谷氨酸脱羧酶论文固定化谷氨酸脱羧酶的制备与酶学性质研究

谷氨酸脱羧酶固定化谷氨酸脱羧酶的制备与酶学性质研究 谷氨酸脱羧酶论文:固定化谷氨酸脱羧酶的制备与酶学性质研究 【中文摘要】Y-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,简称GABA)是哺乳动物神经系统的一种神经递质抑制剂,对人体具有镇静安神、促进睡眠、改善免疫功能等作用,在食品和医药领域具有广泛的应用价值,由生物方法制备的GABA已被我国卫生部列为“新资源食品”。生物体内的GABA由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,简称GAD)催化谷氨酸脱羧生成,因此GAD是GABA生物制备的关键酶。为了提高GABA生物制备方法的效率和竞争力,本文以利用固定化GAD进行GABA的生物制备为目标,分别采用凝胶包埋法和金属螯合方法进行了GAD的固定化,考察了固定化条件对固定化酶性能的影响,优化了固定化条件,测定了所得固定化酶的底物亲和强度、最适催化条件和操作稳定性等关键性质,为利用固定化GAD进行GABA的生物制备创造了条件。具体研究内容如下:对聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,简称PVA)-海藻酸钠(sodium alginate,简称SA)固定化GAD的条件进行了研究。分别考察了PVA浓度和SA浓度对凝胶颗粒直径、机械强度以及固定化后酶活力保留的影响;PVA和SA比例对固定化后酶活力保留的影响;PVA-SA与GAD酶液比例对固定化酶催化活力和酶活回收率的影响;以及CaCl2浓度对固定化后GAD酶活力的影响。研究表明,当PVA浓度为9%,SA浓度为2.5%,PVA:SA (W/W)为70:30,PVA-SA:GAD(W/V) 为6:1,CaCl2浓度为1%时能获得机械强度好,酶活回收率最高的固 定化GAD凝胶颗粒。在上述优化的条件下,考察了固定化GAD的各项 酶学性质,并与游离酶加以比较。同时,测定了固定化后GAD的表观动 力学参数,评估了PVA-SA包埋法固定化GAD的操作稳定性。研究表 明,GAD的最适催化温度与游离酶相同为50?;最适催化pH向碱性方 向略有改变为pH4.8;热稳定性最强的温度为45?,比游离酶高了 10?;酸碱稳定性最好的pH为5.2,在实验设定的pH范围内,固定化 GAD的稳定性大大高于游离酶;Km为13.6 mmol/L;连续催化7次以 后,固定化GAD酶活力仍然保持在初始值的87%左右,说明PVA-SA法 制备的固定化GAD凝胶颗粒操作稳定性好,具有很好的应用前景。利 用亲和层析介质Ni-NTA对GAD进行了固定化,并测定了固定化后的各 项酶学性质,动力学参数,考察了其操作稳定性。Ni-NTA亲和固定化 GAD的最佳投料浓度为0.6mg/mL;最适催化温度与游离酶相同为 50?;最适pH向碱性方向略有改变为pH4.8;酸碱稳定性最强的pH 为5.6,热稳定性最好的温度为35?;Km值为34.4mmol/L;重复使用 8次后,活力保持初始活力的75%。 【英文摘要】GAB A is an essential neurotransmitter inhibitor of mammal which has important medicinal value and has been named as “New resource food” by Ministry of Health. GAD is the key enzyme of synthesis of GABA in the organism, so it can be used for biosynthesis of GABA. In order to improve the efficiency and competitiveness of biosynthesis of GABA, in this work, we immobilized GAD in two different ways, and tried to find the best condition for immobilization of GAD. Finally, we studied the various properties of immobilized GAD including:optimum pH and temperature of immobilized GAD, kinetic constant, operation stability and so on, in order to synthetise GABA.Firstly, the optimum conditions for gel formation and GAD activity were studied, including:the effects of concentration of PVA and SA to diameter, mechanical strength, and GAD activity retention; the effects of PVA/SA ratio to GAD activity retention; the effects of PVA-SA/GAD ratio to GAD activity retention and activity recovery; the effects of concentration of CaCl2 to GAD activity retention. The study shows that the best condition is:concentrations of PVA and SA are 9% and 2.5%; PVA/SA ratio(W/W) is 70/30; PVA-SA/GAD ratio(W/V) is 6/1; concentration of CaCl2 is 1%. Then, zymologic characters and kinetic parameter of PVA-SA immobilized GAD were determined, and the operation stability was evaluated. The results of the investigation are:optimum pH and temperature of immobilized GAD is pH4.8 and 50?; the pH and thermal stability of GAD have remarkable improvement; Km is 13.6 mmol/L; the immobilized GAD keeps 87% value of initial activity after 7 cycles of reuse. All above prove the promising applications of PVA-SA entrapment GAD.Secondly, zymologic characters and kinetic parameter of Ni-NTA immobilized GAD were determined, and the operation stability was evaluated. In this method, the optimum concentration of GAD is 0.6 mg/mL; optimum pH and temperature of immobilized GAD is pH4.8 and 50?; GAD has the highest stability in 35?and pH 5.6; Immoblized GAD with Ni-NTA has the same affinity with free GAD; Km is 34.4 mmol/L; the immobilized GAD keeps 75% value of initial activity after 8 cycles of reuse. 【关键词】谷氨酸脱羧酶 γ-氨基丁酸 聚乙烯醇 海藻酸钠 固 定化 包埋 Ni-NTA 金属螯合 【英文关键词】GAD GABA PVA SA immobilized entrapment Ni-NTA metal-chelating 【目录】固定化谷氨酸脱羧酶的制备与酶学性质研究 致谢 5-6 摘要 6-8 Abstract 8-9 目录 10-13 第一章 文献综述 13-31 1.1 固定化酶技术 13-21 1.1.1 固定化酶技术概述 13 1.1.2 固定化酶方 法 13-19 1.1.3 固定化酶的性质 19-20 1.1.4 评价固 定化酶活性的指标 20-21 1.2 PVA凝胶固定化生物催化剂 21-25 1.2.1 PVA概述 21 1.2.2 PVA凝胶固定化生物催 化剂 21-23 1.2.3 PVA-SA凝胶固定化生物催化剂 23-25 1.3 γ-氨基丁酸 25-28 1.3.1 GABA性质 25-26 1.3.2 GABA生理功能 26-27 1.3.3 GABA制备方法 27-28 1.3.4 GABA的应用 28 1.4 谷氨酸脱羧酶及其固定化研究现状 28-29 1.4.1 谷氨酸脱羧酶的分布和生理功能 28-29 1.4.2 GAD固定化研究现状 29 1.5 本文主要内容及研究思路 29-31 第二章 PVA-SA凝胶包埋固定化谷氨酸脱羧酶的条件优化 31-49 2.1 引言 31 2.2 与方法 31-36 2.2.1 实验材料 31-32 2.2.2 实验仪器 32 2.2.3 实验方法 32-36 2.3 结果与讨论 36-47 2.3.1 PVA-SA凝胶珠的外观结构 36-37 2.3.2 PVA浓度对凝胶成球性的影响 37-38 2.3.3 PVA、SA浓度对凝胶珠直径的影响 38-39 2.3.4 PVA、SA浓度对凝胶珠机械强度的影响 39 2.3.5 PVA浓度对固定化GAD酶活力的影响 39-41 2.3.6 SA浓度对固定化GAD酶活力的影响 41-42 2.3.7 PVA与SA比例对固定化GAD酶活力的影响 42-43 2.3.8 PVA-SA与GAD比例对固定化GAD酶活力的影响 43-44 2.3.9 PVA-SA与GAD比例对GAD酶活回收率的影响 44-45 2.3.10 CaCl_2浓度对固定化GAD酶活力的影响 45-46 2.3.11 PVA-SA凝胶珠膨胀率 46-47 2.4 本章小结 47-49 第三章 PVA-SA凝胶固定化谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究 49-59 3.1 引言 49 3.2 材料与方法 49-50 3.2.1 实验材料 49 3.2.2 实验仪器 49-50 3.2.3 实验方法 50 3.3 结果与讨论 50-58 3.3.1 固定化对GAD最适pH的影响 50-51 3.3.2 固定化对GAD最适温度的影响 51-52 3.3.3 固定化对GAD热稳 定性的影响 52-53 3.3.4 固定化对GAD pH稳定性的影响 53-54 3.3.5 固定化对GAD与底物结合的影响 54-55 3.3.6 固定化酶的重复使用稳定性 55-58 3.4 本章小结 58-59 第四章 金属螯合固定化谷氨酸脱羧酶的研究 59-73 4.1 引言 59 4.2 材料与方法 59-62 4.2.1 实验材料 59-60 4.2.2 实验仪器 60 4.2.3 实验方法 60-62 4.3 结果与讨论 62-71 4.3.1 Ni-NTA纯化法的酶活回收率 62-64 4.3.2 GAD酶液浓度对于固定化的影响 64 4.3.3 固定化对GAD最适 pH的影响 64-65 4.3.4 固定化对GAD最适温度的影响 65-66 4.3.5 固定化对GAD pH稳定性的影响 66-67 4.3.6 固定化对GAD热稳定性的影响 67-68 4.3.7 固定化对GAD与底物结合的影响 68-69 4.3.8 固定化酶的重复使用稳定性 69-70 4.3.9 PVA-SA固定化GAD方法与Ni-NTA固定化GAD方法比较 70-71 4.4 本章小结 71-73 第五章 结论与展望 73-75 5.1 结论 73-74 5.2 展望 74-75 参考文 献 75-83 作者简介 83