【doc】体外青蒿素衍生物抗卡氏肺孢子虫作用的PCR—SSCP分析

【doc】体外青蒿素衍生物抗卡氏肺孢子虫作用的PCR—SSCP 体外青蒿素衍生物抗卡氏肺孢子虫作用的 PCR—SSCP分析 2002,18(1)中国人兽共患病杂志 ChineseJourna1ofZoolloses91 文章绾号:1002—2694(2002】01—0091—04 体外青蒿素衍生物抗卡氏肺孢子虫 作用的PCR—SSCP分析 倪d,毅陈雅棠 摘要:目的研究双氢膏蓠素,膏蓠琥醇对卡氏肺孢子虫脚腺嘻嚏合成辞基园(Ts),二氢叶酸还原辞基园(DHFR)的影 响.方法用不同浓度的双氢膏蓠素,膏蓠琥酯作用于体外培养的卡氏肺孢子虫.用药7天后收集培养液提取卡氏肺孢子虫 DNA,舟剐进行PCR扩增,将扩增产物作DNA的单链柯象多恋性分析(ssce).结果卡氏肺孢子虫”IS基园和DHFR基目 的扩增产袖舟剐为403和273bp.经青蓠素衍生物作用后TS基园,DHFR基园在澳化乙锭染色上的强度均有明显减少.继 续作SSCP分析发现,用药组与不用药组对比DHFR基因DNA来带无明显差别,而用TS基园DNA来带中有一条带的位置 发生改变.提示读基园可能出现变异.结论SSCP分析结果提示膏蓠素衍生物对卡氏肺孢子虫的DttFR基园结构无影响. 而TS基园则可能出现部分变异.提示TS基园可能是该类药物抗卡 氏肺孢子虫的机理之一. 关键词卡氏肺孢子虫,膏蓠素衍生物.单链柯象多杰性分析 /nvitrostudyoftheeffectofarteminsin derivativesagainstPneumocystiscariniibyPCR-SSCP NIXiaoyi,CHENYatang (InstituteofInfectiousandParasiticEh’seases,CollegeofClinicalM~ticine, Ctwngq~ngUniversityofMedical&m,Chongqing400016) ABsnu-cr:TostudytheeffectdarteminsknderivativesOnthymdyiatesymhesege~e(TSgeae)anddihydtofolatereductase gene(DHFRg?e)ofpneumocy~tiscarinii,Pcincultureme~umweremanagedby~fferent?r1嘲1m.n5ofDHAandATSThe supernatantsample~obtainedaIter7days.andweretakenforDNAtemplateAfterPCRtt,theproductsofPCRwel-eexammed withSSCPThepred~tsofTSge~aeandDHFRg?ewere403and273bprespectively.ThePCRproductsofdruggroupweremuch tessthanthatofnodruggroupSSCPtshowednOdiffereaaeebetweennOdruggroupanddruggroupinD肼gene,buthaddiffer 即cebetweentwogroupinTSgeaaeWefoundthatoneDfDNAch血 0f”ISgea~ee砰s5edv~iEfflCeindruggroupTheV[~lai’li2eof “ISge~aemaybeconsideredasodeofthemechanism0fartemkminderivativesagr?Pc. KEYW0RDS:pneumocystiscarinii;Arteminsindeva1i 中图分类号:R382.3文献标识码:A 卡氏肺孢子虫肺炎(PneumocystiscarinilPneu. moniaPCp)是发生于免疫功能低下病人.如AIDS 病人,肿瘤化疗病人的一个常见并发症和重要死亡 原因.其主要治疗药物复方磺胺甲唑和喷他脒虽有 较好的疗效,但由于其较大的毒副作用影响了其使 用.最近我们对国产青蒿素衍生物体外抗卡氏肺孢 子虫作用进行了研究,发现该类药物对卡氏肺孢子 虫的增殖有明显的抑制作用【1].为了进一步探讨 该类药物的杀虫机理,我们对药物作用后的肺孢子 虫的胸腺嘧啶合成酶基因(TS基因),二氢叶酸还原 酶基因(DFIFR基因)进行了PCR—SSCP分析.现 将结果报道如下. 1材料与方法 1.1卡氏肺孢子虫模板DNA的提取用我们所 作[卡氏肺孢子虫体外培养并用药7天后的上清液 留作卡氏肺孢于虫DNA模板.取空白对照组,双 氢青蒿素IO/zM/L组,双氢青蒿素5OM/L组,青 蒿琥酯IO0/~M/L组,HepG一2细胞及正常大鼠肺 组织作PCR扩增试验.取培养液400~1,置Eppen. *国京自#科学基盘赘助《项目号:抛67o658) 怍者单位:t庆压科大学尉?第一临床医院传荣精寄生虫崭研兜所 “E庹,400016) 92中国人兽共患病杂志 ChineseJournalo/Z.on.se5 doff管中.将Eppendorf管放置于沸水中4Os.于 室温下12O00g,离心lOmin.吸取上清移至另1个 Eppendod.向上清加入4O”12.5mol/’LNaAc(pH5. 2)和42O”1异丙醇.振荡混匀.室温放置5rain. 12O00g4”C离心lOmin.弃上清.加入Irnl70%乙 醇,漂洗沉淀物.12000g,4?离心2mln.去上清,用 小滤纸条吸净管壁上水珠.真空干燥2rain.加入 5O”lTE,短暂振荡,溶解DNA,置一20?保存备用. HepG一2细胞及正常大鼠肺组织也照此处理. 12PCR反应TS基因的PCR引物根据文献2 得出,引物I:5’一A1vrTATGGGTTTCAATGG 一 3’.引物II:5’一TGCAATA1vrAAAGGG AAC一3’.此对引物扩增产物长度为403bp. DHFR基因的PCR引物根据文献(得出,引物I:5’ 一 c1TTAGTACCAACCCAAGAT一3’.引物 II:5’一CTGCAAAATCCTTGGATCAT一3’. 此对引物扩增产物长度为273bp.均由上海生工生 物工程公司合成.TaqDNA聚合酶购自上海生工. PCR循环仪为PE—Cetus公司2400型.在02ml Eppendorf管加入下列反应产物:10XPCRbuffer 5gl,dNTPsltd.Taq酶1,引物各lvtl,DNA模板 lvtl,ddH2O4O出,总体积50td.稍离心后放PCR扩 增仪闸,反应条件:?TS固:94?预变性5rain,94? 30s,50?25s.72?lmin,共4O个循环,最后一轮循 环后72?延伸5rain.?DHFR基因94?预变性3 m{n.94?2rain.50?1rain.72?lmin,共30个循 环,最后一轮循环后72?延伸5min. PCR结束后,取5tA反应产物于含05og/ml溴 化乙锭琼脂糖凝胶电泳.TS基因产物使用1.5% 琼脂糖凝胶电泳.DHFR基因产物使用2%琼脂糖 凝胶电泳.电泳缓冲液为05×TBE缓冲液,100V 稳压电泳2h,紫外透射仪和数字化凝胶成像分析仪 上观察并分析DNA条带的强度. 13SSCP实验将PCR扩增产物与变性上样液 按1:5的比倒加入0.5mlEppend0rf管中,混匀.经 98?变性10rain,立即冰浴骤冷.取5uI变性样品 于8%聚丙酰胺凝胶中电泳后,将胶置入含30%乙 醇,10%冰醋酸的固定液中至染料消退.倾去固定 渡.用双蒸承漂洗凝胶3次.再将胶置入01%硝 酸银溶液中染色30rain,倾去染液后用双蒸水快速 漂洗1遍.漓干双蒸水.将凝胶置于含3%无水碳 酸钠,0.15%甲醛的溶液中显色至适度,倾去显色 液,加入固定/终止液(含30%乙醇,1O%冰乙酸). 终止显影.并固定5rain.双蒸水漂洗凝胶2次.将 凝胶转移到保鲜膜上保存,照像. 2002,18(1) 2结果 2.1PCR扩增产物凝胶电泳图谱以各组DNA 样品为模板,用昔氏肺孢子虫特异性的TS基因引 物作TS基因PCR扩增.产物经1.5%琼脂糖凝胶 电泳,结果显示正常对照组,双氢青蒿素10b~M/L 组,双氢青蒿素5OM/L组,青蒿琥酯100#M/L 组,喷他脒15,aM/L组均有扩增条带出现,约 400bp.而HepG一2细胞DNA和大鼠肺细胞DNA 组无特异性扩增条带,只有微弱的DNA拖影(图 1).经数字化凝胶成像分析仪作相对强度比测量. 双氢青蒿素10M/L组扩增产物强度占正常对照 组的81.3%.双氢青蒿素50?M/L组占正常对照组 的48.3%.青蒿琥酯1OOM/L组占正常对照组的 51.2%.喷他脒15”M/L组占正常对照组的47. 5% 置一圈1卡氏肺孢子虫Ts基因PCR产物电泳结果 FElectrophoresisresnltofDNAamplificationofBgene ofPeP M:DNA分子量标准(Marker,#SM0241—10) Lane1:正常对照Pc,Lane2:双氢青蒿幕Z0t,M/L组, Lane3:双氢青蒿索50t~M/L组,Lane4:青蒿琥酵 l00”M/L组.Lane5:喷他脒15rtM/L组,Lan.e6: HepG一2细胞DNA,Lane7:太鼠啸细胞DNA 以各组DNA样品为模板,用卡氏肺孢子虫特 异性的DHFR基因引物作DHFR基因PCR扩增, 产物经2%琼脂糖凝胶电泳,结果显示正常卡氏肺 孢子虫对照组,双氢青蒿素IOvtM/L组,双氢青蒿 素50FM/L组,青蒿琥酯100~tM/L组,喷他脒 15~M/L组均有扩增条带,约300bp.而HepG一2 细胞DNA和大鼠肺细胞DNA组无特异性扩增条 带,只有微弱的DNA拖影(图2).经数字化凝胶成 像分析仪作相对强度比测量,双氢青蒿素IO~M/L 组扩增产物强度占正常对照组的66.1%,双氢青蒿 素50”g/L组占正常对照组的25.9%,青蒿琥酯 2002.18(1)中国人兽共患病杂志 ChineseJournalofZoono~es 100~M/L组占正常对照组的28.5%.喷他脒 15t~M/L组占正常对照组的234%: O 30O一 图2卡氏肺孢子虫DIfFR基因PCR产物电濂结果 FiglElectrophoresisresultofDNAamplificationofDHlCR geneofPc M:DNA分子量标准(Marker,#SM0241—10) Lane1:正常对照Pc,Lqane2:双氢青蒿素10M/L组, Lane3:双氢青蒿素50M/L组.Lane4:青蒿琥酯 IOOvM/L组.L,lLrle5:喷他脒l5uM/L组,Lane6: HepG2细胞DNA.Lane7:大限肺细胞DNA 图3卡氏肺孢子虫DHFR基因SSCP电泳结果 FiSSCPresultofPcDHFRgene L锄e1:正常Pc对照组.Lane2:双氢青蒿素10gM/L 组.Lane3:双氢青蒿素50pM/L组.LdJle4:青篙琥酯 100/~M/L组.L,ane5:喷他脒15/~M/L组 22SSCP分析 DHFR基因电泳条带清晰可见,为2条.各组间 条带数量,位置相同(图3).经青蒿素衍生物作用 后的卡氏肺孢子虫DHFR基因迁移位置无变化. TS基因电泳条带2条清晰,正常对照组与喷他脒对 照组数量位置基本相似,双氢青蒿素组与青蒿琥酯 组电泳条带数量与正常对照相同,但第2条带位置 与正常对照有差异.提示该条带DNA有变 异(图4). 电濂结果 4SSCPre~altofn”ISgene LttDe1:正常Pc对照,LttDe2:双氢青蒿素IO~M/L 组.L~tne3:双氢青蒿素5OM/L组.Lqane4:青蒿琥酯 100/~M/L组.Lttne5:喷他脒15~M/L组 3讨论 卡氏肺孢子虫的”IS基因和DHFR基因是国外 研究得较多的基因.Schluger和Sepkowitz_|采用 的引物是根据人和大鼠源卡氏肺孢子虫共有的 DHFR编码基因的.卡氏肺孢子虫的DHFR 不与任何已知的真核或原核生物的DHFR同源.因 此该引物特异性很高.Mazars和01sson采用根据 大鼠源卡氏肺孢子虫胸腺嘧啶合成酶(“IS)基因部 分序列设计的引物.胸腺嘧啶核苷酸合成酶和二氢 叶酸还原酶是虫体中较重要的酶类,影响DNA的 合成.二氢叶酸还原酶催化二氢叶酸还原为N. N甲烯四氢叶酸,而N,N甲烯四氢叶酸作为甲基 供体.在胸腺嘧啶核苷酸合成酶催化下使dUMP转 化为dTMP.后者经磷酸激酶的作用,形成dTTP. 是合成DNA的原料.因此号氏肺孢子虫体内这2 种酶的基因如果经药物作用后受损可能会影响到其 DNA的合成,从而抑制其增殖. 聚合酶链反应一单链构象多态性(PCRsingle strandL’Onformationalpolymorphism,PCR—SSCP) 分析是一种DNA单链凝胶电泳技术.它根据形成 不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶 中的电泳迁移率变化来检测基因变异.相同长度的 DNA单链其碱基排列顺序不同,甚至单个碱基不 同,所形成的构象不同,电泳迁移率也不同j.这 项技术具有简便,快速,敏感和经济等特点.我们试 图将该技术用于观察卡氏肺孢子虫TS基因和 DHFR基因在青蒿素衍生物作用下基因变异并取得 初步结果. TS和DHFR基因的PCR反应(下转第81页) 羹 :|瓣懿_0 :I 一” 】E==|l??爨 2002,18(1)中国人兽共患病杂志 ChineseJournalofZoonoses81 印片标本;检查结果表明,两种大鼠相同肺叶所检获 R包囊和滋养体阳性率间均无显着性差异(P> 0.O5),同种大鼠不同肺叶间亦均无显着性差异(P >0.05),但右叶肺印片检出R虫体数量较重. 3讨论 SD大鼠和Wlstar大鼠均可用于动物模型的建 立.Wistar大鼠于1907年由美国Wistar研究所育 成,我国从日本和前苏联引进,是我国引进最早,使 用最广泛,数量最多的大鼠品种;SD大鼠于1925年 由美国SpragueDawley农场用Wistar大鼠培育而 成.本研究发现,使用免疫抑制剂后Wlstar大鼠比 SD大鼠更早发病死亡(19a/24d),且死亡的Wistar 大鼠比SD大鼠肺内查见虫体也更早(19d/28d, 29d/34d).从而表明SD大鼠比Wistar大鼠对呼吸 道疾病的抵抗力更强.郭俭等【认为sD大鼠比 Wistar大鼠早2,4周在肺组织查见较多滋养体和 包囊.本研究在相同的条件下作SD大鼠和Wistar 大鼠诱发PCP,未见两者存在明显差异.通常认为 卡氏肺孢子虫初次感染经空气传播,距气管较近的 大鼠右叶肺感染率较高,本文对两种大鼠各28只的 检查发现,大鼠不同肺叶间的感染率无显着性差异, 仅仅右叶肺虫体负荷较多. 大鼠感染R最早,最常见的部位是肺脏,病原 学检查常采用肺组织印片或BAIF沉淀物涂片染色 镜检,常用的染色方法有六亚甲基四胺银(GMS)染 色,甲苯胺蓝0(TBO)染色和Giemsa染色,前两种 染色方法可使Pc虫体显示出特殊的结构,易于辨 认,但操作较繁琐,所需时间较长,不适用于临床常 规检测;而Giemsa染色,虽然Pc包囊囊壁不着色, 但由于操作简单,染色所需时间短等优点,临床广为 接受.我们以Giemsa染色肺印片和BALF涂片,均 获满意结果,所以采用Giemsa染色法检查PC虫体 可作为临床常规检测方法.肺印片的阳性检出率比 BALF涂片高.其原因主要在于,BALF经生理盐水 稀释后,虫体的数量和密度比肺印片少,虫体的形态 也不及肺印片易于辨认;而且在进行支气管肺泡灌 洗时,虽然注入的生理盐水是定量的,但不同大鼠灌 洗的程度存在差异.回收的液体量也不等. 4参考文献 1ContiniC,Ma~xantoniS,Rc~aanlR,etalEvidenceofPneI??oc earinilincelllineeultur~infectedwithpexlpheralbloodrn咖nude cdhi~olatedfromAIDSpatientswP.cariniipnel耵]n?(J.J MedMic.1995,42(6):394 2r?ifN.AM.K~ullA.Ac.mp盯ofm~lifiedtotogl— cmdsogicst且i?imethodsforthe出脚sofPaeuraoey~tis ~inilpn目??rdaU].APMIS.1997.105(12):904 3得小莺,吴增强.张玉润卡氏肺孢子虫肺i蜒动橱模型的实验研究 ?中国寄生虫病防涪杂志,1997.10(3):201 4王庆林,刘启文.何明卡氏肺孢子虫感染的免疫谚断研究J] 中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1998,l6(4):260 5郭位,杨元清.伍嘉彤,等.卡氏肺孢子虫在大鼠肺内的发育其 引起的病理变化fj]中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2000.18(4): 247. 2001年6月12日收穑2001年9月lO日修回 (上接第93页)具有高度特异性,根据数字化凝胶成 像分析仪作相对强度比测量结果,可初步了解到,在 青蒿素衍生物作用于卡氏肺孢子虫的体外实验中, 经青蒿素衍生物作用后.卡氏肺孢子虫的TS, DHFR基因有明显减少.尤其是DHFR基因减少 幅度更大.这可能是药物使虫体死亡或抑制虫体生 长.我们进一步作SSCP分析发现DHFR基因无论 是青蒿素衍生物还是喷他脒用药前后的PCR产物 中均无明显改变.而TS基因的PCR扩增产物在 双氢青蒿素衍生物组则有一条带的电泳位置发生了 改变,提示卡氏肺孢子虫的TS基因在青蒿素衍生 物的作用下发生了变异.喷他脒对TS基因的SS CP和正常对照相同.提示喷他脒对TS基因可能无 明显作用.其抗卡氏肺孢子虫的机理可能与青蒿素 衍生物不同.TS基因所表达的胸腺嘧啶核苷酸合 成酶是卡氏肺孢子虫合成DNA不可缺少的酶之 一 .因此.卡氏肺孢子虫TS基因经青蒿素衍生物 作用后发生变异.可能是该类药物抑制卡氏肺孢子 虫增殖的机理之一.但基因变异是否为基因的关键 位点.且基因的复制到基因的表达是一个复杂的过 程.目前我们发现的青蒿素衍生物对TS基因的作 用是否会真正影响到基因的表达,从而影响胸腺嘧 啶核苷酸合成酶的量和活性,这一问还需在今后 的实验中进一步探讨. 4参考文献 l惋小毅,陈稚棠青蒿索衍生物抗卡氏肺包子虫体外作用的研究 .J]中华结核和呼吸杂志,2001.24:164 2.MsE.Odberg—Fe~utC,Dei一‰E.eta1.Palymorp~of thetSymidylate洲}Lasegeroffuoc口e~infifromdifferent hostsped瞄U]JEul~3’otMicrobM1995;42~26,32 3.Ata~rlC,LuJJ.JiBgB,et.Di?ofPnet?no口carln~pneu一 inAIDSpatientsbyu耐nger衄ech蛐川盯哪 spedln衄?JInteetD1995;172:1623~1626 4.SepK.ScblagerN,C~twi[标签:快照]