定位猪肌红蛋白基因于染色体5p15_pter

定位猪肌红蛋白基因于染色体5p15_pter 定位猪肌红蛋白基因于染色体 5p15,pter 李宁吴常信 ( ) 中国农业大学农业生物技术国家重点实验室 北京 100094 摘要 利用荧光染色体原位杂交技术 ,以含有猪肌红蛋白基因的粘粒 DNA 为探针 ,分析了 猪肌红蛋白基因在染色体上的物理位置 。从 105 个中期染色体分裂相的杂交结果推断 ,肌 红蛋白基因位于染色体 5p15,ter 。就现有的知识范围 ,这个基因是第一次在家畜中被物理 定位 。 关键词 基因定位 ,猪肌红蛋白 ,荧光原位杂交 分类号 Q343 ( ) 肌红蛋白 Mb是由一条 153 个氨基酸的多肽链和一个血红素辅基组成 。近年来 ,人 、猪 、鼠 、牛等多种哺乳类动物的肌红蛋白基因已被克隆分析 。肌红蛋白基因是单拷 贝 ,结构非常相似 ,均含有 3 个外显子和 2 个内含子 ,一般在胎儿和成年个体的心肌以及 1 ,2 骨骼肌中表达。在肌红蛋白基因的物理定位研究方面 ,目前只有人肌红蛋白基因的 3 研究结果有报道。人肌红蛋白基因位于第 22 号常染色体 q11 . 2,qter 。 ( ) 构建染色体的物理图谱 或称细胞遗传学图谱是猪基因组作图的主要研究内容 。 ( ) 最近 ,在欧洲和美国猪基因定位 Pi GMa P的支持下 ,猪物理图谱的构建工作取得了很大的进展 。154 个座位在猪染色体上作了定位分析 ,其中 81 个是已知功能的基因 ,其 4 ( 他 73 个是未知功能的 DNA 标记。本研究利用荧光原位杂交 Fluo rescence i n si t u hy2 ) bridizatio n技术 ,对猪肌红蛋白基因进行了物理定位研究 。 1 材料和 从大约克公猪颈静脉采集外周血细胞 。在血细胞培养时进行1 . 1 中期染色体制备 () 胸苷处理使淋巴细胞的中期染色体同步化 ,再用 52溴脱氧尿苷 BrDu阻断细胞分裂 。培 养的细胞经低渗液处理后 ,将悬浮液从高空滴在经乙醇清洗过的载玻片上 ,然后在相差 显微镜下检查中期染色体分裂相 。理想的载玻片贮存于 - 80 ?备用 。具体方法见参考 文献 5 。 (DNA 利 用 缺 口 翻 译 试 剂 盒 Boe2 含 有 猪 肌 红 蛋 白 基 因 的 粘 粒 1 . 2 标记杂 交 探 针 ) bringer Mannheim 公司标记 Biotin2162dU TP ,再用快速层析柱纯化探针 DNA ,操作方法 完全依照试剂盒说明书进行 。 1 . 3 原位杂交和杂交信号检测中期染色体首先用 RNase 酶处理 ,然后加入变性液() 70 % fo r mamide ,2 ×SSC变性染色体 DNA 。制备杂交液时 ,首先将 250 ng 探针 DNA 、 μμμ() 50g 猪 Cot25 DNA 富含重复序列的 DNA和 25g E. col i DNA 溶于 10l fo r mamide ,在 μ( 75 ?加热 变 性 10 min , 然 后 与 10l 2 ×杂 交 液 4 ×SSC , 100 mmol/ L p ho sp hate buffer , p ) H7 . 0 , 20 % dext ran sulf ate , 2 ×Denhardt ’s solutio n 和 0 . 2 %SDS混合 。每个载玻片加 μ上 20l 混合杂交液 ,在潮湿的暗盒内于 37 ?杂交 16,20 h 。杂交信号由 avidin2F I TC 染 ( 色显示 ,并通过 anti2avidin 将信号放大 。中期染色体分裂相用 p ropidium io dide 1 . 5 mg/ ) () ml染色 ,再用 P2p henylenediamine1 碱性液 p H11处理 。杂交信号和染色体 R 带同时在 6 ( ) 显微镜下检测,并收集于图像分析仪 IBA S ,Carl Zeiss 公司。 2 实验结果 在本研究中 ,用于杂交的载玻片总数为 15 。对 228 个中期分裂相作了检查 ,其中 201 个中期分裂相有阳性荧光信号 ,占总观察分裂相的 88 % 。由于阳性荧光信号强度大 ,同 时出现在同一染色体的两条染色单体上 ,因此不难与杂交背景区别 。经过对染色体 R 带 ( ) 的比较分析 ,表明这些荧光信号的位置是在第 5 号常染色体 p 15 ,p ter 图版 I21。对 105 个中期染色体分裂相进行了拍照 ,其中只有一条染色体的 2 个染色单体同时出现杂 () 交信号的中期染色体分裂相数是 14 . 3 % 15/ 105,两条同源染色体的 3 个染色单体同时 () 出现杂交信号的中期染色体分裂相数是 34 . 3 % 36/ 105,两条同源染色体的 4 个染色单 () 体同时出现杂交信号的中期染色体分裂相数是 51 . 4 % 54/ 105。所有这些结果证明 ,猪 肌红蛋白基因位于猪染色体 5p 15,p ter 。 4 ,7 ,8 根据猪基因定位的最近研究成果,我们了猪第 5 号染色体的综合性物理图() 谱 图版 I22。在该染色体上 ,已有 5 个功能基因和 3 个未知功能的 DNA 标记被物理定 位 ,这 3 个未知功能的 DNA 片段均为包含了微卫星座位的粘粒克隆 ,微卫星座位分别命 名为 sw2425 ,s0057 和 sw1200 。 3 讨论 在对功能基因或 DNA 标记作物理定位时 ,荧光原位杂交技术与同位素原位杂交技 术相比 ,至少存在两大优点 ,一是实验周期短 ,二是不必作统计检验分析 。 4 ( ) 目前 ,猪第 5 号染色体上已有 4 个功能基因被定位,柠檬酸合成酶基因 CS位于 γ( ) ( ) p 12,p 13 , 干扰素基因 I FN G位于 p 12 , q11 , 乳酸脱氢酶基因 L D HB 位于 q21 , ( ) qter ,粘蛋白基因 M U C位于 q23 ,在人物理图谱上 ,前 3 种基因均位于第 12 号常染色 3 ( ) 体 ,只有粘蛋白基因位于第 11 号常染色体。现在 ,我们又将猪肌红蛋白基因 M b定 位于染色体 5p 15,p ter 。通过遗传连锁定位 ,位于猪第 5 号染色体上的功能基因还有甘 ( ( ) ( ) ) 油二酯激酶基因 DA G K, 乳清蛋白基因 L A L B A 和似胰岛素生长因子 I 基因 I G FI , 但这些功能基因的具体物理位置目前尚不清楚 。猪肌红蛋白基因位于染色体 5p 15 , p ter ,人肌红蛋白基因位于染色体 22q11 . 2,qter ,显然猪第 5 号染色体至少与 3 条人染色 体存在部分同源性 ,这也许是因为猪二倍体染色体数为 38 ,而人二倍体数为 46 。与猪遗 8 传图谱相比 ,猪物理图谱上座位的数量仅是遗传图谱上座位数量的 1/ 4 ,由于物理图谱 1 Akabo shi E. 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The hybridizatio n o n 105 metap hase chro mo so me sp reads led to a co nclusio n t hat myoglo bin gene is p recisely o n chro mo so me 5p 15 ,p ter . To o ur knowledge , myoglo bin gene was t he first time to have been p hysically mapped in livestock species. Key words Gene mapping , Po rcine myoglo bin , F ISH