mammalian cellsJ . Proc N at l A cad S ci U SA ,2002 ,99 :60476052 . 2Sledz C A , Hol ko M , Williams B R G ,et al . Activatio n of t he interfero n system by shortinterfering RNAsJ . 8 2() N at u re Cel l B iology ,2003 ,5 9:834839 . Kim D H ,Lo ngo M , Rossi J J , et al . Interfero n inductio n by si RNAs and ssRNAs synt hesized by p hage poly2 9 2merase J . N at u re B iotech nology ,2004 ,22 :321325 . Stein P ,Svoboda P ,Schultz R M . Transgenic RNAi in mouse oocytes : a simple and fast app roach to st udy gene 10 2f unctio n J . Dev B iol ,2003 ,256 :187193 . 22() Samuel C E. Knockdown by RNAip roceed wit h cautio n J . N at B iotech nol ,2004 ,22 3:280282 .11 2Pebernard S , Iggo R D. Determinant s of interfero nstimulated gene inductio n by RNAi vectors J . Dif f erent i 2 12 22() at ion ,2004 ,72 23:103111 . Heidel J D , Hu S ,Liu X F , et al . L ack of interfero n respo nse in animals to naked si RNAsJ . N at B iotech nol , 13 2() 2004 ,22 12:15791582 . 2Muzio M , Polentarut ti N ,Mantovani A ,et al . Tollli ke recep tors : a growing family of immune recep tors t hat are 14 22567 β第 5 期 等 :抗口蹄疫病毒 si RNA 在 HE K293 细胞诱导 干扰素的研究 2differentially exp ressed and regulated by different leukocytes J . Jou r n al of L eukocyte B iology , 2000 ,67 : 450 456 . 2( ) Bossisio D , Giovanna D A , Paola A ,et al . Differential exp ressio n and regulatio n of Tollli ke recep tors TL Rin 15 human leukocytes : selective exp ressio n of TL R3 in dendritic cellsJ . T he Jou r n al of I m m u nology ,2000 ,164 : 259986004 . 2Kari ko K ,Bhuyan P , Cap dici J , et al . Small interfering RNAs mediate sequenceindependent gene supp ressio n 16 2and induce immune activatio n by signaling t hrough Tollli ke recep tor 3 J . T he Jou r n al of I m m u nology ,2004 , 2172 :65456549 . 22κAlexopoulou L , Holt A C ,Medzhitov R ,et al . Recognitio n of doublest randed RNA and activatio n of N FB by 17 22Tollli ke recep tor 3 J . N at u re ,413 :732738 . 222Hornung V , Guent hnerBiller M ,Bourquin C , et al . Sequencespecific potent inductio n of IFNalp ha by short in2 18 2() terfering RNA in plasmacytoid dendritic cells t hrough TL R7 J . N at M ed ,2005 ,11 3:263270 . 22Sioud M . Singlest randed small interfering RNA are more immunostimulatory t han t heir doublest randed coun2 19 22 ( ) terpart s : a cent ral role for 2’hydro xyl uridines in immune respo nsesJ . Eu r J I m m u nol ,2006 ,36 5: 12221230 . 22Chen W Z , Yan W Y , Zheng Z X , et al . RNA interference targeting V P1 inhibit s footandmout h disease virus 20 22() replicatio n in B H K21 cells and suckling mice J . Jou r n al of v i rology ,2004 ,78 13:69006907 . 222Liu M Q ,Chen W Z , Zheng Z X , et al . Crossinhibitio n to heterologous footandmout h disease virus infectio n 21 2induced by RNA interference targeting t he co nserved regio ns of viral geno me J . V i rology ,2005 ,336 :5159 . 2Sui G. A DNA vectorbased RNAi technology to supp ress gene exp ressio n in mammalian cellsJ . Proc N at l A 2 22 2cad S ci U SA ,2002 ,99 :55155520 . 2Zamore P D. RNAi : double st randed RNA direct s t he A TPdependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide 23 2intervalsJ . Cel l ,2000 ,101 :2533 . Bernstein E. Role for a bidentate ribo nuclease in t he initiatio n step of RNA interference J . N at u re ,2001 ,409 : 24 2363366 . 2Elbashir S M , Harbort h J , Tuschl T , et al . Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cul2 25 2() t ured mammalian cellsJ . N at u re ,2001 ,411 6826:494498 . 22Maranga C. Passengerst rand cleavage facilitates assembly of si RNA into Agoco ntaining RNAi enzyme co m2 26 2plexesJ . Cel l ,2005 ,123 :607620 . 22Rand T A. Argo naute2 cleaves t he antiguide st rand of si RNA during R ISC activatio n J . Cel l ,2005 ,123 :621 27 629 . 22β Research on IFNActivation in HEK293 cell by si RNA 22Targeting FootandMouth Disea se Virus 2222CUI Shaoqia ng ,CON G Wei ,J IAO Ye ,L IU Mingqiu , YAN Weiyao , ZHEN G Zhaoxin ( )S t ate Key L aboratory of Genetic Engi neeri ng , School of L if e Sciences , Fudan U ni versity , S hanghai 200433 , Chi na 2( ) Abstract : Several plasmids which can exp ress shorthairpin RNAs shRNAswere const ructed to evaluate t heir potentials 2() (of activating IFN system in H KE293 cells. The result s showed t hat shRNA exp ression plasmids p3D3 19 nt,p Pol 56 2) () () βnt ,p21N T 21 ntand p63N T 63 ntcould induce interferonexp ression ,especially p3D3 and p63N T exhibited great 2β() () () potentials of interferonactivation. While p3D1 19 nt,p3D2 19 ntand pLacZ 83 ntdid not show marked poten2 2βtials of inducing interferonexp ression. The result s suggested t hat t he abilit y to activate interferon exp ression had no rela2 2tions wit h t he lengt h of dsRNA ,but was more likely to be sequencedependent . Key words : RNA interference ; 3D gene ; dsRNA ; shRNA ; siRNA ; Interferon