负载htert复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

负载htert复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定 负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定 负载hTERT复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定 Package and identification of replicationdeficient rebinant adenovirus expression vector of hTERT 【Abstract】 AIM: To construct a replicationdeficient rebinant adenovirus expression vector of hTERT containing adenoviral genome. The adenovirus expression vector as then obtained and identified by infection test, electron microscopic observation and PCR coamplification. RESULTS: After purification and concintration, the titer of AdhTERT reached 5×1012 pfu/L. Virus particles could be found in HEK 293 cells under transmission electron microscope. Both adenovirus and hTERT special fragments could be amplified from AdhTERT by PCR, hereas hTERT special fragment could not be amplified from the control. CONCLUSION: The replicationdeficient rebinant adenovirus expression vector of hTERT is successfully constructed. 【Keyords】 human telomerase reverse transcriptase; adenovirus expression vector 【摘要】 目的: 构建负载人端粒酶逆转录酶Mr 127 000，包含1132 个氨基酸，其基因位于5号染色体短臂的最末端(5p15.33)，在90% 以上的人类肿瘤中高表达，而正常成熟组织中则基本没有表达,1,， 因而hTERT是一很有前景的广谱、特异的抗肿瘤治疗靶点. 腺病毒载 体系统具有宿主范围广、感染率高、包装容量大、繁殖滴度高、不发 生整合及安全性好、性质稳定、载体制备较容易等特点, 目前已成为 继逆转录病毒载体后被广泛应用的载体系统,2,，可用作hTERT的异 位表达工具. 我们通过构建hTERT腺病毒表达载体，为进一步研究以 hTERT为靶点的肿瘤免疫治疗奠定基础. 1材料和方法 1.1材料 负载hTERT基因的正义复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pDC315shTERT由 本室构建保存,3,;腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1,3Cre和转化有腺病毒E1区基因的包装细胞HEK 293均由第三军医大学全军免疫学研究所邹强博士惠赠;大肠杆菌DH5α由本室保存. Hind?, BamH I, Taq DNA聚合酶、dNTP, Plasmid Purification Kit ; DGL2000 DNA Marker ;质粒DNA小量快速抽提kit ;脂质体DOTAP ; 高糖DMEM ; 胎牛血清; 酵母提取物及胰蛋白胨; 低溶点琼脂糖; 氨苄青霉素. hTERT的PCR引物为P1:5′ CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA 3′,P2: 5′GGATGAAGCGGAGTCTGGA 3′，腺病毒E2b区引物(860 bp)为P3: 5′TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG 3′, P4:5′CATCTGAACTCAAAGCGTGG 3′,均由上海生物公司合成并纯化，纯度达99.5%. AdLacZ空病毒:克隆有β半乳糖苷酶(βgal)基因LacZ，由西南医院心内科唐兵博士惠赠. 1.2方法 1.2.1负载hTERT的复制缺陷型腺病毒的包装脂质体介导 pDC315hTERT和pBHGloXΔE1,3Cre参照DOTAP使用的方法转染HEK293细胞10,12 d可出现空斑，仔细挑取5个空斑，用少量无菌PBS溶液悬浮后，分别装管冻存于-70?. 将HEK293细胞传入6孔板，细胞70%融合时用于扩增病毒;将挑取的空斑溶液反复冻融3次，低速离心，取上清感染HEK 293细胞;按0.5 mL上清液，0.5 mL DMEM培养液加入6孔板中的HEK 293细胞中，37?培养1 h，其间每15 min摇动培养板1次，1 h后再加入2 mL培养液，继续培养,同时设立阴性转染对照;培养3,5 d后，用空斑上清液转染的HEK293细胞出现细胞病变效应(cytopathic effect, CPE), 而阴性对照组细胞无CPE;收集出现CPE的HEK293细胞，于无菌EP管中以1500 g室温下离心5 min，上清冻存于-70?，用于再感染HEK 293细胞，细胞沉淀用适量无菌PBS液吹散后冻存于-70?. 1.2.2AdhTERT的大量扩增、纯化及滴度测定HEK 293细胞传代于250 mL培养瓶中，细胞80,融合时，加病毒上清5 mL培养1 h，其间每10,15 min摇动培养瓶1次，使其均匀感染，1 h后补加新鲜培养液10 mL，继续培养3,5 d，当细胞出现完全CPE时，收集病变细胞，连同培养液一起移入无菌离心管，室温下以1500 g离心5 min，-70? 分别保存上清及细胞，分别用于再感染和收集高滴度病毒. 重复多次即可获得内含大量病毒的HEK 293细胞. 将收集的病变HEK 293细胞冻融3次，破碎细胞，释放病毒，室温下2500 g离心5 min，去除细胞碎片. 病毒上清液用0.22 μm滤膜过滤除菌，然后将除菌后的病毒上清叠加于无菌梯度氯化铯(CsCl)溶液上层(0.5 mL，比重1.5 kg/L;3.0 mL，1.35 kg/L;3.0 mL，1.25 kg/L)，10?, 150 000 g离心1 h后在1.25 kg/L和1.35 kg/L CsCl溶液间可见灰白色病毒带，将病毒带吸出并与比重为1.35 kg/L的CsCl溶液混和，以4?, 150 000 g离心18 h，留取病毒液，4?避光透析(10 mmol/L TrisCl pH 7.5;1 mmol/L MgCl2;100 mL/L甘油) 24 h，收集病毒液于无菌离心管中，取少许检测病毒滴度，余置-70?冻存备用. 24孔培养板每孔接入1×105 HEK 293细胞，培养24 h，取病毒转染液0.2 mL加PBS至总量2 mL，混匀后作10×倍比稀释至第6管，每个稀释度设3孔，加入不同稀释度病毒液0.2 mL，培养1 h，其间每10,15 min摇动1次培养板，1 h后补加培养液1.5 mL，继续培养36,48 h，观察细胞病变情况. 取近100%出现CPE的稀释度，按下列公式计算病毒滴度: nfu/L=?0.2 mL. 1.2.3AdhTERT的鉴定用冻存的腺病毒载体感染70%,80%融合的HEK 293细胞,37?培养2,3 d，观察HEK 293有无CPE出现. 用PBS作空白对照. 用冻存的腺病毒载体感染HEK 293细胞,37?培养2,3 d后,HEK 293细胞出现CPE.将HEK 293细胞收获,制作电镜标本,透射电镜下观测细胞内有无病毒样颗粒形成. 用PBS作空白对照. 取纯化的病毒200 μL于EP管内，沸水煮10 min，之后直接取5 μL用于PCR的DNA模板. 采用插入的hTERT基因特有引物P1 P2和腺病毒载体特有引物P3 P4,进行双引物PCR鉴定.使用PCR Master进行PCR扩增，模板DNA加入量为5 μL，上下游引物各加1 μL，反应体系为20 μL. 分别扩增腺病毒及端粒酶基因. 反应条件为94? 3 min，94? 1 min，53? 1 min，68? 1 min，40个循环，68?延伸7 min，4?保存. 电泳后同时出现腺病毒基因和端粒酶基因的特异性扩增条带作为阳性判断. 用AdLacZ作对照. 2结果 含病毒的细胞冻融液离心去细胞碎片并经梯度CsCl低温超速离心 纯化后,得到病毒液5 mL. 采用倍比稀释法测定了AdhTERT的滴度， 经计算所得病毒滴度为5×1012 pfu/L.