三种感染标记物在早期诊断极低出生体重儿细菌感染中的价值（可编辑）

三种感染标记物在早期诊断极低出生体重儿细菌感染中的价值（可编辑） 三种感染标记物在早期诊断极低出生体重儿细菌感染 中的价值 温州医学院 硕士学位论文 三种感染标记物在早期诊断极低出生体重儿细菌感染中的价值 姓名:黄玉梅 申请学位级别:硕士 专业:儿科学 指导教师:林振浪 2012-11温州医学院硕士学位论文 三种感染标记物在早期诊断 极低出生体重儿细菌感染中的价值 中文摘要 目的:,的发病率 细菌感染在极低出生体重儿 相对较高,且由于极低出生体重儿生理病理的特殊性,细菌感染多起病隐匿, 症 状缺乏特异性,目前的实验室检查不能提供敏感、特异的早期诊断依据,临床 早 期诊断困难。为了减少严重感染的发生,临床上往往经验性应用广谱抗生素, 结 果导致耐药菌株生成和条件致病茵感染。因此寻找可靠的早期细菌感染标记物, 对于早期诊断和及时正确的治疗至关重要。本文使用前瞻性研究方法,对比分析 种不同感染标记物反应蛋白、血清淀粉样蛋白、中性粒细胞表 面抗原对早期诊断极低出生体重儿细菌感染的作用。 方法: 选择温州医学院附属育英儿童医院新生儿重症监护病房年月一 年月例出生体重疑似细菌感染的极低出生体重儿为研究对象。在 疑为细菌感染的 和 分别取血,有使用抗生素者于取标本后使用。入 选感染组患儿均做血培养,其他部位有感染灶者送局部分泌物培养。取同时期 住院的相应纠正胎龄士周和日龄天的例无并发感染性疾病的极 低出生体重儿作为对照组,在相应的时间点和送检次血标本感染 标记物。采用免疫比浊法测定血。酶联免疫吸附试验检测血清表达。 用流式细胞仪检测全血中性粒细胞表面抗原水平。统计学处理应用 检验。采用受试 .软件进行分析。组间差异比较采用? ,曲线分析各指标预测败血症 者工作特性 的敏感性和特异性。 结果: .共入选例临床疑似败血症,最终诊断败血症例。败血症 组在感染和,分别为. /、 /、./,分别为. ./,中性粒细胞表面抗原水平分别为荧光抗体分子/细胞、 荧光抗体分子/细胞;对照组在和,分别为. /、./, 分别为. /、./,中性粒细胞表面抗原水平分别为 荧光抗体分子/细胞、荧光抗体分子/细胞。在不同时间点败血症组、 、中性粒细胞表面抗原水平均显著高于对照组,差异均有统计学意温州医学 院硕士学位论文 义.。 .中性粒细胞表面抗原预测败血症的最佳临界值为个荧光抗 体分子/细胞,在疑为细菌感染的和时间点其诊断败血症的敏感性分别 为.%和.%,特异性分别为.%和.%;预测败血症的最佳临界 值为./,在疑为细菌感染的和时间点其诊断败血症的敏感性分别 为.%和.%,特异性分别为.%和.%:预测败血症的最佳临界 值为./,在疑为细菌感染的和时间点其诊断败血症的敏感性分别 为.%和.%,特异性分别为.%和.%。 .若血、和中性粒细胞表面抗原三种指标联合检测,其敏 感性和特异性均显著提高,在疑为细菌感染的分别达.%和%,在分 别达.%和%。 .革兰阳性细菌感染在和,分别为./和./, 分别为./和./,水平分别为荧光抗体分子/细胞和 荧光抗体分子/细胞;革兰阴性细菌感染在和,分别为./ 和./,分别为./和./,水平分别为荧 光抗体分子/细胞和荧光抗体分子/细胞。两组相比较,三种感染标记物表 达水平差异均无统计学意义户均.。 结论: 用于极低出生体重儿早期诊断细菌感染敏感性较低,特异性不及 ;血清淀粉样蛋白用于早期诊断细菌感染敏感性高,但特异性低;中性 粒细胞表面抗原是早期诊断极低出生体重儿细菌感染的灵敏指标。三种 感染标记物联合检测和动态检查有利于提高诊断的准确性。血、和中 性粒细胞表面抗原在革兰阳性菌感染和革兰阴性菌感染时,其表达水平 差异无统计学意义。 关键词: 极低出生体重儿、新生儿;细菌感染;反应蛋白;血清淀粉样蛋白; 中性粒细胞表面抗原温州医学院硕士学位论文 : ., . , . ?. ., , , , . : ’ . . ., ., , ., . . . . . ..? .. : . , . 温州医学院硕士学位论文.,./; .,./; / ,..,./; , , .,./;/ . ,.. . .% .% /, ,.%.% . .%.% ./, , .% ..%.% ./, , .%.% . . .% % % ;.% . ...,./; .,./; / , . , .,./; .,./。; , /. , , .... :. , . .., , . 温州医学院硕士学位论文 :; ; ,; : 温州医学院硕士学位论文 英文缩略词中英文对照表按字母顺序排列 缩略符号 英文名称 中文名称中性粒细胞表面抗原反应蛋白 酶联免疫法 流式细胞术 前向角散射光粒细胞集落刺激因子 . . 白细胞介素一 新生儿呼吸窘迫综合征新生儿坏死性小肠结肠炎 新生儿重症监护室血清淀粉样蛋白 侧向角散射光 , 肿瘤坏死因子 极低出生体重 温州医学院硕士学位论文 前言 随着围产医学的发展和新生儿急救技术的进步,极低出生体重儿死亡率呈逐 年下降趋势,但是细菌感染仍是其死亡的主要原副。由于极低出生体重儿生理 病理的特殊性,细菌感染多起病隐匿,症状缺乏特异性,有时易与非感染性疾病 混淆,如新生儿一过性呼吸增快、胎粪吸入综合征、新生儿呼吸窘迫综合征、早 产儿呼吸暂停和慢性肺疾病急性发作等,故早期诊断困难。而新生儿免疫力低下, 对细菌感染局限能力差,易造成全身扩散,病情进展快,数小时内即可出现休 克、 多脏器功能损害甚至死亡;存活者中也可因脑膜炎等并发症的发生而影响其生存 质量眩。 传统的血液学检查不能提供敏感、特异的诊断依据,而确诊的金??血 培养检测所需时间相对较长,各医院血培养方法缺乏标准化,存在假阴性和假阳 性问,且标本易受污染,指导临床治疗相对滞后。所以为了减少严重感染的发 生,临床上往往经验性应用广谱抗生素,这必将导致耐药菌株生成和条件致病菌 感染【】。因此寻找可靠的早期细菌感染标记物,对于早期诊断和及时正确的治疗 至关重要。 是目前研究最多也是应用最广泛的急性时相反应蛋白,目前己在我国多 数医院广泛开剧。其最早发现于年,是一种能与肺炎球菌多糖体反应形 成复合物的急性时相反应蛋白。它在发生感染或组织损伤后~ 形成,半衰期 【】等报道在生后天的新生儿 。在急性反应时可升高倍以上【。 败血症的早期诊断中,是唯一最好的实验室指标,动态监测可帮助了解疾病 的过程及抗感染治疗的疗效;但也有报道【仅在感染时后对排除或证实 有无感染时有重要作用,对新生儿败血症早期诊断并无作用,同时也有实验 表明 在感染后升高较晚,敏感性不高。而且新生儿冲正常水平与日龄有关,约 %的新生儿出生后~小时暂时升高【】,使临床对新生儿冲水平升高意义的 判断更为困难。总体来说,对于极低出生体重新生儿细菌感染的敏感性较低, 且相对于正常体重出生新生儿,在极低出生体重新生儿的表达更低,许多人 的研究都证实了这一观点【。。 血清淀粉样蛋白 ,是近期报道的另一种较敏感的非 特异性急性期反应物【。属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质,相对分子量 约。在炎症反应时,巨噬细胞释放的白细胞介素., 和肿瘤坏死因子使.分泌增加,后者刺激肝细胞产生,而 是导致单核细胞和中性粒细胞移行的强力趋化因子,并引起细胞的移行。 等【”研究发现同时将与一比较,的灵敏度可达%, 温州医学院硕士学位论文 特异性为%。在晚发感染的勺,.矛的特异性优于,但是在感 染发生的第一时间,,的灵敏度高于.和冲。同时,感染初 始升高,但危重感染的病死率与的浓度呈负相关,认为动态监测 可以协助判断预后。 中性粒细胞表面抗原即. ,是的段受体,属免疫球 蛋白超家族的成员,分子量为。分三型::. 、. 、. ,是一个高亲和力的受体,起连接体液免 疫和细胞免疫的桥梁作用【。在外周血中主要分布于单核细胞、巨噬细 胞及树突状细胞表面,而在中性粒细胞表面低水平表达。当受到细菌细胞壁 的 脂多糖禾粒细胞集落刺激因子、干扰素.等因子刺激时, 在中性粒细胞表面大量表达,而且能提高氧化新陈代谢和脱颗粒。急性 剜 感染时激活被认为在中性粒细胞吞噬和杀菌中起重要作用【 。 等研究发现中性粒细胞表面抗原有很高的敏感性%~%和特异性 %~%。中性粒细胞表面抗原的表达水平在败血症发生后. 均保持明显升高,说明中性粒细胞表面抗原在败血症早期的敏感程度。 而 等发现非感染性的炎症反应和病毒感染均不会引起在中性 粒细胞的表达增加,表明中性粒细胞表面抗原的表达升高在新生儿细菌 感染中具有很高的特异性。 目前国内对于、、中性粒细胞表面抗原等在极低出生体重 儿细菌感染的感染标记物对比研究尚少,所以关于感染标记物的研究是新生儿 感染的重要研究方向。现在发现的感染标记物种类多,不同感染标记物的作用 机理、诊断敏感性、诊断价值各有差异。总体来说,现认为联合检测、动态检 测感染标记物有利于早期诊断新生儿感染性疾病。 本研究通过对比种不同感染标记物反应蛋白、血清淀粉样蛋白 、中性粒细胞表面抗原对早期诊断极低出生体重儿细菌感染的作 用,试图分析探讨不同感染标记物的诊断效果。以期早期发现、早期治疗感 染性 疾病,并达到合理应用抗生素的目的。温州医学院硕士学位论文 材料与方法 .研究对象 选择温州医学院附属育英儿童医院新生儿重症监护病房年月年 月出生体重疑似细菌感染的极低出生体重儿为研究对象。本研究获得温 州医学院附属育英儿童医院医学伦理委员会批准,对所有研究对象的临床信 息采 集及相关检查,均获得了新生儿监护人的同意,并签署了知情同意书。 .分组方法 分为新生儿败血症组和对照组。 若出现以下任何一项临床表现为怀疑细菌感染:体温不稳定.?或 .?:呼吸暂停或心动过缓;对氧需求增加:病理性黄疸;新出现不明 原因的喂养不耐受、腹胀;嗜睡、肌张力低下、低血压、末梢灌注不良。 新生儿败血症的诊断依据年中华医学会儿科学分会新生儿学组制定的新 生儿败血症诊疗,具有上述临床表现并符合下列任一条者为确诊败血 症: 血培养或无菌体腔内培养出致病菌, 若血培养为条件致病菌,需与另一次 份血、或无菌体腔内、或导管头培养出同种致病菌。血培养阴性,但其外周 血白细胞、、血沉、未成熟中性粒细胞与中性粒细胞比值等非特异性指标中 两项阳性者为临床诊断败血症。 败血症组诊断由位新生儿科主任医师共同诊断并意见一致。 对照组为同时期住院的相应纠正胎龄周和日龄士天无并发感染 性疾病的极低出生体重儿。有严重先天畸形或染色体异常及有免疫缺陷家族 史 者剔除。 .相关检查 对所有入选患儿入院后均详细记录围产期因素、原始诊断、并行胸片、血 常规、血糖、尿、血气分析等检查。入选疑似细菌感染组患儿均做血培养, 其 他部位有感染灶者送局部分泌物培养。疑似细菌感染组患儿于出现疑似细菌 感 染临床表现的 和分别取静脉血抗凝,备测和中性粒细胞表面 抗原,另静置?小时待其凝血后进行快速分离/, 后获血清分装,于.?低温冰箱冷冻保存以备统一检测。有使用抗生素者 于取标本后使用。取同时期住院的相应胎龄和日龄的无并发感染性疾病的极 低出生体重儿为对照组,败血症组近期?例的平均感染日龄为对照组取血的 日龄。在相应的时间点和送检次血标本检测感染标记物。同时监测患 儿的预后。 .感染标记物检测方法温州医学院硕士学位论文 .. 心测定:以微量采血管吸取? .抗凝的全血加入缓冲液 中,用芬兰 分析仪及配套试剂盒进行检 公司的 测。 .. 测定:用双抗体夹心酶联免疫吸附试验。试剂盒购白美国 公司,严格按照试剂盒说明书操作。 .中性粒细胞表面抗原测定:取全血“,加入? / 抗体,混合均匀后避光放置,加入溶剂,避光放置,使用流式细 胞仪检测。上机前先以标准荧光微球校准仪器,每次上机检测都使用同一电 压条 件。每份标本计数 个细胞,根据前向散射光、侧向散射光/点图 显示的形态学特征,选定中性粒细胞群,测定荧光抗体分子/细胞。 .数据处理: 统计学处理应用.软件,经’法分析各组、、中性 粒细胞表面抗原表达水平呈偏态分布,故采用中位数蚴、百分位间距 检验。采用受试者工作曲线 尸~表示,组间差异比较采用. ,分析各指标预测败血症的敏感性和特异 性。.为差异有统计学意义。温州医学院硕士学位论文 结果 .一般资料 例疑似细菌感染的极低出生体重儿中最终诊断为新生儿败血症的例,其 中男例,女例。白细胞异常例,其中白细胞.×/ 例,./ 例。选取同期住院的无并发感染性疾病的极低出生体重儿作为对照组,共例, 其中男例,女例。两组之间胎龄、日龄及出生体重差异无统计学意义尸 .。见表。 表败血症组和对照组患儿一般情况比较 .败血症和对照组血、和中性粒细胞表面抗原水平比较 、 败血症组在 时血、和中性粒细胞表面抗原均明显高于 对照组,差异有统计学意义.。见表。 表败血症组和对照组血冲、及中性粒细胞表面抗原水平比较 。】温州医学院硕士学位论文 .革兰阳性菌感染和革兰阴性菌感染患儿间血、和中性粒细胞表面抗 原表达水平的比较 败血症组血培养阳性例,其中革兰阳性菌例,分别为表皮葡萄球菌, 肠球菌例,溶血性葡萄球菌例,耳葡萄球菌例,金黄色葡萄球菌例;革兰阴 性菌例,分别为大肠埃希菌例,肺炎克雷伯菌例。血、和中性粒细 胞表面抗原在革兰阳性菌感染和革兰阴性菌感染时,其表达水平差异均无 统计学意义均.,见表。 表败血症组不同细菌感染时血、和中性粒细胞表面抗原水平比 较 .流式细胞术中性粒细胞表面抗原检测分析图谱对比 流式细胞术中性粒细胞表面抗原检测结果通过二维点图和单参数直方 图分析,见图。二维点图以双参数.弄.显示结果,每个点表示一个 或多个细胞,不同颜色区分全血不同种类的细胞亚群,红、绿、蓝、、 三种颜色对应为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞。单参数直方图可直观单 参数荧光通道,横轴表示的细胞数量纵轴表示。阴性对照用于决定直方 图中单参数的左右边界,右侧的荧光强度高于左侧。通过对比,可以看出败血 症 组中性粒细胞表面表达水平显著增高。 温州医学院硕士学位论文 一量.一 《“. ? . 分 . 图:阴性对照。用于设定直方图中单参数的左右边界。 温州医学院硕士学位论文 ? ? 钙 乒 器三 钙 跹 口 魁 .二 二 一 且.止 。 一’ ?. . ?.温州医学院硕士学位论文 .血、和中性粒细胞表面抗原预测败血症的曲线分析 绘制 、 时血、和中性粒细胞表面抗原预测败血症的受 试者工作曲线 ,曲线。根据曲线,选 择、和中性粒细胞表面抗原的最佳截断值分别为.、./ 和个荧光抗体分子/细胞见图。各指标的敏感性、特异性、阳性预测值、 阴性预测值见表。 啥??宁??西??百??扩言??丽??。奇一~百??丽?? ???帽一‘???” 图临床可疑败血症组时中性粒细胞表面抗原、、预测败血 .,., 症的曲线,曲线下面积:中性粒细胞表面抗原 . ??冉晰’ 图临床可疑败血症组时中性粒细胞表面抗原、、预 ., 测败血症的曲线,曲线下面积:中性粒细胞表面抗原 ., . 温州医学院硕士学位论文 表 种感染标记物在不同时间点预测败血症的 敏感性、特异性、阳性和阴性预测值% 温州医学院硕士学位论文 讨论 感染性疾病长期以来是新生儿疾病的常见原因,在极低体重儿感染性疾病的 发生率更高,尤其是医院感染已成为极低体重新生儿后期死亡的主要原因之一。 极低出生体重儿发生感染时,临床症状不典型,病情变化快,早期诊断较困难。 细菌培养是诊断感染性疾病的金标准,但细菌培养常耗时较长,待细菌培养结果 回报时,疾病常己进展至很严重,故不宜作为早期诊断的首选方法。病原菌抗原 及检测是目前常使用的特异性检测方法之一,通过已知抗体检测体液中的 未知抗原,对一些常见的特殊细菌如组溶血性链球菌、大肠杆菌抗 原可采用对流免疫电泳,乳胶凝集实验及酶联免疫吸附试验等方法, 该法不受已使用抗生素影响,更有诊断价值,但仅限于已知细菌,不利于筛 查。 针对感染细菌的特定基因采用聚合酶链反应检测及探针等分子生物 ,但对于实验室要 学技术,用于细菌感染及败血症的检测,特异性及敏感性高【 求及操作者水平要求高,同样难以在多数医疗机构推广。因此,选择合理、高 效、 。 操作方便的感染标记物对早期诊断新生儿细菌感染十分有意义 是目前研究的最多也是应用最广泛的急性时相反应蛋白,目前已在我国 多数医院广泛开展。主要在肝脏合成,正常人血液中的含量非常低, 在一些急性时相如当机体受感染或组织损伤时,的合成在.内迅速增加, .达到高峰,含量可为正常值的.倍;在经过合理的治疗后,.可 迅速降至正常范围。因此临床上冲不仅可以帮助早期诊断细菌感染,亦有助 于早期判断治疗效果。但由于检测方法的不同,且为一种非特异蛋白,如损 伤出血、溶血等因素可使其升高,肝脏损害严重时其增高不明显,临床上存在 假 阳性和假阴性。 本组研究显示,时对于败血症的诊断敏感性为.%,特异性为.%, 随着时间延长,至时对于败血症的诊断其敏感性及特异性分别为.%, .%。总体来说,对于极低出生体重新生儿细菌感染的敏感性较低。 同时由于相对于正常出生体重新生儿,在极低出生体重新生儿的表达更低, 许多人的研究都证实了这一观点【,】。等测定低出生体重新生儿的值 参考范围为/,出生后超过此值则考虑存在细菌感染【?。李铁耕等研 究发现,当采用值,/作为截断值时,对于细菌感染的诊断敏感性 仅为.%,而当采用?./时,其诊断敏感性则提高到.%,并认为对于 新生儿及极低体重儿应修改的界定范围以提高诊断敏感性瞄。 纠检测了例低出生体重早产儿的情况,发现在早产儿中的表达强 度与感染严重程度有相关性,在感染严重的病例及败血症患儿,表达越高。 温州医学院硕士学位论文 并认为动态检测冲的变化有利于指导治疗,的下降意味着患儿较好的预 后,下降至/能作为停用抗生素的依据之一。 在极低出生体重儿的表达较低的原因,目前认为与极低体重新生儿的免 疫反应不成熟、免疫功能较低下、炎症反应较弱有关【。同时由于是在肝脏 细胞合成分泌,极低体重新生儿肝脏发育不完善,因而产生的量相对减少,在 感 染时虽可有升高,但升高幅度小。当随着极低出生体重儿出生日龄增加,表 达会逐渐增加。因而有人提出对于新生儿心检测,应采用动态观察,不仅检测 的强度,其动态变化趋势同样重要。本组研究中,与比较,敏感性 有增加。我科陆中权等【对例极低出生体重新生儿进行动态检测,发现 对于细菌感染的诊断敏感性为%,特异性为%,敏感性及特异性均较本研究 结果增高,分析与近几年我科对早产儿尤其是极低出生体重儿细菌感染认识 和警 惕性增高,及早干预和检查有关。目前国内多采用/作为界定参考值, 由于在极低出生体重儿的表达较低,会降低其敏感性。因此对于极低出生体 重新生儿,不应选用传统的标准及 /作为截断值,本研究通过计算曲线下 面积,得出最佳截断值为. /。由于截断值的选择同时受限于各个实验室仪 器的试剂的使用,若要得出一个可以通用的最佳截断值,尚需要更大的样本 数。 有人提出采用超敏检测以提高敏感性。超敏采用或荧光免疫技术, 使心的检测能力提高到./【乙。 败血症组共有例新生儿坏死性小肠结肠炎 , 患儿,例接受了外科手术。在这例患儿中,均有增高,表明对 等【 证实,在同时存 新生儿坏死性小肠结肠炎的诊断敏感性较高。 在与败血症的患儿,其及的表达强度均较单纯败血症组增高,表明 等通过前瞻性研 及可做为诊断的重要参考指标。 究,对可疑患儿每间隔动态监测心水平,发现组患儿冲水平明 显增高,且水平持续进行性增高的患儿往往需要外科手术的干预及有不 良的预后,而水平下降则提示可以给患儿进食及停用抗生素。.因此,动态监 测水平有助于帮助判断新生儿坏死性小肠结肠炎患儿治疗效果和预测预后。 与同属非特异性急性时相反应蛋白,属于载脂蛋白家族,相对分子 量约。是一种更加敏感的急性时相反应蛋白,在炎症和组织损伤时, 由肝组织、平滑肌细胞等分泌。其合成受白细胞介素、白细胞介素.、糖皮 质 激素、肿瘤坏死因子等多种炎症介质调控。而且不仅仅在人类,在许多动物 如鱼 类‘、哺乳动物类如猪‘、牛【身上都可以检测到炎症状态下的增高。正 常情况下,人血中的浓度表达极低,且与年龄成正相关,在新生儿, 。 水平多在可以检测水平的最低值左右范围,年龄较大婴儿水平则偏高【 温州医学院硕士学位论文 当机体受到上述炎症介质刺激时,可迅速增加,在.内达到峰值,较正 常水平增高约.倍,且半衰期极短,当刺激因素消退,炎症得到控制 后,在肝脏及肾脏中迅速代谢掉而使血清水平降至正常。血清水平与中 性粒细胞数有相关性,目前认为具有直接的前炎症细胞因子活性,是导致单 核细胞和中性粒细胞移行的强力趋化因子,并能引起细胞的移行,可引起中 性 粒细胞及其他炎症细胞因子增加,并通过与高密度脂蛋白结合,结合后 可形成特异的/复合体结构,这种复合体结构能加剧炎症反应的发生发 展,当血清水平异常增高时,/复合体结构产生系列级联反应使炎 症反应加剧‘,。 本研究发现,在怀疑感染的时,与冲和相比,对于败 血症的诊断有最高的敏感性,达.%,但其特异性较低,仅为.%,不及 及;在 时,对于败血症的诊断也有较高的敏感性,为.%,但其 特异性仍较低。这与 等的研究相符合, 等将早产儿与. 和冲比较,结果表明在晚发感染的勺,.和的特异性优于,但是 等还 在感染发生的第一时间,,的灵敏度高于.和。 发现,感染初始升高,但危重感染的病死率与的浓度呈负相关。目前 认为,动态监测可以协助判断预后,并同样可以作为一种敏感有效的检测使 用抗生素疗效及停药指标【。高敏感性的原因之一是由于早产儿极低体重儿 的正常水平极低,因而增高尤其适用于极低出生体重儿的早期判断感染 。 的检测指标 的敏感性较高、特异性偏低的另一表现在于,增高不仅仅出现在细 、 菌感染的时候,在其他应急状态如外伤‘、寄生虫感染‘、流感病毒感染‘ 呼吸道合包病毒感染‘ 、感染九、真菌感染【、结核细菌感梨时,均可以 观察到明显的水平增高。这种多种感染均能出现增高的情况,也是 得到越来越广泛应用的重要原因。王怀莲等比较了侈确诊为流感病毒感染的 患 儿,发现急性期有高达.%的患儿出现增高:而在流感病毒感染的恢复期, 升高仅见于.%病例【。 等研究发现,在例发生败血症的早产儿 病例中,与、比较,升高出现最早,同时感染控制后下降最快, 在异常严重感染病例,可出现下降,而且在、持续增高时出现的 的下降,多意味着较高的死亡率【。同时由于的增高在急性时相状况下 出现较早,作为新生儿尤其是极低体重儿的感染标记物检测有较好的效果。 中性粒细胞表面抗原即. ,是的段受体,属免疫球蛋白超家 族的成员,分子量为,正常情况下在外周血中主要分布于单核细胞、 巨噬细胞及树突状细胞表面,在中性粒细胞表面低水平表达。当受到细菌细 胞壁温州医学院硕士学位论文 的脂多糖和粒细胞集落刺激因子.等刺激时,在中性粒细胞表 面大量表达,而且能提高氧化新陈代谢和脱颗粒。中性粒细胞表面抗原在 新生儿的表达同样与年龄有关,但与相反,早产儿中性粒细胞表面抗原 的表达较足月儿要增高【。 新生儿中性粒细胞表面抗原检测在感染性疾病早期诊断中起到越来越 【】等在比较了四种白细胞表面抗原在极低体重新生儿感染中 重要的作用。 的表达情况,包括种淋巴细胞表面抗原、,种中性粒细胞表面 抗原、,发现在感染后、,的的敏感性达%.%,阴性 预测价值达%.%;其特异性及阳性预测价值分别为%、%。因此有研究 者认为,的早期诊断价值远大于其他几种表面抗原,单纯性可作为 极低体重新生儿使用抗生素的指征而无需等待细菌培养结果【 ,中性粒细胞 表 面抗原的检测目前多使用免疫荧光法配合流式细胞术检测。操作步骤简单, 可重复性高,费时短,通常小时内可完成标本检测。 本研究显示,除在时,中性粒细胞表面抗原水平检测对于诊断败血 症的敏感性不及夕,中性粒细胞表面抗原的在、时诊断败血症的 特异性及时的敏感性均大于及。根据在不同时间中性粒细胞表面抗 原测定结果,绘制、时曲线,计算中性粒细胞表面抗原在 、时曲线下面积分别为.、.。根据这一结果,可认为中性粒细胞表 面抗原检测在时诊断败血症准确度为中等,在时诊断准确度较高。 目前的研究观点认为,对于新生儿感染的诊断,无论是敏感性还是特异性, 等对份感染 中性粒细胞表面抗原的诊断价值均要高于。 及疑似感染的患儿血标本进行研究,将其与传统的反应蛋白、红细胞沉降率、 血白细胞计数进行比较,并对比患者临床表现及血培养结果,证实中性粒细 胞表 面抗原的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为.%、.%、 .%并. /:而对应的反应蛋白的敏感性及特异性分别为.%、.%。 但对于极低体重新生儿,目前尚缺少大样本研究资料。 同时,本研究还发现,虽然中性粒细胞表面抗原的诊断敏感性及特异 性均要高于,本组资料中还有例败血症组病侈及时出现增高,而 中性粒细胞表面抗原却未明显增高的情况。这一现象表明虽然的诊断 敏感性及特异性较高,但还不能完全取代而作为唯一的感染诊断指标。 有鉴于此,目前感染标记物的选择,越来越多的采用个或个以上感染标记 物的联合检测。本研究中,当采用三种感染标记物联合检测时,其诊断的准确 率 明显提高,其、的诊断敏感性分别达.%、.%,特异性达.%、.%。 表明联合检测有益于早期诊断。温州医学院硕士学位论文 等研究表明,中性粒细胞表面抗原联合.、.在败血症患 儿早期诊断中的特异性及敏感性均达%【训。联合检测感染标记物的优点己越来 越多的被证实【,虽然不同感染标记物联合检测的敏感性及特异性各有差异, 但总体来说,联合检测感染标记物,明显有利于提高早期诊断的敏感性及特异性。 同时动态检测也是感染标记物临床应用的方向。本研究中,败血症组、、 中性粒细胞表面抗原三种感染标记物在的检测值较均显著增高,而在 对照组矛差别不明显。因此对于细菌感染,动态观察感染指标的变化,有 利于早期诊断及治疗评价。作为早期检测方法,期望的敏感性应达到或接近 %,但目前的联合检测手段离这一目标仍有距离,即使采用多种联合检测和 动态测定,仍难以避免漏诊情况。因此如何选择合适的不同感染标记物联合检测, 应是进一步研究的方向。 本研究还表明在不同的细菌感染情况下血、和中性粒细胞表面抗原 的表达水平差异均无统计学意义。目前国内外尚无类似研究。因此,进一 步探讨不同感染标记物对病原学的提示意义是另一个研究方向。 综上所述,极低出生体重儿发生细菌感染时,血、和中性粒细胞 表面抗原水平测定对其早期诊断有一定的帮助,但单一指标诊断败血症 的敏感性和特异性均不理想。三种感染标记物联合检测并动态测定,有利于提 高极低出生体重儿细菌感染早期诊断的准确性和特异性,但不能区别革兰阳 性 菌感染和革兰阴性茵感染。温州医学院硕士学位论文 小结 .用于极低出生体重儿早期诊断细菌感染敏感性较低,特异性不及。 但连续动态监测可以提高其对极低出生体重儿早期诊断细菌感染的敏感 性和特异性。 .血清淀粉样蛋白用于早期诊断极低出生体重儿细菌感染敏感性高,但特异 性较低。 .中性粒细胞表面抗原是早期诊断极低出生体重儿细菌感染的灵敏指 标。 .、血清淀粉样蛋白和中性粒细胞表面抗原三种感染标记物联合 检测和动态测定有利于提高极低出生体重儿早期诊断细菌感染的准确性和 特异 性,但不能用于区别革兰阳性菌感染和革兰阴性菌感染。 温州医学院硕士学位论文 参考文献 周伟,刘志刚,陆玲,等.极低出生体重儿医院感染的临床特点及早期诊断.中 华围 产医学杂志.。:.. 李耿,伍佰祥.新生儿细菌感染标记物的研究进展.中华儿科杂志.,: . , 【】 , , .【 .. . :?. 陆中权,张信良,林忠东等.早期诊断极低出生体重儿细菌性感染的实验室指 标评 】 价.中华儿科杂志., :..】 只 , ,? . ,. ..:?. . 】 , . . .:. . , , , 】 . ..:?. .】 , , . ..: .? 【】 .【,? . ..:?. ? , 【 , . .. ? . :., , , . 】 , , . .. :?. . , , 】 , , 一 ,. ..:温州医学院硕士学位论文 . . 【】 , ,,. . ..: . , ’ , . ..:?. 【】 , , . .. .: .. , , 】 . . ..:?. ? . , , , 【】 : . ?. ..?: 中华医学会儿科学分会新生儿学组,《中华医学会中华儿科杂志》编辑委员 会.新生 【】 儿败血症诊疗方案.中华儿科杂志.,:. 【】 , , .:. . .. 张红专.检测新生儿早期感染的敏感指标.医学综述.,:. 【】 , , , . . ,.:. 李铁耕,徐放生,程显芬等.高敏反应蛋白在新生儿细菌感染性疾病诊断中的 意 义.北京医学.,:?. , , , . .. : . . ?, , ., . .. :. ., ,. ..:. , , , , .【】 温州医学院硕士学位论文? , . . .:. .,, ,... : ,.. , . 】. ?..?:.. 】 , ,., , . ..:?. . , , ? 【 ...:. 吴尤佳,徐美玉.新生儿细菌感染标记物的研究现状及展望.交通医学.,: 【】 .. . , ,【 . . ..: 】扁‘蔚,翁婷,王丽芳.慢性阻塞性肺疾病患者血清水平及其意义.临床肺科 杂 . 志. ,:?. . , , 】? . ..:.. 】 , , , . . . .: , , .【,【】 , 似. .. :?. ? , , . . .. :. . ,, ,】 温州医学院硕士学位论文 . ..:?. 】 , , , . . .. :. 徐忠玉,张阳根,邓小军等.血清、、检测在肺结核疾病活动诊断中的 】 意义.实验与检验医学.,:.. 变化的比较.中 【】 王怀莲,李敏.小儿流感病毒感染后反应蛋白和 国医药导报.,:.’ 【】, . . . .:?.【】 ,, .仃 : . ..:., , 【】 , . .. : . .. 。 【】 , ,..:?. . 李白华,胡振,方玉蓉等.、、在儿科感染性疾病中的诊断价值分析.中 , 华肺部疾病杂志电子版.,:., , ,. , . . . 。 : ? , , , . ,,. ...:? 温州医学院硕士学位论文 附录:读研究生期间发表的文章 、自动脑干诱发电位技术在高胆红素血症新生儿听力筛查中的应用《中国新 生儿科杂志》,.,第卷第期 、喜炎平联合匹多莫德治疗手足口病疗效观察《海峡药学》,.,第 期 、先天性梅毒骨损害一例《中国新生儿科杂志》,.,第期 温州医学院硕士学位论文 个人简介 姓 名: 黄玉梅 出生年月: 年月 政治面貌: 群众 通过 国家职业医师资格考试: 主要学习经历: ... 温州医学院大学本科 ..至今 温州医学院在职研究生 继续教育学习经历: 、中美儿科论坛温州/科疾病诊疗进展学习班,浙江温州 、温州国际围产医学高峰论坛,浙江温州 、临床住院医生规范化. 主要参与的课题: 三种感染标记物对于极低出生体重儿细菌感染早期诊断及预后评估的价值 市科技局课题 主要承担的内容: 标本收集,资料整理,论文撰写 读研期间主要发表的主要文章: 、自动脑干诱发电位技术在高胆红素血症新生儿听力筛查中的应用《中国新 生儿科杂志》,.,第卷第期 、喜炎平联合匹多莫德治疗手足口病疗效观察《海峡药学》,.,第 期 、先天性梅毒骨损害一例《中国新生儿科杂志》,.,第期 其它技能: 英语水平:大学英语六级考试 计算机水平:浙江省计算机应用能力考核合格证书. 全国专业技术人员计算机应用能力考试合格证书. 年度卫生专业技术中级职称资格考试合格证书温州医学院硕士学位论文 致谢 在论文即将付梓之际,内心感慨万千,在这段紧张而枯燥的日子里,来自 各方面的关怀和鼓励,使我不断成长,度过一个个难关。在此谨向所有关心、 支持和帮助过我的老师、同事和同学致以最诚挚的谢意 首先要感谢我的导师林振浪教授,正是您的悉心指导和谆谆教诲,才使我 得以顺利完成学业。林教授严谨的治学态度,求实创新的科学作风,广博丰富 的理论和实践知识,敏锐的观察力以及敏捷的思维,积极进取的工作态度和 高 尚的医德,精湛的医术时刻影响着我。他为我的学习和工作点燃了一盏明灯, 照耀着我前进的道路。 衷心感谢温州医学院附属育英儿童医院新生儿科陈尚勤主任、周小坚主任、 梁志强主任、陈鲜威主任、汪盈、麦菁芸等各位老师在科研、临床工作中给 我 的指导和帮助,感谢陈春、林素、胡钱红、朱将虎等所有同事在收集病例资料 及统计方面对我的帮助及支持,使课题能够顺利完成。衷心感谢新儿科全体护 士在标本采集方面的无私帮助。还要感谢检验科江明华主任在标本检验、数据 处理中的鼎力相助。 感谢温州医学院附属第一医院检验科叶爱芳同学在实验方面提供了帮助和 支持。 最后,当然要感谢我的家人,无论在何时何地,总能义无反顾地支持我, 使我免除了后顾之忧。他们的鼓励和肯定是我不断前进的动力。温州医学院硕士学位论文 流式细胞术检测在新生儿感染性疾病早期诊断中的应用 黄玉梅综述 林振浪审校 新生儿感染是新生儿疾病的重要原因。由于新生儿生理特征的特殊性,新 生儿感染性疾病多起病隐匿,其早期症状多缺乏特异性,与非感染性疾病鉴别 困难,且进展迅速,易短时间出现休克、多脏器功能损害、死亡?。早期诊断 和治疗能显著改善新生儿感染预后。因而选择合理有效的感染标记物协助早期 诊断有十分现实的意义。 理想的感染标记物要求具有下列特征:必须有最佳截取值以区分感染 与非感染,并有高灵敏度与阴性预告值以及较高的特异性与阳性预告值。若能 更精确的区分不同种类细菌、真菌或者病毒感染,则该感染标记物更具有价值。 通过监测感染标记物的强度,能起到监测疾病进展情况,以指导治疗、评 估治疗的效果并作为判断预后的指标。能做到早期诊断,并能不受其他非 感染因素的影响。标记物监测具有可推广性,能在合理的价格下做到迅速 测定【】 目前检测新生儿早期感染的标记物较多,临床常用的包括: 白细胞计数和白细胞层涂片镜检:正常新生儿白细胞计数波动范围很 大,尤其是新生儿出生后天内可为波动在?.几,且任何时候均不应低于 ./,白细胞值过高或过低则提示细菌感染。白细胞显著增高时应考虑败血症 的可能,可作为快速诊断参考。外周血白细胞计数及分类在机械计数及分类后有 了统一标准化可能,简单易行。但对于白细胞形态学的观察,机械难以完成,应 作涂片检验。白细胞层涂片镜检,发现细菌数越多,提示预后越差。但无论白细 胞计数或白细胞层涂片检查,其诊断败血症的敏感性及特异性均较差。 血培养:血培养是使用病原学的方法对患者的血液进行体外培养,以 发现致病微生物,是目前诊断败血症的“金标准”。同时行药敏检测,还可用于 指导抗生素使用。血培养与其他处体液培养获得相同细菌更有意义。但血培养检 测所需时间相对较长,结果存在假阴性和假阳性的问题,限制了其用于感染性疾 病早期诊断。 白细胞介素,:是机体在防御、急性期反应、免 疫反应和造血反应等过程中起重要作用的多功能蛋白,是诱导肝急性期反应蛋白 如反应蛋白产生的主要细胞因子,在感染或损伤后最早可从血清中测得。 大多数正常新生一水平极低,在/以下,当细菌感染时,一水平迅速升 高,?达到高峰。等【】研究表明,工一是新生儿感染的早期敏感指温州医学院硕士学位论文 标,但其窗口期较窄,限制了其单独作为感染标记物的应用。临床上需要联合一 种相对晚发和更有特异性的指标女,以提高其敏感性。 :是目前研究的最多也是应用最广泛的急性时相反应蛋白,目 前己在我国多数医院广泛开展。主要在肝脏合成,正常人血液中的含量 非常低,在一些急性时相如当机体受感染或组织损伤时,的合成在.内迅 速增加,.达到高峰,含量可为正常值的.倍;其半衰期为,在 经过合理的治疗后,.可迅速降至正常范围【】。因此临床上不仅可以帮助早期 诊断细菌感染,也可帮助早期判断治疗效果。的缺陷之一在于临床上存在较 高的假阳性率和假阴性率。 血清降钙素原:降钙素原,是一种无激素活性的 糖蛋白,是降钙素前肽物质。在生理情况下甲状腺细胞可产生极少量的, 健康人群的血清水平通常测不到小于. ‖,对于健康新生儿来说, 在出生内有生理性升高,平均值为‖,从生后天起参考值同成 人【。具有敏感性及特异性高的特点,但在一般感染时其值升高不明显【。 本文主要介绍中性粒细胞表面抗原检测在新生儿感染性疾病早期诊断 中的应用。 一中性粒细胞表面抗原的结构、分布与功能 ,是的段受体,属免疫球蛋白超家 中性粒细胞表面抗原 族的成员,分子量为。由定位于号染色体长臂上的、、个基因编码的 .跨膜糖蛋白。中性粒细胞表面抗原的基本结构分为胞外部分、跨膜片段及 胞 浆尾。胞外部分含有个细胞外类结构域,易与单体结合。分型:一 。与、相比, 、一 、? 是一个高亲和力的受体引。正常情况下在外周血中主要分布于单核细胞、巨 噬细胞及树突状细胞表面,在中性粒细胞表面低水平表达。眍~识别免疫球蛋 白的段,表达受细胞因子的调控,起连接体液免疫和细胞免疫的桥梁作用。 当受到细菌细胞壁的脂多糖和粒细胞集落刺激因子等刺激时, 在中性粒细胞表面大量表达,而且能提高氧化新陈代谢和脱颗粒。目前确实观察 到,在应用重组干扰素和中性粒细胞集落刺激因子时,中性粒细胞表面抗原 升高明显【】。同时,中性粒细胞表面抗原可通过抗体依赖性细胞毒作用、细 胞吞噬作用、免疫复合物作用,实现对病原微生物的清除。中性粒细胞表面抗 原的这种表达出现较早,通常在机体感染或内毒素入侵后的?时即升高 明显【。中性粒细胞表面抗原还参与了中性粒细胞的噬菌作用,细菌感染时 中性粒细胞表达明显升高,配体通过与结合,启动并放大免疫反应,产温州医学院硕士学位论文 生一系列级联反应,包括吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用和氧介质 的释放等【引。新生儿尤其是早产儿的体液免疫低下,细胞免疫在抗感染中显得尤 为重要。 等研究了足月儿、早产儿、年长儿及成人急性细菌感染的早 期阶段中性粒细胞的表达,结果发现,新生儿细菌感染组中性粒细胞表面抗 原的表达明显高于非感染组,且早产儿细菌感染组中性粒细胞增高的程 度与足月儿、年长儿及成人之间无差异,中性粒细胞表面抗原表达的增高在 革兰阳性和阴性茵感染之间无差异,健康的早产儿和足月儿中性粒细胞表达 明显高于健康成人【 。目前认为,中性粒细胞表面抗原的表达无性别差异, 但其受年龄及妊娠影响,其在新生儿及老年人的表达高于成人,妊娠期表达高于 非妊娠期 。 等同样证实,早产几的中性粒细胞表面抗原表达 与胎膜早破、新生儿呼吸窘迫无关,而与细菌感染有关,且早产儿中性粒细胞表 面抗原的表达较足月儿要增高【 。这也是中性粒细胞表面抗原的检测在 新生儿感染疾病早期诊断中越来越受到关注的重要原因之一。 二、中性粒细胞表面抗原的检测方法 中性粒细胞表面抗原的检测目前多使用免疫荧光法配合流式细胞术检 测。流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术,通常指细胞 通过激光束时在液流中的特性,即粒子的大小,密度或是内部结构,以及相对的 荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。 流式细胞术中性粒纽胞表面抗原检测操作步骤简单,可重复性高,费 时短,通常小时内可完成标本检测。基本步骤:先采用免疫荧光法标记 抗体及同型对照,目前多采用鼠抗人单克隆抗体。外周血标本采集后经抗 凝处理,抗凝可采用肝素钠或乙二胺四乙酸。血标本与荧光标记过的抗体 混匀后,室温避光.分钟,使用溶血仪溶血、固定,经流式细胞仪检测。检 测前进行光.流路质控监测,保证每次检测前仪器的状态稳定一致,根据前向角 和侧向角散射光信号分别设门在淋巴细胞群和中性粒细胞群。上机时获取每份样 本的细胞数为设门内的细胞在.个以上。可以采用淋巴细胞作为内部阴 性对照,阴性对照控制在%以内;或可采用单核细胞作为内部阳性对照,阳性 对照控制在%以上【‘ 。中性粒细胞表面抗原较稳定,检测标本在室温下 以上。 可保存,?时标本可以保存 流式细胞术数据分析包括从点图文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分 布情况。我们可以通过单参数直方图,二维点图和三维图来分析结果。单参 数直 方图可直观单个参数的细胞数量,用于定位边界,二维点图以双参数显示结 果, 每个点表示一个或多个细胞,用于设置象限标志。如果需要还可以建立数据 统计 温州医学院硕士学位论文 表以输出结果。 中性粒细胞表面抗原检测结果有三种表示方法:阳性细胞百分率、 等研究发现,中性粒细胞 平均密度和指数种方法表示【。 表面抗原阳性细胞百分率在败血症和全身炎症反应综合征时都升高, 而平均密度只在败血症升高,因此平均密度更宜作为鉴别诊断败血症 禾的指标【。指数指待测中性粒细胞与淋巴细胞的平均荧光 道数之比,其计算方法为:采用淋巴细胞作为内部阴性对照,待测中性粒细胞 平均荧光道数/淋巴细胞平均荧光道数。 三、中性粒细胞表面抗原检测在新生儿感染性疾病中的应用 .在新生儿细菌性感染疾病中的应用 新生儿中性粒细胞表面抗原检测在感染性疾病早期诊断中起到越来越 重要的作用。外周血白细胞计数、中性粒细胞百分比作为传统上对发热患儿 进行 。 细菌感染筛查的工具已应用多年,但有研究证实它既不敏感也非特异 等研究表明在监测全身性感染和脓毒血症时,无论在成人组及儿童 组,中性粒细胞的表达优于反应蛋白和白细胞计数与分类,其敏感 性%,特异性为%~%,且在鉴别自身免疫性疾病中有一定意义皿。 等对份感染及疑似感染的患者血标本进行研究,将其与传统的反 应蛋白、红细胞沉降率、血白细胞计数进行比较,并对比患者临床表现及血 培养 结果,证实中性粒细胞表面抗原的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预 测值分别为.%、.%、.%幂.%。而对应的反应蛋白的敏感性及特 异性分别为.%、.%:白细胞计数的敏感性及特异性为.%、.%,红 细胞沉降率的敏感性及特异性为.%、.%,中性粒细胞表面抗原对于 等在比较了四种白细胞表面 感染性疾病的诊断价值明显高于其他指标【。 抗原在极低体重新生儿感染中的表达情况,包括种淋巴细胞表明抗原、 ,种中性粒细胞表面抗原、,发现在感染后、, 的的敏感性为%.%,阴性预测价值%.%;其特异性及阳性预测价值分别 为%、%。中性粒细胞表面抗原的早期诊断价值远大于其他几种表面抗 原,单纯中性粒细胞表面抗原日性可作为极低体重新生儿使用抗生素的指 征而无需等待细菌培养结果,】。 .在败血症早期诊断中的应用 中性粒细胞表面抗原在新生儿败血症的早期诊断中同样可起到重要作 用。新生儿败血症是新生儿感染性疾病中最常见的感染,血培养虽是诊断败血症 的重要依据,但阳性率不高,且培养所需时间长,不能达到早期诊断的目的。温州医学院硕士学位论文 反应蛋白是目前最常用检测指标。反应蛋白是机体在感染、炎症和组织损伤后 由细胞因子介导肝脏产生的急性时相蛋白,其对于感染,各种炎症过程及组织损 伤与坏死的判断、监测及病情评估与疗效考核,都具有重要的临床价值。但由于 新生儿肝脏不完全成熟致使产生反应蛋白的量较少,所以当受细菌性感染时阳 性率较低,敏感性较差【引。周亮等对例临床诊断败血症患儿与侈对照组进行 回顾性研究发现,在败血症组与非感染组之间反应蛋白差异虽有一定意义, 反应蛋白其曲线下面积.,而曲线下面积.,特异性及敏感性 均高于反应蛋白】。 等研究表明,在败血症发生的早期,当以. 为截取值时,指数的敏感性、特异性、阴性预测值分别为%、%、%; 在败血症发生时后,以.为截取值时,其敏感性、特异性、阴性预测值分 。 别为%、%、%,提示指数可作为败血症早期诊断的敏感指标 等研究表