牡蛎过敏原Crag 1的二级结构及其B细胞和T细胞表位分析

牡蛎过敏原Crag 1的二级结构及其B细胞和T细胞表位 [摘要] 目的 分析牡蛎过敏原Cra g 1的二级结构及其B、T细胞表位，为探索基于抗原表位的免疫治疗奠定基础。 方法 从Uniprot数据库中获得牡蛎过敏原Cra g 1的氨基酸序列，通过DNA Star Protean软件，采用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析其二级结构;采用Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法、Emini法、Jameson-Wolf法综合分析Cra g 1主要的B细胞抗原表位。使用SYFPEITHI和NetMHC-?在线网站分析T细胞抗原表位。 结果 牡蛎过敏原Cra g 1的二级结构主要为α-螺旋，其B细胞表位接近覆盖Cra g 1氨基酸全序列;而T细胞优势表位位于第89,103、108,122、129,143位肽段。 结论 本研究分析牡蛎过敏原Cra g 1的B、T细胞优势表位，为日后Cra g 1的基础免疫学研究，如疫苗的研制、诊断试剂的制备和其抗原性改造等提供了理论依据。 [关键词] 牡蛎过敏原;Cra g 1;二级结构;B细胞表位;T细胞表位 [中图分类号] R392.8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2013)07(a)-0012-05 现今，食物导致过敏疾病的发病率日益增高，给人们健康造成很大的威胁，其中对水产品过敏的人群比重相当大。甲壳类水产食品是八类常见食物过敏原之一[1]，所以对于海鲜产品过敏原的研究主要在指向于甲壳类动物过敏原，但海鲜水产品中软体动物也能引起过敏反应[2]。据研究报道，甲壳类动物与软体动物具有交叉过敏原[3-5]，但是关于软体动物过敏原的研究却远少于甲壳类动物的过敏原。牡蛎，软体动物类中最受欢迎的食物，在日本和世界其他沿海国家都是十分重要的海鲜食品。牡蛎不仅具有食用价值，而且具有较高的药用价值，同时是我国首批列为药食同源的保健疗效食品之一。但是作为保健品的牡蛎，却同时是过敏性食品之一，它可引起各种超敏反应症状，累及皮肤、呼吸道和胃肠道，牡蛎的食用安全性令人担忧。因此，开展对牡蛎过敏原的研究显得极具现实意义。本研究着重分析软体动物过敏原——牡蛎的高亲和力表位，为进一步软体动物过敏原研究开启一扇重要之门，为表位改造，降低其过敏原性提供参考，也为目前治疗开发出新策略。 牡蛎属于双壳类软体动物，在胃液中具有一定的耐消化性[6]，这可能是导致牡蛎致敏的原因之一。牡蛎的主要过敏原为Cra g 1，其性质为原肌球蛋白[7]。牡蛎能引起人致敏的前提是它具有抗原表位。抗原表位是过敏原抗原性的基础，是抗原分子中抗原特异性的特殊化学基团，也是TCR/BCR和抗体特异结合的基本单位。分析B、T细胞表位，为疾病诊断、抗原表位的定点突变降低免疫原性、单克隆抗体的制备及表位疫苗的开发等打下基础。所以，本文拟采用生物信息学分析软件和互联网络服务器，分析牡蛎过敏原Cra g 1的二级结构和B、T细胞表位，为日后的科研开展提供理论指导。 1 材料与方法 1.1 Cra g 1 的氨基酸序列 牡蛎主要过敏原Cra g 1 在Uniprot数据库中登录号为:Q96WY0。Cra g 1共有233个氨基酸，使用DNAStar软件中EditSeq模块估计分子量为:26.87 kD。Cra g 1氨基酸序列如下:NSARGFDTVNEKYQECQTKMEEAEKTASEAEQEIQ SLNRRIQLLEEDMERSEERLQTATEKLEEASK AADESERNRKVLENLNNASEERTDVLEKQLTEAKLIAEEADKKYDEAA RKLAITEVDLERAEARLEAAEAKVLELEEELKVVGNNM KSLEISEQEASQREDSYEETIRDLTQRLKDAE NRATEA ERTV SKLQKEVDRLEDELLAEKERYKAISDELDQTFAELAGY。 1.2 Cra g 1的二级结构分析 应用DNAStar软件提供的Protean模块，采用其中的Garnier-Robson[8]方法和Chou-Fasman[9]方法分析Cra g 1的二级结构。 1.3 Cra g 1的B细胞抗原表位分析 使用DNAStar软件中Protean模块进行B细胞抗原表位的分析。采用Kyte-Doolittle[10] 法分析Cra g 1的亲水区;采用Karplus-Schulz[11]法分析Cra g 1骨架区的柔韧性;采用Emini[12]法分析Cra g 1中特定区域位于蛋白表面的可及性;采用Jameson-Wolf[13]法分析Cra g 1的抗原性指数。最后综合以上4项得出Cra g 1主要的B细胞抗原表位。 1.4 Cra g 1的T细胞抗原表位分析 使用SYFPEITHI[14]在线分析软件()和NetMHC-?[15]在线分析软件() 分析出Cra g 1的T细胞抗原表位。在SYFPEITHI网站中，将Cra g 1的氨基酸序列输入到这网址的分析模块中，MHC type选择最常见的HLA-DR基因型，氨基酸残基长度参数控制在15 mer，若得分超过25分则认为是与MHC-?类分子结合力较强的优势T细胞表位[16]。应用NetMHC-?软件以相同的条件进行分析，若亲和力少于50 nmol/L则认为是具有强MHC-?结合能力的T细胞表位[17]。综合两种软件结果，获得理想的T细胞表位。 1.5 Cra g 1交叉反应分析 在Uniprot数据库中Blast搜索与牡蛎过敏原Cra g 1同源性在80%以上的氨基酸序列，使用ClustalX 1.83软件进行同源性比对，并用Mega 4.1软件中的N-J法做出系统进化树。 2 结果 2.1 Cra g 1的二级结构 结果如图1，两种方法分析结果均显示α-螺旋结构在Cra g 1二级结构中占据绝对优势的地位，其中，Chou-Fasman法分析中Cra g 1的N端有仅小量的β-折叠区段和转角区域，而β-折叠区段在Garnier-Robson方法分析出的结果是不存在的。Cra g 1的二级结构主要为α-螺旋结构。 2.2 Cra g 1的B细胞表位分析 2.2.1 Cra g 1的亲水性分析 利用Kyte-Doolittle方法分析Cra g 1过敏原蛋白的亲水性，结果显示存在众多的亲水性区域(图2中显示?0的区域)，均匀分布于整个Cra g 1氨基酸序列，提示Cra g 1暴露于表面的概率很高，是亲水性的蛋白(图2)。 2.2.2 Cra g 1的柔韧性分析 利用Karplus-Schulz方法分析Cra g 1 的柔韧性，Cra g 1过敏原蛋白骨架区含有较多的柔韧性区域，提示该蛋白肽段的柔韧性较大，发生扭曲、折叠的概率很高，容易与抗体在空间上产生结合，形成表位的可能性较大(图3)。 2.2.3 Cra g 1的表面可及性分析 利用Emini方法进行Cra g 1的表面可及性分析结果显示，氨基酸呈现在表面可及性最大的区域(图4显示?1的区域)，主要富集在两大块:8,114、160,223区域，接近分布于整个Cra g 1氨基酸区域，提示整个氨基酸序列呈现在表面可能性都高(图4)。 2.2.4 Cra g 1的抗原性指数分析 利用Jameson-Wolf方法分析结果显示，抗原指数?0的区域覆盖整个Cra g 1氨基酸区域，Cra g 1整体抗原指数较高，B细胞表位覆盖Cra g 1氨基酸全序列(图5)。 2.2.5 Cra g 1的B细胞表位综合分析 综合以上4种(“2.2.1”,“2.2.4”项下)针对B细胞表位分析的结果，都反映出Cra g 1过敏原的B表位覆盖高，抗原性强。Cra g 1没有显示出有特异的优势B细胞表位，其B细胞表位可覆盖其整个蛋白区域。 2.3 Cra g 1的T细胞表位分析 2.3.1 SYFPEITHI分析结果 用SYFPEITHI网站进行分析T细胞表位，结果见表1。Cra g 1的潜在T细胞表位优势肽段分别位于第108,122位(DKKYDEAARKLAITE)、第41,55位(IQLLEEDMERSEERL)、第31,45位(EQEIQSL NRRIQLLE)、第96,110位 (QLTEAKLIAEEADKK)及第129,143位(EARLEAAEAKVLELE)等。 2.3.2 NetMHC-?分析结果 用NetMHC-?网站进行分析T细胞表位，结果见表2。Cra g 1潜在的T细胞表位为第89,103位(RTDVLEKQLTEAKLI)、第90,104位(TDVLEKQLTEAKLIA)、第75,89位(NRKVLENLNNASEER)、第129,143位(EARLEAAEAKVLELE)及第36,50位(SLNRRIQLLEEDMER)。 2.3.3 Cra g 1的T细胞表位综合分析 综合两种T细胞表位分析结果，发现第129,143位(EARLEAAEAKVLELE)肽段可同时被两方法分析出，是最有潜质的优势T细胞表位。另外，第108,122位(DKKYDEAARKLAITE)和第89,103位(RTDVLEKQLTEAKLI)也是潜在的优势T细胞表位，其分别为SYFPEITHI和NetMHC-?在线网站分析后得分第1位的T细胞表位。 2.4 Cra g 1交叉反应分析 根据Uniprot中的Blast软件搜索结果显示，牡蛎(crassostrea gigas)过敏原Cra g 1与双脐螺(biomphalaria glabrata)、驴耳鲍螺(haliotis asinina)、盘鲍(haliotis discus discus)、散大蜗牛(helix aspersa)的同源蛋白序列一致性都高达81%，与杂色鲍(haliotis diversicolor)、章鱼(octopus vulgaris)的达到80%，这些同源蛋白均为属于原肌球蛋白。从图6的系统进化树可以看到，Cra g 1与其他软体类动物的原肌球蛋白亲缘性关系稍远一些，但序列高度相似，在112,138、141,178位有保守区(图7中黑色框)。值得注意的是，在结果“2.3”中分析到的Cra g 1优势T细胞表位——第129,143位(图7中绿色部分)位于两个保守区中，与其他物种的原肌球蛋白仅有2个氨基酸的差异。 3 讨论 牡蛎分布于温带和热带各大洋沿岸水域，其总产量在贝类中居首位。牡蛎是我国四大养殖贝类之一，生产和消费量都占海鲜产品的前列，在广东、广西、福建、浙江、台湾等沿海地区人们都食用牡蛎。牡蛎营养价值相当高，蛋白质氨基酸组成完善，而且婴幼儿所需的组氨酸和精氨酸含量高，矿物质和微量元素含量丰富[18]，加上肉味道鲜美，所以牡蛎一直深受人们的喜爱。近年来，牡蛎过敏的情况日渐上升，使人们对牡蛎回避三分。为保证这一优质的海洋食品能继续发挥它的生物学效能，也为牡蛎过敏患者的脱敏治疗带来新曙光，本文针对牡蛎过敏原的致敏作用部位进行分析，为后续开发出低过敏性牡蛎产品，提供参考依据。 现今对于牡蛎过敏原——原肌球蛋白的氨基酸序列、生化特性已经清楚，但是其引起过敏反应的表位学研究相对欠缺。抗原表位是存在于抗原分子表面、决定抗原特异性的特殊化学基团，是抗原分子和TCR、BCR及抗体特异性结合的部位。抗原产生特异性IgE或者其他免疫反应时需要抗原特异性的T细胞的参与，但T细胞不能识别游离的抗原，只能识别由MHC递呈的抗原。外源性的过敏原需要MHC-?分子结合后提呈到抗原提呈细胞(APC)表面。所以关于抗原与MHC-?分子的能力是过敏原抗原性研究的重点，能在一定程度上反映抗原诱发免疫应答能力的高低。另外B细胞抗原表位的地位也不容忽视，因为B细胞可以通过BCR捕获抗原和行使APC的功能活化T细胞，活化的T细胞反过来也可以激活B细胞产生抗体[19]。所以，B、T细胞表位研究需要共同开展，而且最理想的抗原表位是可以包括B细胞和T细胞表位序列。 关于B细胞表位的分析，现在已有多种方法，大多为联合多个蛋白质结构分析方法，主要参数有二级结构、亲水性、表面可及性、柔韧性及抗原性指数等。本文采用多参数进行B表位的综合分析，借此提高分析结果的准确性和特异性。α-螺旋和β-折叠结构规则，结构中的化学键键能较高，主要起结构稳定的作用，一般不易形成表位，而转角区域或无规则卷曲结构比较松散，易于形变，结构突出，多位于蛋白质分子表面，利用与抗体结合，多数为候选抗原表位区域。本文分析出的Cra g 1过敏原的二级结构主要为α-螺旋结构，根据Cra g 1性质为原肌球蛋白，后者为典型的α-螺旋结 构，此二级结构与之前的文献报道相吻合[20]。但Cra g 1为α-螺旋结构，本该不易形成抗原表位，但是实际上牡蛎过敏原——原肌球蛋白很普遍且具有强致敏性，而且本文的B细胞表位分析也反映其B表位覆盖高，抗原性强。所以其中存在一定的矛盾，可能仅从二级结构对抗原表位进行分析得到的结果并不一定完全准确。蛋白质的亲水性区域一般暴露于蛋白的表面，因此，这些区段很可能成为抗原表位。柔韧性大的区域较易发生扭曲，有利于其与抗体的嵌合，所以是成为抗原表位的可能区域。表面可及性大的区域表示其中的氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性较大。抗原性指数可直观表示抗原性大小，是根据抗原的连续位点和氨基酸进行统计分析得出的抗原性强度。从DNAStar-Protean软件分析出的结果，Cra g 1的B细胞表位可覆盖其整个氨基酸序列，所以B细胞优势表位分析效果并不理想，对于Cra g 1的B细胞表位开展后续的基础免疫研究指导性不强。 针对T细胞表位的分析，使用的是SYFPEITHI和NetMHC-?在线软件。SYFPEITHI网址能分析出MHC分子结合T细胞表位能力，其基本原理是基于已知的能和MHC分子结合的短肽建立的数据库，将未知的抗原氨基酸序列输入网站，便可搜索与其匹配的潜在肽段，可以进行T细胞表位的分析。而NetMHC-?是基于矩阵法计算，假定表位多肽与MHC分子结合的过程中，各氨基酸残基的作用相对独立并可简单的加和，并以各肽链加和结果来判定肽段分子与MHC-?类分子的亲和力。通过氨基酸序列对MHC-?类分子贡献的平均值，分析出抗原性较高的位点。综合两种软件的结果发现，优势的T细胞表位为第129,143位肽段。另外，还有第108,122位(DKKYDEAARKLAITE)和第89,103位(RTDVLEKQLTEAKLI)肽段。日本研究者Ishikawa等[21]在1997年曾通过随机酶切Cra g 1的蛋白片段并与对牡蛎过敏的患者血清进行Elisa鉴定，最后发现IgE结合表位为第92,105肽段(IQLLEEDMERSEER)，这与本文分析出的T细胞表位第89,103位肽段近乎一致，所以NetMHC-?分析出的T细胞表位具有一定的可靠性，也强烈暗示了第89,103位(RTDVLEKQLTEAKLI)肽段T细胞表位在牡蛎致敏的机制中起到了关键性的作用，往后建议对这一表位进行更加详细的分析和开展表位改造制作低效价变应原。Ishikawa等[21]的试验是酶切Cra g 1蛋白片段，未实现全部分析Cra g 1的表位，所以本文分析出的另外两个T细胞优势表位:第129,143肽段和第108,122位肽段，仍具有指导性作用，但需要日后进行血清学反应等初步验证，增加结果的可靠性。另外，Ishikawa等[21]试验证明，变性的Cra g 1仍能结合对牡蛎过敏患者的血清IgE，说明Cra g 1的过敏原性不是来自构象、非连续性表位而是来自于线性、连续性表位。这也解析了为什么Cra g 1经过胃液消化后仍具有致敏性。 相似的序列的蛋白可能具有相似的功能，即过敏原之间同源性越高，就表示它们之间交叉反应的概率越高。而且同源性食物过敏原的表位区域相似度很高，是造成食物过敏原之间频繁发生交叉反应的原因。本研究发现牡蛎过敏原(Cra g 1)与其他6种软体动物(双脐螺、驴耳鲍螺、盘鲍、散大蜗牛、杂色鲍、章鱼)的过敏原同源性可高达80%以上，都为原肌球蛋白，它们之间存在两个保守区(第112,138、141,178位氨基酸)。FAO/WHO的认为:如果蛋白质序列之间在至少80个氨基酸左右的区域中具有35%或更高的一致性，那么同源性有生物学意义，即它们具有相似的生物学性质[22]，暗示牡蛎过敏原与其他6种软体动物过敏原之间会发生交叉反应。另外，Cra g 1优势T细胞表位(第129,143位)位于两个保守区中，因此交叉反应的原因很有可能就是拥有共同的T细胞表位。有研究也证明，对牡蛎过敏的患者进行血清检测，发现其对其他的软体动物过敏原有交叉反应[5]。若人对某一种软体动物过敏就要考虑避免食用其他的软体动物海产品以免发生交叉反应。另外有报道指出，Cra g 1与甲壳类的对虾过敏原(Met e 1)、龙虾过敏原(Pan s 1)、和螃蟹过敏原(Cha f 1)能发生交叉反应[7]，而且这3种的过敏原均为原肌球蛋白。原肌球蛋白在进化史上显示出高度的保守性并广泛在动物中分布，是动物肌肉中重要的调节蛋白，是海鲜 产品中的泛过敏原。因此，分析牡蛎过敏原与其他软体类或甲壳类海鲜过敏原之间的同源性， 尤其是表位所在区域的同源性，可以对日后针对保守表位进行特定氨基酸突变研究做铺垫， 为往后的脱敏治疗开辟道路，治疗牡蛎过敏，乃至软体动物、甲壳类动物食品的过敏性疾病。 本研究利用生物信息学软件，对Cra g 1的二级结构、B细胞表位和T细胞表位进行 分析，为接下来的高结合力抗原表位的改造、蛋白克隆表达、纯化、动物实验及将来的临床 实验等打下基础，也为进一步制备安全可靠的低过敏原性疫苗做好铺垫。 [参考文献] [1] Fuller HR，Goodwin PR. 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