雷洛昔芬对大鼠成骨细胞的增殖、分化和矿化的影响

雷洛昔芬对大鼠成骨细胞的增殖、分化和矿化的影响 雷洛昔芬对大鼠成骨细胞的增殖、分化和矿 化的影响 老年学与保缝2007年第13卷第4期Ge,?ialrHeahhCare,2007,Vo1.13.No.4 雷洛昔芬对大鼠成骨细胞的增殖,分化和矿化的影响 毕崇萍张绍芬金慰芳朱汉民 【摘要】目的初步探讨雷洛昔芬列成骨细胞骨形成作用机制.方法采用新生大鼠颅盖骨酶消化法体外培养 成骨胞,在培养液中加人不同浓度雷洛昔芬(0,10,,10,,10m.I/1.),在共条件下培养测定各项骨形成指标 (增殖测定,碱性磷酸酶活性定量和矿化结节形态计量.结果雷洛骨芬(10mogL组_羽l10mol/L组)的MTTALP 测试结果及矿化结节形态计量高于对照组,月.有统计学意义,P<O.05.结论雷洛昔芬能够促进大鼠颅盖骨成骨细 胞的增殖,分化及矿化,与雌激素作用类似 【关键词】雷洛什芬;成骨细胞;骨生成;颅骨;大鼠 [fI_l图分类号]R681.4[义献标识码]A[义章编号]1008—8296(2007)一04—0223—04 InfluenceofraloxifeBeonproliferation.differentiationandmineralizationof osteoblastsinratsB,Cf2D”— ping,ZHANGShao-[en,jiHWci_『l,q?,ZHUHat;一川 lDcpmtmentofGynecologyHuadongHospital,Fuda; [htiversit),,Shan@ai200040,ObstetlicsandGynecolog},HospitaloftheMedicalCentcrofFudanUniversit),,Shanghai 200017,?[nstittttcofRadiationMedicine,FudanmHversitF,Shanghai20003 2,Chitla 【Abstract】 0bjectiveToexploretheetfectsofl?aloxit~ne0nboneformationmechanism.MethodsOsteohlastswel?e isolatedfil)l11thecah,aliaofIleollalaIratsthroughtrypsinalld(genasedigestion.I)ifl?ea?entconcentrationsof”Ialoxifene(0,10, lIl0I/L,10,m0I/Lan(Ii0一 lnoI/L),veraddedinf0CuhIIren1edium.Proliferati0nwasassaverlhvMTT,afivitv0tALPwas nleasuredhy.PNPP(p-uitrophenylphosphatedisodium)allf]timmineralizedmatrixwasalsocalculated.ResultsMTT,ALP all([1uine~?alizedmad?ixWelesiguiticantlyhigherini?alexifene(Io-Ill{,lJ1 0,nml/[)gloupthanthosein?mtrolgn)up,while MTToiraloxifene(10?mol/L)groupwassimilartothatot?controlgroup(,)>0.05).ConclusionsSimilmto17—13estl?adio1. raloxifenehastheeffectsofstinmlatingproliferation,differeutiationalldmineralizationofcalvaria-derivedosteoblastsinrats. 【Keywords】Raloxifene;Osteohlasts;Osteogenesis;Skull;Rats 绝经后骨质疏松症患者进行雌激素替代疗法 (est1-ogenrel,lacementtherapy,ERT),骨量减少得到明显 抑制,骨折发生率明显降低….但随着美国妇女健康 启动(theWomen.SHeahhInitiative,WHI)等多项 大规模试验数据的公布,显示浸润性乳房癌,冠心病, 卒中和肺栓塞发病率因此增加[21,使医生及患者对 ERT有所顾虑.选择性雌激素受体涮节剂(selective estrogle(~e1)tm?m0dulators,SERM)因其具有雌激素 激动或拈抗双重作用的功能,引起人们的关注.其巾 尤以新一代SERM雷洛昔芬(aloxifene,RLX)用于防 治绝经后骨质疏松较为理想. 雷洛昔芬是一个非甾体苯并噻吩化合物,分子 式C28H27N04SHCL.其刘?骨和心血管系统具有类 雌激素作,对子宫内膜和乳腺增生有抗雌激素作 用.冈此,雷洛昔被认为是疗效显着,专为绝经后 妇女的防治骨质疏松性骨折的药物.雷洛昔芬多 作者位:200040I海市,复口大学附属华东医院虹J科(毕崇萍) 骨质疏松防治研究中心(朱汉民)200011海,复目大学妇产科 医院(张)200032上海,复『=_1人学放射医学研究所(金慰芳) 重预后临床研究(multipleOlHOO//lesofraloxitene evalualion,MORE)显示】:腰椎骨折的危险性降低 了30%,50%.与ERT相比,雷洛昔不增加子宫内 膜的厚度,不引起阴道;l;血,可显着降低浸润性乳腺 癌的危险(72%),且对血脂代谢有良好的作用.虽 然,雷洛昔芬已经较』泛地应用于骨质疏松症的治 疗,但此种化合物渊节骨代谢机制目前仍不甚明了. 本试验通过雷洛昔芬介导的大鼠颅盖骨来源的成骨 细胞体外培养,了解雷洛昔对成骨细胞体外培养 中骨形成的影响. 与方法 一 ,主要药物,试剂 1.药品雷洛昔芬原料(美礼来公司提供) 2.试剂 MEM(minimumessentialmedia)培养基fGIBICO 美国);小牛血清(newhorncalfSerHInNCS,GIBICO 美国);11型胶原酶(collagenase1ISIGMA美国); 老年医学与保健2007年第13卷第4期GiIi?Heahl1Care,2007,V 【ll_113.N0.4 胰蛋白酶(trypsin进口分装);戊二醛(glutaraldehyde, 上海);碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)染色 试剂盒(NBT/BCIP上海华美);溴化甲基噻唑基四唑 (methythiazolyltet,azoliumhromide,M?IT,进口分装): 对硝基苯磷酸二钠盐(4一nitrophenylphosphatedisodium saltPNPP,Fluka瑞士);二乙醇胺(diethanolamineDEA 上海化剂);对硝基苯酚(PNP上海);茜素红(alizarin refl进口分装);培养液(MEM,100IX/ml青霉素, 100IX/ml链霉素,10%NCSo 二,主要实验仪器和设备 CO,培养箱(Heraeus5060德国):倒置相差显 微镜(NikonTS100E1本);酶标测试仪(ELX一800 美国);恒温离心机(Heraeus德国):光学显微镜 (NikonE600Et本);形态计量软件(Image-ProPhlsIPP, 美国);单道可调移液器(2,201/10,10o1/100-1000 l,FINNPIPETI~芬兰);8道可调移液器(5O,300l, FINNPIPEYIE芬兰);培养板(96P_4/6weI1,NUNC丹麦); ?,实验步骤 I.细胞培养(新生大鼠酶消化法)新生sD大鼠 (24h以内)l0个,70%酒精中浸泡10min.去头顶皮 肤,切下头盖骨,将头盖骨置于PBS/D—Hanks液内. 剔除粘附的骨膜,血管等结缔组织,用PBS/D—Hanks 液清洗2次后将洗净的头盖骨剪成1Filmx1mmx lmm小片.将骨片移人5ml0.25%胰消化酶溶液20 lnin,弃消化液.随后,将骨片移人另一含0.1%?型 胶原酶溶液中,37~C震荡淌化分离细胞60minX2次. 合并两次消化液,将含细胞的消化液在1000r/min下 离心l0min,吸去上清液,沉淀的细胞团块用培养液 制成细胞悬液.计数后接种于培养瓶,置于5%二氧 化碳培养箱,37?下培养.24h左右换液一次,清除 未贴壁细胞,以后2—3tl换液一次. 2.细胞传代吸弃待传代培养瓶内培养液,缓冲 液清洗一次.加入消化酶37?下作刚2,3rain,吸弃. 残留消化酶继续作用至细胞脱离培养瓶壁.培养液吹 打分散细胞.细胞计数,根据所需密度(3X10/孑L) 分组接种于培养板. 3.本实验采用第二继代细胞,接种24h后川不 培养液(对照组仅加培养液,其他组加入不浓度 含药培养液)分组培养.(1)对照组;(2)雷洛营芬10 mol/L;(3)雷洛昔芬10一tool/L;(4)雷洛昔芬10mol/L. 4.测定指标及原理方法增殖测定r可直接反 映细胞的生长情况(M1Tr法),碱性磷酸酌一alkaline phosphatase,ALP)活性定量检测其活性可反映成骨细 胞的分化程度(PNPP法).矿化结节形成是成骨细胞 骨形成功能的最终形态表现,采用矿化结节形态计量 分析. 四,统计学处理采用SPSS10.0统计软件,数据 以?s表示,采用方差检验,P<O.05为差异有统计学 意义. 结果. 一 ,雷洛昔芬各组增殖值(M1Tr) 雷洛昔芬各组MTT测试结果均高于对照组,以 10M组值最高,其中(10M,10M)组M1-r测试结 果与对照组相比有统计学意义,P<O.05;雷洛昔芬组 (1oM)M1Tr测试结果与对照组比较无统计学意义, P>O.05.提示雷洛昔芬(10,M,10M)对成骨细胞的 增殖有促进作用,见表1及冈1. 表1M1_r测试结果(?)(n=l6) 一 046 基0.44 —0.42 弘0.40.36 謇0 .34 与对照比较P<0.05 0.3790.86 lIIl lI..If 对照组RAL10MRAL10MRAI10M 图1i同剂量需洛昔芬对成骨细胞增殖的影响 二,霄洛昔芬对成骨细胞分化的影响 雷洛昔芬各组ALP测试结果均较对照组增高,以 l0M组最高.1M,10M两组与对照组相比差异 有统计学意义,e<o.05.雷洛昔芬组(1oM)ALP~,0 试结果与对照组比较差异死统计学意义,P>O.O5.提 示雷洛昔芬(10M,10M)对成骨细胞的分化具有促 进作用,见表2及图2. 表2碱性磷酸酶测试结果(?)(=16) 与刘照纠l较P<O.05 老年学与保健2007ft.第13卷第4期Ger-lairHeahhCare,2007,V01.13.NfI.4 图2小同剂量需洛昔芬对成骨细胞分化的影响 ?,雷洛昔芬对成骨细胞体外矿化的影响 矿化结节形态计量显示,雷洛营芬各组均较对 照组增高,以l0M组最高,l0M,l0M组与对照 组比较有统计学意义,P<0.05;雷洛昔芬组(10M) q.-x~?照组比较无统计学意义.故雷洛昔芬在(10M, l0M)浓度下对成骨细胞有促进矿化作川,见表3及 图3 表3矿化形态计量结果(?)(『l=16l X?I?NtH比较P<0.05 0.14 0?1 姆0. o-a 【1.0 0.0 O.0 0 O.1250.129 0.O33 广]厂] II..1I 讨论 SERM是一类结构多样的化合物,与雌激素受体 (egtlogen-eceplol?,ER)有高度结合力,选择性作用于 不同靶组织的雌激素受体而表现为雌激素激动剂和 (或)拈抗剂的作川.由于不同SERM结构上的特点, 对各种受体的亲和性有所差异,从而在组织巾表现出 不同的生物效应.雷洛首芬被称为第二代SERM,并 且是第一个被批准用于预防和治疗绝经后骨质疏松 症的SERM类药物. 随着雷洛昔芬在临床愈来愈广泛地应用,对其细 胞及分子作机制的研究也在逐步深入.雷洛昔芬对 卵巢切除大鼠的骨质流失及已建立的低骨量模型,具 有与雌激素相同的作效果.大鼠的骨组织形态学也 证实雷洛昔芬对于去卵巢后防止松质骨吸收的作州 与雌激素相似J.以前认为雷洛昔芬只抑制骨吸收, 最新观点认为其对骨形成有刺激作川J,且对成骨细 胞有直接刺激作用,即促进成,目细胞的增殖,分化J. 本实验采川增殖测定反映细胞在增殖期的生长 情况,ALP测定反映成骨细胞的分化情7兕和成熟状 态.并观察矿化结节形成.结果显示雷洛昔芬(10M, l0M)组的MTT和ALP测定结果均高于对照组,提 示雷洛昔芬对成骨细胞的增殖和分化有促进作用.实 验数据中,雷洛昔芬对成骨细胞增殖的刺激作用与其 他学者报告相一致,对成骨细胞的促分化作州也有诸 多研究证明这一点1fl,91~ 本实验观察雷洛昔芬在成骨细胞体外培养中对 矿化的作用,在l0M,l0M浓度下成骨细胞的矿 化结节计量结果升高,与对照组相比差异有统计学意 义,提示雷洛昔芬对矿化有刺激作用,与既往雌激素 在体外培养实验中对成骨细胞矿化结果相似/7,Sl~ 值得一提的是雷洛昔芬在lM浓度下不论对成 骨细胞的增殖,分化,还是矿化均无刺激作州,即无调 节作用.临床试验也表明如在MORE实验中60m和 l20mg/d剂量对骨质疏松治疗效果相似,即并非随着 剂量增加疗效也同步增加,我们推测过高浓度不但无 益,甚至可能有相反的作川.因此我们应当注意选川 达到最佳效果的合适剂量. 既往大量体外培养实验证实雌激素显着促进成 骨细胞的增殖【9l,促进成熟成骨细胞标志物I型胶原 蛋和碱性磷酸酶分泌19-I21,骨钙素的表达,并增进 骨基质的矿化.雌激素受体拈抗剂可阻断其作用0, 这与本实验中雷洛营芬对成骨细胞的作川相似,提 示雌激素与雷洛昔芬对骨的作用可能是通过相同的 ER作J}L}{机制.同样有实验证实,加入雌激素拈抗剂 ICI164384后雷洛昔芬促成骨细胞的增殖作用被阻 断.综上所述.我们认为雷洛昔芬通过与雌激素相 似的ER受体作用机制,而产生一系列对骨形成的促 进作川. 已经证实ER存在于成骨细胞和破骨细胞”“,进 一 步实验也显示成骨细胞上存在ER及ERB114-161; 近期多项体外实验结果提示雷洛昔芬对于绝经后骨 质疏松症可能与雌激素有着不完全一致的作J}L}{机理, 推测与雌激素受体调节有关.虽然雌激素受体及 8对l7—8雌二醇的传递活性与雷洛昔芬在典型雌激 素受体应答上相似,但17一B雌二醇活化ER时 88642786 mn v)眯姆薹一墙鼬鲑潜鬣 学与保~2007年第13卷第amGemiIi?HeallhCare?2007,VoI.13.N4 抑制ER13的转录I171,而雷洛昔芬既是ER部分激动 剂又是ER13强力转录激活剂.可见雷洛昔芬与17—13 雌二醇在雌激素受体同一配体上的结合机理和亲和 力以及凶雌激素诱导而引起的结构改变是不同的,此 配体一受体复合物微妙的结构差异导致了最终转录效. 应的不同IIgl. 我们的体外实验以成骨细胞为着眼点,观察了雷 洛昔芬对成骨细胞的一系列作用,为以后的研究提供9 参考依据.雷洛昔芬在体内对于骨形成和骨吸收的调 节机制要复杂得多,除了作用于成骨细胞外,对破骨 细胞也有重要作用.如能建立成骨细胞和破骨细胞的… 共同培养体系.并进行体内实验,将有助于对雷洛昔 芬作用机制的进一步了解,而对雌激素受体的研究将.. 是解释SERM作用机制的钥匙. 诸多临床已经证实雌激素和雷洛昔芬对骨 质疏松症有明确的治疗效应,而新一代的SERM雷洛12 昔芬是治疗绝经后骨质疏松症的理想药物. 4 6 226 参考文献 EttiiigerB.GenalitHK.(:aliii(:E.LIJIg--tel?ntestlf,g1】re|llal:enleiIt thelapypreventshonelassandfi?actures.ArlilI11telnMed.I985. 102:3J9,324. Writiilg(;l?lliIll11.tile~rllllleli?Healtlilliitiathhivestigatals.Risks andhenefilsofesllogenplusprogeslinhiheahh~rposlmenopausal ll(inlc,n.JAMA.2002,288:32I-333. Ettlillgel”BBlot-kDM.MitlakBH.ela1.BedntqioliofVeltelll?al fi?actu,erjsk;11poSlelenol~ausall<VOillenwilhosteopo,osistreated niIhJ.u1.xifene:results17.m3-yealHrand,anizeddiiilealtria1. MnlliIlieOiill:onlesofRal,lxifelieErahiati(ili(M()RE)ilivesligatlll?s. JAMA,1999.637-645. EvallSGL.BryantHU.MageeDE,ela1.Ra1.xifeneinhillliion llOlleIIil?iiOVei?alldevent.?ifilltheicalicelhllisbonelossiiialhlh ovarieetnmlzedratswitheslablishedoslenpenis.Endnt?iil~nlng), I996.1I37:4I39-4144. TaraiitaA.BranlaM.TellA.eta1.TIieselel?liveestl?~lgeilmrelll,ll. inodulatoi?raloxi|ken1egulalesOSte.Of:lastandosieoblaslactivityin vlil~1.Bllne.2002.30:368-376. Vielet:kV,(;rth,dkel(:,BlasllikeS,ela1.Ralaifeliecon{;ililelltly sliianlatesosleoprotegelinandinhihitsinlellellkiil一6productionhy IllilIlaliIi?ahel!ulal~lsieablasls.ClioEildo(:rin(ilMelab.2003.88: 4 5 8 4206-42l3. WatersKM.RickardDJ.1liggsBL.eta1.Estrogenreglllation olhllillanosleohlaslfiillclini,isdelerminedhyIhestagenf tliftereliliationalIdtheestl”„IgeiIreceIIIo1?isiifiIrln. Jcellbioehem, 2001.83:448,462. ChangH,linTY,JinWF,eta1.Mnd.1alionofisoflavnnestill holle—n,ld,iletill?matioliilll?alealvarialisteoblastsillvitro.Bi0med EnvironSet.2003.I6:83,89. ChenFP,LeeN,WangKC,ela1.Effeclofesll?ngenandla. 25(OH)2一VitD;(illtileactivityalidgrowthoflitinlanprimary osteoblast—likecellsinvitro.Fertilsteril.2002,77:1038—1043. 程志安,吴燕峰,曾志刃,等.健骨--{ill;it,含药血消对人成骨 细胞增殖及细胞周期的影响.巾国巾西医结合杂志,2002, 22:I29,I32. tfnlzel?G,E1.hornTA,MazeskaKJ,ela1.Estrogenregtilalinnof gr~ltvibandalkalinephosldlataseexpressi~mbycultiu?e~lhllman hoitenlalTOWstrnmalcells.JOrthopRes.2002,20:28I,288 QuQ.Pelala-HeapeM.Ka[I,?llieI1A,eln1Estl?ogeilenhanced dit|erenlialionnf~lsteolllastsii?lnlflllSeha,leinaITOWCiillnreBone, J998.22:20J,2()9. Eriksel~EF,ColvaldDS,BergNJ,ela1.idel~ceofeIngen l?ecelitorsiIInnl?nlalIillnlallosteahlast—likecellsSeienee.1988. 24I:84,86. ManroeDG,JohnseliSA.SithramaillainM.eli11MlJIual alltagoilisnlestrogelil?:ellhllsalpliaandhetaalzdtheir prefeiTedil~teractionswithsteroidreceptorcoactivatorsinhuman nslenl+lasliccelllilies.JEndnc,?innl,2003.176:349—357. ~rii.eiiKM,ChalinlaliE?~.allsA,Z!iangXW.Osteoblastdifferenliation inflliencesalldrogeilandeslrogenrecepf0r—alphaandbeta expressioii.JEadociiilo1.2002.I975:683—694. B~lluielyeE.AilhiliJE.Differei~iialeXl~re?ssionI,fsIl?ogeli receplor-ielaledreceptoralphaandbelainostenl~laslsinvivaand iavitro.JBoneMliterRes.2002.I7:I392—14O0. 杨欣,郑淑钵.选择性雌激索受体调节剂雷济许芬的临床 研究进展.中华妇产科杂志,2003,38:254—256. O,i?eseTA,SlukaJP,BryanlHU,eln1.Moleelliardelermlnanlsof fissileselectivityinesll?ligeiii?elsclltliIillll(1ulators.Pl?oeNatlAcad SetJJSA.I997.94:I4105一I4I10. (收稿:2007—05—24) 作者简介毕崇萍女1971ff-~.I99s年毕业于上海医 科大学临床医学系,2005年1月获复_?大学医学院临床医学硕士学 位.现为复旦大学附屈华东医院妇科主治师