牛磺酸席夫碱铜配合物的合成、晶体结构与性质研究

牛磺酸席夫碱铜配合物的合成、晶体结构与性质研究 , ,,,,,, 分类号:,,,, 密级: 无单位代码: ,,,,, 学号; ,,,,,,,,,, 首都师范大学硕士学位论文 论文题目 牛磺酸席夫碱铜配合物的合成、 晶体结构与性质研究 研究生: 李金芳 指导教师: 周荫庄 副教授 学科专业: 物理化学 学科方向: 配位化学 ,,,,年,月,,日 首都师范大学硕士学位论文 摘 要 超氧化物歧化酶(,,,)是体内专一清除超氧阴离子自由基的金属酶，具有抗衰老、抗癌、抗炎等功效。由于天然,,,在实际应用中的局限，其小分子模型配合物已经成为了研究的热点。本课题从酶促机制的发展、酶的类别及结构研究包括酶结构的全序列同一性研究等方面系统综述了超氧化物歧化酶的研究现状。其中包括比较成熟的,,，,,(,,,酶促机制和,,，,,,,,,、,,(,,,、,,—,,,和,,(,,,的结构及其过渡金属模型配合物的研究情况。 本课题选用邻香草醛缩牛磺酸席夫碱和含氮小分子化合物毗啶、,(氨基吡啶分别合成了具有变形四方锥构型的双核铜配合物(,)和近平面构型的单核铜配合物(,)。并经红外光谱、紫外光谱、晶体结构测试对其进行了结构表征。采用,,,一核黄素一蛋氨酸光照法测定模型配化合物的,,,活性，探讨了生物活性和结构之间的关系。实验结果表明配合物(,)和(,)均具有较强的清除超氧阴离子自由基韵能力，，,,,分别为,(,,,,,,,,,,,和,(,,,,,?,,,,,。这为进一步研究复杂生物活性分子结构与生物活性的关系提供了良好的模型配合物。关键词:超氧化物歧化酶铜席夫碱模型配合物晶体结构 首都师范大学硕士学位论文 ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,(,,,),, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,, ,,, ;,,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,;,,,(，, ,,,,,,, ,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,, ;,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,，,,,;, ,,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,;,,,,，;,,;,,,,,,,,,, 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生物体在进化过程中不但在体内建立了一套执行防御氧化性损伤的抗氧化机制，还利用氧的氧化作用进行物质代谢和能量代谢以及利用活性氧消灭入侵的微生物，但生物体对活性氧的防街系统还不完善(有时活性氧的损伤会造成或大或小的病理变化。这种生物的需氧性和氧对生物潜在的危害性就被称为氧对生命过程的“双重性?，,这是生物界普遍存在的一个重大的矛盾问题。随着放射生物学和自由基生物学的迅速发展，特别是,,,,年,;;,,,和,,,,,,,;,〔,,发现超氧化物歧化酶(,,,)的生物活性之后，提出了氧毒性的超氧化物自由基学说，并且揭示了超氧自由基的形成是氧毒性的主要因素，促进了对氧代谢和,,, 深入而系统的研究。通过配体合成与,,,活性中心结构相似的配合物，研究其结构和功熊可以获得许多难以从结构复杂的天然酶的研究中得到的信息，对其活性中心的研究意义重大。近年来，金属酶,,,化学模拟迅速发展。已成为配位化学和生物无机化学研究的一个重要领域。第一节超氧化物歧化酶的研究 超氧化物歧化酶(,,,)广泛存在于各种好氧和耐氧生物体内。不仅如此，在专性厌氧生物中也存有少量的,,,。它是机体清除超氧阴离子自由基的一种重要酶，在维持机体的氧化一抗氧化平衡中起着重要作用，是生物体预防氧毒性的重要防线。自,,,,年，,,,,等首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶【,】算起，人们对,,,的研究已有近七十年的历史。,,,,年，,;;,,,【,,等进一步发现了它们的生物活性，有关氧代谢的分子生物学等方面的研究工作，可与,,,双螺旋结构学说的成就相提并论,,,。最近研究表明，超氧化物歧化酶;,伴护蛋白质(,,,)对,,,,的功能完善至关重要,,〕。,,,,的结构表明，除金属中心的特性外，,,,,,和,,,,,,河的二硫键对于其发挥功能亦很重要。,,,〔的插化极可能由二分子的杂二聚体引起。它可以保护线粒体免受活性氧的损伤口，。其基因变异会导致肌肉萎缩等疾病,,】。,,,;,等研究认为其催化活性与离子强度相关，分子整体电性能影响酶活性【,,。亦与外源性物质有关。并且不同来源的酶呈现不同的生物学特性,,(,,〕。,，;,,,,,,,,,的,,，,,,,,,可以同时表现出抗氧化剂和强氧化剂的特性，埘;缨胞溶质的,,,，的保护效应与超氧阴离子自由基将出现在葡萄糖诱发的白内障形成过程中【,,】。,,,,的缺失将使由氧决定的敏感性转化为,,,损伤和复制受阻【?】，也将引起幼儿早期听力的丧失”副。,,,,转基因小鼠实验表明人类线粒体,,,,表达的控制增加同样也能提高酶活 首都师范大学硕士学位论文性，降低超氧化物水平量【,,,。,,(,,,活性的丧失会导致一系列包括与细胞外超氧化物歧化酶表达有关的组织方面的疾病【,,,，活性的增强可以改善成年老鼠的记忆功能和认知损伤,,,〕。 酶的活性还受其外源性物质的调节。心脏线粒体比肝脏线粒体的,,(,,,显示了较强的活性，在缺氧线粒体中活性降低。含氧量正常的线粒体中【,,,,和〔,,,,均可活化酶而【,,,,稍弱，同时加入时具有加合作用，这在心脏线粒体中表现明显。〔,,,，】,在调节需氧代谢中的,,,,,,的活性中发挥着作用,,,。为了在不同物理环境中发挥作用，酶结构会发生微小变化。室温下六配位,缸(?)在接近生理温度时变为五配位,缸(,)【,们。重组的,,,,,,会加速还原超氧化物阴离子，其活性受溶液的,,和温度等影响,,,。重组的,,，,,,,,,在氮端氨基酸序列、亚单元分子量、热稳定性等方面与,(;,,,,,中的天然,,，,,,,,,相似【,,,。在缺氧环境下，;,，,,,,,,和,,,,,,酶的异构化后活性变化各异【,,,。 氨基酸类席夫碱配合物由于具有许多药理学和生理学活性而十分重要，多应用于抗癌,,〕、抗菌口,,、消炎【,,?,,,、生物化学反应如氨基转移或脱羧反应中【,耵，且其生物活性和金属的配合有关，广泛应用于治疗、合成、生化反应(如酰胺基转移、脱羧、缩合、,(消除及外消旋反应)、催化、生物调节剂、热敏或者压敏材料中的染料、聚合物改性、分析试剂、螯合剂等方面。例如抗癌活性非常强的三(丙氨酸席夫碱配合物。席夫碱基团通过碳氮双键(,,对,,)上的氮原子及与之相邻的具有孤对电子的氧(,)、硫(,)、 磷(,)原予作为给体(供体)与金属原子(或离子)配位，其金属配合物可以作为金属酶的模拟物嗍。研究金属离子和席夫碱配体之间的合成、结构和相互作用，对于深入考察其生理、药理活性的作用机理、构造、稳定性等方面有着十分重要的作用，并且还可以获得许多难以从结构复杂的天然酶的研究中得到的信息，对其活性中心的研究意义重大【,,,,,。因此对小分子能在生理条件下保持稳定的小分子模型物的合成、表征及生物活性的研究成为热点,,,,。近年来研究其配合物，不仅重视选择功能性原料，并对其形成机理、光谱性厨,,钾,、氧化还原电势„,,,等方面有进一步的研究，而且综合考虑形成配合物后的功能性、广谱性〔,,，,,〕。,酶促机制 氧自由基(,,,;,,,, ,,,,,, ,,,;,,,，,,,)或称活性氧，主要包括超氧阴离子自由基(, ,?)、羟自由基以及有机过氧化物自由基等。生命体在正常代谢中产生,,,，而一些外界环境因素能增加细胞中的,,,浓度，若不能及时清除以恢复平衡，会引起生物膜的过氧化损伤，甚至造成细胞器的损害和,,,与蛋白质的降解与失活。生命有机体在进化过程中形成并发展了清除活性氧的系统，例如抗氧化酶系统和非酶性小分子抗氧化系统。,,, 第一章超氧化物歧化酶盈其席夫碱金属模型配台物的研究属于氧化(还原酶，是催化, ,(歧化反应，专一清除生物体内的超氧阴离子自由基(平衡机体氧自由基的金属酶，其催化作用是通过所含金属的氧化和还原过程电子得失实现的。在生理条件下，,,,可使, ,(歧化产生,,的反应速度提高,,,倍…,。 ()，(，,”,—手,、，,“ ,,、?，,”—,,、,、，,”, 作为氧化(还原酶，特别是那些参与电子传递的氧化还原酶，其结构与作用机制一般比较复杂。大多数电子传递链包藏在线粒体内膜，难以可溶形式提纯。当电子经线粒体呼吸链传递到分子氧及在各种羟化和氧化过程中会形成毒性的氧的部分还原产物，作为中间产物出现在酶的活性部位上。随着人们对于各种,,，,,—,,,结构的深入了解以及各种现代手段的运用，对于,,,酶催化机理的研究也有很大的进展。 ,,年代中期，,,,和,,,,,,,等分别通过研究,,，,,(,,,酶催化, ,(歧化的动力学，发现速率限制过程是, ,?与活性中心的键会过程。在,,,,(,,,(,,(阅结合速率与,,无关，并且酶在水中歧化的反应速率与在重水溶剂中是相同的，说明质子转移不是结合过程的一部分，质子传递并非催化反应的决定步骤，由此提出了铜锌咪唑桥质子化并断开和重新循环作用机理【,,】。,,?， 同时,,,,,,咪唑桥重新形成 据此机理，在歧化过程中伴随着;,氧化态的变化与铜锌桥的断裂和重新形成，且咪唑桥为过氧根的质子源。,,,,年,,,(,(用停留法对,,,酶催化歧化反应动力学重新进行了研究〔,,】，总酸质子转移过程为速率限制过程，催化歧化形成,,,,所需要的质子来自于溶剂水而非昧唑桥。 ,,,,,,,等研究结构表明?】在催化过程中与,,(，，)相距,(,啪的舢争,,,具有重要作用。他认为机理如下: 首都师箍大学硕士学位论文,,(，，) ,,(,)(不考虑,,,,,,,作用时) ;,,,,，一一,,(,一…,,,(，，)(决速度) ,,,(,,,传 递质子,,,( ,,,。，,,(，, 这种以氢键形式存在的稳定中间体(还原型配合物)增加了呸?对质予的亲合力并诱导质子从船,,,传递给,,,。形成,,,,。，同时电荷重新分布，还原酶又重被氧化为,,(，，)酶，完成一个循环催化过程。,,?被还原为,,,,所需要的质子直接来源于活性中心附近的,,,, ,,,。,,,,,,,测定了含有不同氨基酸残基酶盼催化歧化活性【,,】。结果表明,,,,,,,有加速何?与,,(，，)配位的作用，是活性中心的一部分，在催化过程中发挥着重要作用。 ,,,,年张静怡等根据,,,,下备自不同的氧化还原电势探讨了超氧化物歧化酶催化超氧阴离子自由基歧化作用的机制,】。推测可以发生歧化反应,,,?——?,,，,,,„，由于两个相同电荷的锈?难于靠近，影响了歧化反应速度。但与,,,配位后获得活化，消除了呸,间的静电斥力，加速了歧化，,,,,，(,,,，,,?，,旷,,令,,,，,,,,，,,可自发进行。对于与多价金属配位，配合物的空间构型效应不容忽视，,,，的构型为,,,。对称性高，形成的,,,配合物的立体构型为四面体，位阻效应较小，比较稳定;而,,,，为扭曲的平面正方形，位阻效应较大，不稳定，故可发,,,,，，(,,,催化锈,的歧化反应。 人们普遍接受,,，,,(,,,机理是,,,,年由,,,,,,基于,(, ,,,,的牛,,,,，,,,,,,氧化型晶体结构和广大的光谱数据所提出的，推测机理是通过连续的,,?对活性位置的,,,，离子交替氧化及还原〔,,】。采用的,,,结构是重修过的,(, ,,,牛,,,，大面积序列的残基拓扑结构是通过基本的紧密堆积与氢键的维系而趋于稳定的，并为,,?提供一个唯一的、有效且充足的超氧位置(超氧阴离子所在的位置);同时呸?与;,“、与活性有重要作用的,,,(,,,以适宜的几何构型相连，其旁边有两个水分子，是超氧位置的灵魂(水分子位置)。这一几何结构、分子活性表面，以及生化数据为酶机理的研究提供了一个特殊模型。由于,,的存在及,,(，，)的扭曲平面四边形，增加了其电势。因此，三配位的,,结构是建议机理关键的 , 第一章超氧化物歧化酶及其席夫碱金属模型配合物的研究一步。 ,三(，;,(，，)——卜,:，;,(，) 查圭望竺查 ,三配位铜还原酶郴】 ,—一。———? 并与,,,,,,分离 ,,(，)与,,(，，)之间通 过,,,(,,与溶剂水进行 质子传递 ,,,,，,,,;,,啪?,研究还原型的牛一,,,是三配位，,,为平面三角结构，为此机理提供了第一个直接的结构证明。但是,,,,年,,,,,,,,,,等得到了分辩率为,(,,,,,的一个牛还原酶结构是五配位与氧化态牛,,,五配位结构相刚钏。此结构又为,,,,年，扫,,,,, ,,,,,,,提出的另一种机理提供了证据剐。他们认为通过催化循环(,,仍保持五配位，机理的关键是,,与嘎,之间形成稳定的配合物，然后再与第二个分子的,,?进行外部电子转移。这些激发了,呐,, ,,的兴趣【锄，他们对不同,,缓冲液中获得的还原型牛(,,,晶体结构进行了深入的研究，均证实了早期,,,;,,,,,的研究，显然在水溶液及晶状半流体中还原型的,,与三个组基酸配位形成平面三角构型。,,,,年,,,,,,,,,从酵母(,,;;,,,,,,;,,,,,,,,,,,)中获得的,(,, ,,, ,,，,,,,,,〔,,,清楚地说,,,,,,,(,,远离,,,,，，距离大于,(,, ,,,,并且咪唑环偏离,,,,,轴,,,。,超氧化物歧化酶的类别及结构研究,(,超氧化物歧化酶的结构研究 目前，在人体中仅发现三种,,,，根据金属辅基的不同可分为,,，,,,,,,、,,(,,,和,,?,,,。植物中还有一种,,—,,,。,,(,,,主要分布在线粒体中，而;,，,,(,,,主要分布在细胞浆，尤其是在红细胞中，它们在防止,,(对细胞的损害方面起着重要的作用。同时，由于金属辅基的多样性，生命体内一旦某 类,,,的合成由于金属辅基的缺乏而受阻时，就可以由另一类,,,来补充。,(,(， ,,，,,,,,,和,,,,,,的结构研究 ,,,,年，,,;,,,,,,,实验室首先获得单晶，并提供了结构数据〔,,,。随着分析技术的进步和分析仪器静密度的提高，电子密度图的分辨率不断提高，超氧化物歧化酶的结构研究获得较大的发展。 首都师范大学硕士学位论文 酶的两个亚基结构相同，每一个亚基包括己知的序,,,,:,(,,呦分辨 列,,,个氨基酸和一个,,、,,的,,,骨架结构及外 率的电子密度 , 部一对环,,,,埔成了活性通道峰,,。,,,,:,(, ,,,,分辨率 可以分辨肽链骨架的走向和金属配体的组成。两个 的电子密度图 相同的亚基通过非共价键的疏水作用而缔合，其中 的二硫键对亚基缔合起着重要的作用【,,,。 ,,,,,:,(, ,,,分辨率————? 比较清楚的看到了,,，,,,,,,活性中心位置的排 的电子密度图 列„,,,。,,、,,分别与多个组氨酸咪唑基的,原子配 位，并通过组氨酸咪唑环进行桥连，在每一个二聚 分子之间呈非晶体学二次轴的对称性【跚。 ,,，,,(,,,的活性中心部位，;,(，，)与四个,,,残基(,,,,,,,,,，,,,,,,，,,,,,,，,,,(,,,)的咪唑基,原子配位形成畸变的平面四方形(其中，,,,,,, ,,的咪唑基作为,,(，，)和,,(，，)的桥联配体)，与轴向配位水分子形成畸变的四方锥构型。,,(，，)与三个,,,(,,,,,,，,,,(,,，,,,(,,)残基,原子和一个门冬氨酸残基(,,,(,,)的羧基氧原子配位形成三角双锥畸变的四面体构型。,,,，，)的主要功能是稳定蛋白质结构。,,(,,,的活性中心结构尚未知，基于,,,的进化保守性，推测在,,(,,,的活性中心部位，,,仍与三个组氨酸残基、一个,,,残基及一个,,,配位〔,,,。,(,(, ,,(,,,和,,(,,,的结构研究 ,,,,,,,活性部位基本上有一个是底物或其它内源性配体接近,,,,离子的通道，该通道由疏水残基构成的疏水穴、两个亚基链共同形成，终止于金属离子附近的,,,,,,和,,,(,,残基。,,,,,,,研究了,,;,,,,;,,, ;,,,(大肠杆菌),,(,,,的晶体结构。其结构与其它,,,,,,和,,(,,,高度一致，以不对称单元均二聚形式存在删。,,以,,,,,,、溶剂分子(可能是,,,为轴向配体，,,,(,,、,,,(,,,和,,,(,,,为赤道位配体的五配位三角双锥构型。配位溶剂分子和,,,(,,,未配位的羧酸氧及谷氨酸残基,,,,,,,以氢键网状结构存在。,,,,,,二聚体的活性中心通过由一个单体的,,,(,,,和另一个单体的,,,(,,,桥联接。为了在不同物理环境中发挥作用，酶会发生微小的结构变化。室温下六配位的,,(,,，)核在接近生理温度变为五配位的?,，，)【引,。 , 第一章超氧化物歧化酶及其席夫碱金属模型配合物的研究 最近对,(,,,,,,,,,(,腔毛滴虫),,(,,,结构研究表明,,,,,为变形的三角双锥，与,,,,,,、,,,,,,、,,,—,,,、,,,?,,,残基和一个溶剂分子(,,,或,,,)配位，且在较宽,,范围内(,(,,,,(,)构型保持;均二聚体交界处产生了溶剂分子填充的漏斗状孔道可将底物传输到活性部位„,,,。,(,超氧化物歧化酶的结构全序列同一性研究 至,,,,年，在完成了全部氨基酸序列分析工作的六个超氧化物歧化酶中，四个是,,?,,,,,,分别来源于牛、人的红细胞、马肝和酵母，另外两个是, ,(,,,〔,,,来源于大肠杆菌和一种嗜热细菌。这两,,,,,,的全序列同一性为,,,。而对多种来源的,,(,,,和,,?,,,进行的,一末端序列分析揭示，这两类,,,在氨基酸序列上具有高度一致性，从而判断进化上可能来源于同一祖先。,,,,，,,;,,,,等系统研究和分析了这两种,,,之间结构的相似性唧】。,,,,,,和,,(,,,是以同一亚单元单位组成的二聚体或四聚体存在，各自的氨基酸排列的相同性高，在部分细菌中即使,,和,,相互交替也能保持活性，配位环境相似【,,】。从,,,,,,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,,(丙酸杆菌)中获得的,,,的,,和,,一级结构具有相似活性，以不对称单元的均二聚体结晶。三级结构同其他,,,,相似，与三个,,,，一个,,,和一个,,,成键以五配位形式存在。残基第二层由憎水的氨基酸，,,,和两个,,,构成，与催化活性和结构稳定性有关，还可能是其具有;蜊,,口凰,,;(倾向分生组织的)行为的原因。,;,,,,,研究认为金属特性并非无足轻重，金属环境的微小变化也可能是造成这种;册,缸协如(倾向分生组织的)行为的原因，匍。 ,,，,,,,,,与上两类,,,没有这种进化上的相关性，但不同来源的,,，,,(,,,之间却呈现出明显的进化的保守性和高度的序列同一性【,,,。人和牛的红细胞中提纯的,,,,,,,,,之间全序列同一性高达,,,。通常人们认为细胞色素,是进化上高度保守的典型蛋白质，因为不同来源的细胞色素;序列同一性为,,(,,，而不同来源的;,，,,(,,,全序列同一性高达,,,，可以肯定,,，,,,,,,也是一类进化上高度保守的酶。 , 首都师范大学硬士学位论文第二节 席夫碱金属,,,模型配合物的研究 ,,,作为配位化学金属蛋白的模型，各配体间通过氢键相互作用，相互联系。,,,中金属离子的存在强烈影响着其它原子的表现，而且通过重新构建取代,,或,,离子，可获取,,,的一系列衍生物。国际上，自,,年代对,,,的研究全面展开，从种类、来源、结构、功效直到,,,的模拟化学，使对,,,的研究达到了一个高潮。,,年代末，国内对,,,的研究相继展开，主要集中在应用以及与应用直接相关的基础理论等方面，并取得了很大的进步。 研究表明,,,活力的高低与机体衰老、肿瘤、炎症等疾病有关。由于天然,,,在稳定性、膜穿透性、生物利用度和免疫原性等方面存在著一些限制。因此，对具有,,,活性且能在生理条件下保持稳定的小分子模型物的研究成为热点。咪唑基是组氨酸残基很好的模型。因此对,,,结构的模型主要表现在以咪唑基为桥、以含氮小分子为配体的单核，同、异双核及多核(铜、锌、钴、镍、锰、铁)配合物的合成与表征。苯并咪唑基由于其易于制取、拥有较涨唑基更大的化学惰性及能够提供较为合适的空间位阻，也成为组氨酸残基较为理想的模型物。当前报道的,,,模型物多为苯井咪唑类，氨羧类。氨基酸以及席夫碱等金属配合物等。相对于天然,,,这些小分子模型物具有分子量小、脂溶性好、膜渗透性强、性.