真菌菌丝多糖的提取研究进展

真菌菌丝多糖的提取研究进展 第31卷6期 2008年11月 安徽师范大学学报(自然科学版)JoumalofAnhuiNormalUniversity(NaturalScience)Vo1.31No.6 Nov.2008 真菌茵丝多糖的提取研究进展 袁巍,潘宗琴2,潘攀2,冯乙巳2 (1.蚌埠医学院,安徽蚌埠233000;2.合肥工业大学,安徽合肥230009) 摘要:真菌多糖由于其显着的生物活性和低毒性而成为目前的研究热点,国内外对其提取方面的 研究非常活跃,并且有些方法已经开始应用于实际生产.本文归纳了菌丝多糖提取方面的研究进 展,分别从细胞破壁,浸提,分离三方面对现有的各种方法进行了分析比较,总结了各自存在的问 .为进一步系统研究真菌多糖提取工艺提供了线索和依据. 关键词:真菌茵丝多糖;细胞破壁;浸提 中图分类号:Q539文献标识码:A文章编号:1001—2443(2008)06—0576—04 我国食药用真菌资源丰富,目前发现有价值的真菌多糖已有3O多种,其中香菇多糖,猪苓多糖,灵芝多 糖等多种多糖制剂已经通过鉴定投放市场,并收到了很好的经济效益和社会效益.真菌多糖是从真菌子实 体,菌丝体,发酵液中分离出的一类活性多糖,是食用菌中所含的最重要的药效成分,具有广泛的药理活 性【1j.科学实验表明真菌多糖具有很强的抗肿瘤活性,对癌细胞有很强的抑制力,且在免疫调节,降血压,降 血脂,抗血栓,健胃保肝等方面起着重要的作用,现已广泛应用于免疫缺陷性疾病,自身免疫疾病和肿瘤等疾 病的临床辅助治疗,因而被称为一种重要的生物效应调节剂j.另外,多糖可以改善食品的食用品质,加工 特性和外观特性,可用于抑制脂质氧化,稳定酸性饮料_3J,也可作为乳化剂等,在食品中的用途也十分广泛. 由于其显着的生物活性,且几乎没有任何毒副作用,所以许多真菌多糖还被用作保健食品的功能添加剂,如 真菌多糖啤酒已在我国问世,因此真菌多糖是目前最有开发前途的保健食品和药物新资源. 目前,国内外对真菌多糖的研究及开发利用进展得很快,其中真菌多糖的提取是其广泛研究与应用的基 础.传统的真菌多糖提取多采用子实体为材料,但由于子实体栽培周期长,劳动强度大,受气候,环境的影响, 产量及质量不稳定,且子实体木质化程度高,多糖提取利用率较低.与之相反,采用生物发酵技术生产菌丝 体,周期短,成本低,产量大,且有工业化生产前景,因此利用生物发酵技术生产菌丝体多糖是当前的主要方 法.而且已有研究表明,菌丝体多糖具有和子实体多糖同样的药理活性.因此如何科学高效地从真菌菌丝体 中提取多糖成分是目前的核心问题.本文将对菌丝多糖提取方面的研究进行综述. 1细胞破壁 由于菌丝在发酵过程中,有的将多糖分泌到胞外,形成胞外多糖,有的只留在胞内,形成胞内多糖[.对 于胞外多糖,可以直接将发酵液经浓缩沉淀而得到.而对于胞内多糖,在提取前应对菌丝体进行一定程度的 预处理,利用细胞破壁技术破坏其细胞壁,使胞内多糖较易从细胞内释放出来. 常用细胞破壁技术分为机械法和非机械法两类.机械法按破碎方法分为靠固体剪切作用进行破碎的珠 磨法,压榨法以及靠液体剪切作用进行破碎的高压匀浆法和超声破碎法.非机械法按破碎方法分为靠溶胞作 用进行破碎的酶溶法,化学法和物理法以及利用干燥处理技术进行破碎.目前,高速珠磨匀浆法和高压匀浆 法不仅在实验室被广泛采用,而且已在工业生产中应用;酶溶法和化学渗透法亦已在实验室内应用. 1.1机械法 1.1.1超声破碎超声破碎主要是利用超声波空化产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体破 裂,而且整个破裂过程在瞬间完成;同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放,扩散及溶解,加速有 效成分进入溶剂,使其进一步增大了有效成分的溶出. 收稿日期:2008—06—10 作者简介:袁巍(1964,),女,安徽萧县人,讲师 3l卷第6期袁巍,潘宗琴,潘攀:真菌菌丝多糖的提取研究进展577 方其兵等5采用4种方法对真菌菌丝进行细胞破碎研究,结果表明采用先加石英砂再进行超声破碎的 方法最好,使真菌菌丝破碎和细胞内含物释放充分,且操作时间短,操作简便,在操作过程中真菌细胞内含物 性状稳定,变性少.有研究表明采用超声波处理猪苓菌丝后,能显着提高粗多糖的提取率,在最佳工艺条件 下,猪苓菌丝粗多糖的得率可达11%. 也有采用超声波与酶法连用进行细胞破壁以提取胞内多糖的,如采用超声波协同纤维素酶法提取黑木 耳多糖,结果发现由于作用温度低,所得到的多糖颜色浅,有利于多糖产品的进一步精致_6j6.超声的不足之 处是可能会导致可溶性多糖发生降解,但超声并不影响水溶性多糖的生物性能,超声法提取具有高效,节能, 省时的特点.因此,超声辅助提取法是一种高效实用的多糖提取方法. 1.1.2反复冻融法该法是利用细胞内冰粒的形成和细胞液浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎,从而可 以促使多糖尽快从胞壁中释放出来.文献报道固体发酵蜜环菌得到的菌丝体冷冻前浸提多糖含量约1.375g/ 100g菌丝体;冷冻后浸提可得到多糖约1.416g/100g菌丝体.通过冷冻前后提取多糖的比较,说明冷冻可以 提高多糖的提取效率_7J. 此外,还有研磨法,高压匀浆法,高速球磨法等用于细胞破壁.其中研磨法较简单,但破碎效果不佳,还可 能造成细胞内含物变性,因此不宜用于易变性的细胞内含物的分析研究.高压匀浆法和高速球磨法较为常 用,破壁效果优于研磨法,但产量小,很难工业化生产. 1.2非机械法 1.2.1酶溶法酶溶法是通过酶反应将原料组织分解,以除去细胞壁和膜上的果胶,纤维素及蛋白质等成 分,从而降低提取难度,有利于细胞壁内多糖的溶出,使多糖提出率提高.目前常用的破壁酶主要有纤维素 酶,蜗牛酶,溶壁酶,果胶酶等,主要实施方法有单一酶法,复合酶法和分别酶法. 如对白灵菇菌丝体进行酶处理后,多糖得率最高可达8.23%,远高于未经酶处理时的得率8.由于酶具 有专一性和选择性的特点,因此应用时多采用复合酶.针对真菌菌丝多糖分布部位及细胞结构特征的不同, 采用不同的复合酶体系,在各种酶协同作用下,能充分破坏菌体细胞结构,最大限度提高多糖的得率,同时保 持有效物质的固有结构与活性.张立娟等9通过单因素和正交试验研究了细胞破壁酶(纤维素酶,果胶酶和 木瓜蛋白酶)在黑木耳多糖提取中的最佳作用条件,他们先加入复合酶(纤维素酶与果胶酶)作用,再加入蛋 白酶反应.结果发现经此法处理后,多糖提取率高达l6.83%,提取时间缩短到140min,较以往只用热水提法 和碱法提取具有明显的优点.可见酶溶法不仅可以使多糖的得率大幅度增加,浸提时间缩短,还具有反应条 件温和,能保持多糖的活性构象,更好地保持多糖的药效的优点.因此,利用酶法破壁应用前景十分广阔. 存在问题:易造成产物抑制作用,这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素.而且溶酶价格高,限 制了大规模利用.若回收溶酶,则又增加了分离纯化溶酶的操作.另外酶溶法通用性差,不同菌种需选择不同 的酶. 1.2.2超临界流体技术超临界流体是指处于临界温度和临界压力之上的流体,它具有类似于气体的低粘 度和类似于液体的高密度,有较好的流动,传质和溶解性能.常用c02作为超临界流体,高压co2易于渗透 到细胞内,突然降压使细胞内外压差急剧增大而膨胀破裂,同时在降压过程中流体体积膨胀,温度降低,可防 止因升温引起生物活性物质失活;其次,超临界co2能破坏胞壁上的脂溶性成分,降压时破裂发生在一定位 置,此性质使得细胞在破碎时仅在某些位置上破裂,而不是整个细胞破碎,破碎后的细胞壁碎片较大,使下游 分离过程变得简单. CO萃取装置试验从藏药雪灵芝中萃取多糖,在最佳萃取 廖周坤等l10_用SEF— 条件下,SFE萃取法与 传统溶剂萃取工艺相比,多糖收率可以提高至1.62倍.另外,超临界流体的密度和介电常数随着密闭体系的 压力增加而增加,极性增大,利用程序升压,可以将不同极性的成分进行分步提取.可见超临界co2萃取技 术萃取能力强,提取效率高,生产周期短,极少损失易挥发组分或破坏生理活性物质,没有溶剂残留,产品质 量高. 1.2.3微波辐射法微波法是靠微波电子管发出的电磁波,感应生电,又转化成分子的动能而发热,从而导 致细胞内的极性物质,尤其是水分子,产生大量热量,使得细胞内的温度迅速上升,液态水汽化产生的压力将 细胞膜和细胞壁冲破,形成微小的孔洞,进一步加热,导致细胞内部和细胞壁水分减小,细胞收缩,表面出现 裂纹.由于孔洞和裂纹的存在,胞外溶剂容易进入细胞内,溶解并释放胞内多糖.微波的频率很高,能深入渗 578安徽师范大学学报(自然科学版)2008焦 透物体,对细胞的结构有较大作用,而且微波加热的热效率高,温度升高快速而均匀,因此,应用微波加热提 取手段,能够显着缩短萃取时间,较大程度地提高多糖的萃取效率.有文献报道,发现利用微波辅助法提取黑 木耳多糖的平均得率为13.26%,比常规水提法的得率提高约51%,而时间也缩短了将近5/7[11]. 微波法不论在节能,高效,还是在操作方面都具有优越性,具有快速,高效,安全的特点;可见利用微波强 化固液浸取过程是一种颇具发展潜力的新型辅助提取技术. 此外,还有将化学渗透法,真空气流破壁法等用于细胞破壁方面的研究.其中化学渗透法主要是利用化 学药品改变细胞壁或膜的通透性,从而使内含物有选择地渗透出来.存在的问题是:时间长,效率低,化学试 剂毒性较强,同时对产物有毒害作用,通用性差,因此不常用真空气流细胞破壁技术是通过压力的变化使细 胞内水份急速沸腾并汽化以至使细胞内部压力迅速升高,细胞壁因无法承受如此巨大的压力变化而破碎,此 技术特点为细胞破壁率高,破壁完全.已有研究将此法用于提取中药金银花,黄芪中有效成分的前处理过程, 结果表明,能大幅度缩短提取时间,降低生产成本. 2溶剂浸提 提取真菌多糖的常见方法有:热水浸提法,碱提法,酸提法,对于水可溶性多糖可采用热水浸提,水不溶 ,草酸铵,氢氧化钠等. 性多糖一般用酸或碱提取,常用三氯乙酸,稀盐酸 2.1水提法 热水浸提法由于具有有机溶剂使用量少,所需提取剂蒸馏水经济易得,对多糖活性破坏小,操作简便和 节约等优点,成为最为常见的使用方法.如用1L热水对绒状火菇菌丝体在70—80?浸提8h后,多糖得率为 9.5%h2]. 但此法存在的不足是需经多次浸提,而且费时费料,因此在应用上受到一定的限制.也有研究表 明,单纯水浸提多糖的提取率非常低,为提高多糖溶出率,可以加入一些中性盐,使细胞膜结构发生变化,细 胞内成分扩散出来,盐浓度越高这种破坏作用越显着,同时细胞内膜上的结合多糖由于中性盐离子的作用部 分溶解到液体中,增加了多糖的提取率.如用蒸馏水提取虫草菌丝多糖时,得率为0.55%;而用5%NaC1溶 液提取时,多糖得率为0.73%. 2.2酸提法 稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖,但时间宜短,温度应不超过50?.经研磨机磨碎后的冬虫夏草菌丝 体,脱脂脱色后,用0.05mol/L的醋酸缓冲液(pH=6.0)提取多糖,得率为1.84%1引.虽然随着酸浓度的升 高,酸溶性多糖越来越多的溶解析出,但超过一定的酸浓度时多糖反而溶解性下降.如在提取虫草菌丝多糖 时,在2%HCI条件下,多糖的提取率最高,达到4.72%.因此,采用酸提法时,应选择适宜浓度的酸,以防止 糖苷键断裂. 2.3碱提法 碱提法适于碱溶性多糖的提取,可促使多糖溶出.如在5%NaOH条件下,虫草菌丝多糖的提取率最高 达到13.76%,为热水提取的2.63倍.但经碱法提取后的液体需要中和,后处理程序繁琐. 由此可见,不同的离子及其浓度对多糖的提取率影响很大.在一种离子作用下,特定多糖组分优先溶解 析出,但多糖组分溶解性大大降低.所以,单一离子很难使全部多糖溶解析出,若使用不同的离子顺序作用于 菌丝体,可以使得溶解性差别较大的多糖尽可能多地提取出来.如脱脂后的茯苓菌丝粉末,分别用热水,0.5 tool/LNaOH,88%的甲酸进行分级提取,可提取出6种多糖_1.此外,各项浸提参数如温度,时间,次数,固 液比等也是影响多糖浸提率的因素,可根据需要选取最佳工艺参数,以提高多糖 提取率. 3分离 多糖的分离方法很多,主要方法有超滤法,分步沉淀法,金属盐沉淀法,季铵盐沉淀法,纤维素阴离子交 换柱层析法,凝胶柱层析法,制备性区域电泳,毛细管电泳,醋酸纤维素膜过滤法,亲和层析法等. 3.1超滤法 在多糖等活性物的提取中由于目的产物浓度较低,一般在5%(质量分数)以下,需要浓缩这一重要工 序,目前国内大多采用减压热浓缩方法.该法不仅耗能高,也易引起活性物的变性失活,物系颜色加深等负面 影响,增加后续处理的负担.而膜分离技术具有设备简单,可常温操作,无相变及化学变化,选择性高及能耗 31卷第6期袁巍,潘宗琴,潘攀:真菌菌丝多糖的提取研究进展579 低等优点.张珏等[]研究了超滤浓缩醇沉提取发酵灵芝菌丝体多糖,与热浓缩醇沉提取法进行了比较,超滤 浓缩法提取的多糖粗提物量比减压浓缩醇沉法的少,还原糖和蛋白含量也低于减压浓缩醇沉法,但多糖得 率,多糖含量都比后者高,说明超滤浓缩法提取的多糖杂质少,含量高,可提高提取多糖的纯度和品质,相应 减轻了后道多糖纯化的负担,可大大降低生产成本.可见将膜分离技术应用于多糖的分离提取中,具有一定 的优势,采用超滤膜技术处理多糖具有收率高,不易破坏多糖的生物活性,能耗低等特点,适于工业化生产. 3.2分步沉淀法 根据不同的多糖在不同浓度的醇或酮中具有溶解度不同的性质,常用有机溶剂甲醇,乙醇,异丙醇及丙 酮进行分步沉淀,以充分提取多糖,提高多糖得率.如乙醇分步沉淀法提取多糖时,乙醇的浓度及提取方式对 多糖的得率影响很大,有时不同浓度的乙醇可沉淀出不同组分的多糖.一般情况下多糖的分子量越大,被沉 淀下来所需的乙醇浓度就越小,以30%,60%和80%的乙醇浓度为例,在低浓度乙醇(30%)时沉淀下来的主 要是高分子量的多糖和杂蛋白,在60%乙醇浓度时,沉淀下来的是中等分子量的多糖,杂蛋白相对来说少一 些,而在更高浓度下沉淀下来的则是较小分子量的多糖和低聚糖,还有一些蛋白质和多肽,故得率较低,可见 分步沉淀不仅能提高粗多糖的总得率,而且还起到一定的纯化作用,这为以后的纯化精制提供了方便.有研 究报道,采用乙醇分步沉淀法从香菇发酵液中提取胞外多糖可使粗多糖得率从一次性沉淀的3g/L提高到 3.8g/L.以0.25mol/LLiC1/DMSO作为溶剂,用丙酮与0.25mol/LLiC1/DMSO的混合物(V:V=4:1)作为 沉淀剂来分离灵芝水不溶性多糖,可分离出5种多糖【163. 3.3凝胶柱层析法 凝胶柱层析法是一种简单,快速的分离技术,但分辨率低,载样量少.常用的凝胶有葡聚糖凝胶和琼脂糖 凝胶,以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂,从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化.分离步骤如 下:pH=6时,酸性多糖被吸附在交换剂上,中性多糖不被吸附;然后用pH值相同,离子强度不同的缓冲液 ,中性多糖也被吸附.吸 将酸眭强弱不同的酸陛多糖分别洗脱下来;pH大于9时 附力一般随多糖分子中酸陛 基团的增加而增加,该法适用于分离各种酸性,中性多糖. 4结语 多糖提取过程中的各项技术方法都存在一定的局限性,有待进一步改进,在进行真菌多糖提取纯化时, 应根据多糖的性质,选用合适的提取纯化方法,不仅要考虑到多糖得率,还要保证不破坏多糖的结构及活性. 总之,随着各项技术的不断进步,在不久的将来,食药用真菌多糖制品在医疗,保健,食品等领域中的应用会 更为广泛. 参考文献: [1]葛玉,肖红.真菌多糖的研究开发现状[J].食品研究与开发,2005,26(1):23—25. ,连宾.食药用真菌多糖的研究与应用[J].食品与机械,2005,6(21):95—100 [2]王斌 [3]AKIHIRONakamura,TAROTakahashi,RYUJIYoshida.Emulsifyingpropertiesofso ybearlsolublepolysaccharide[J].FoodHydrocolloids, 2004,18:795—803. 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TheratioatcontentofDOCandMBCto TOCare5.23%一13.45%and3.09%一 8.82%respectively.Withthegreatinfluenceofdifferentexploitir蜒 mannersimposingonorganiccarbonandactiveingredients,themaximumcontentofTOC,DOC,MBCappears intimberedsoil,thenfarmlandisinthenext,andwastelandtakesthelowest.The?mparison ofratioat contentofDOCtoTOCinvarioussoilsistimberland2>farmland>wastelandwhereasitisfarmland>timber1and >wastelandtoMBC.Dynamicsofthehumicacidandtrendofthechangeincontentoftotaloraniccarbon tendedtobesimilar. Keywords:landuse;totalorganiccarbon(TOC);dissolvedorganiccarbon(DOC);microbia1bi0masscarbOn (M口EjC) - R--R.***- R- (上接第579页) [14]QILINHuang,YONGJin.Structure,molecularsizeandantiturnoractivitiesofpolysaccharidesfromPoriacOCOsmyceliaproducedinfermenter [J].CarbohydratePolymers,2007,70:324—333. [15]张珏,章克昌.灵芝菌丝体多糖的超滤提取及其抗氧化活性的研究[J].化学世 界,2006,l:33—35. [16]YANFEIPeng,LINAZhang.Solutionpmpe~iesofwater, insolublepolysaccharidesfromthemyceliumofGan0de舯atsugae[J]. CarbohydratePolymers,2005,59:351—356. 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