【doc】 中华眼镜蛇毒组份的抗肿瘤研究进展

【doc】 中华眼镜蛇毒组份的抗肿瘤研究进展 中华眼镜蛇毒组份的抗肿瘤研究进展 2005年第17卷第4期蛇志JOURNALOFSNAKEVo1.17No.4.2005 中华眼镜蛇毒组份的抗肿瘤研究进展 „梁世杰,李维平. ,广东广州510182;2.深圳市第二人民医院神经外 (1.广州医学院03级 科,广东深圳518003) [中图分类号]R646.05;R730.54[文献标识码]A 药物治疗是肿瘤治疗的一个重要组成部分,对 抗肿瘤药物疗效的筛选评价是肿瘤基础和临床研 究的重点之一.中华眼镜蛇毒(NajaN口 ActraVenom,N.N.A.V)一直是国内外抗 肿瘤药物研究中的重点生物源毒素之一.本文作 者就中华眼镜蛇毒组份抗肿瘤的研究,作一综述. 1中华眼镜蛇毒用于抗肿瘤研究的组份 1.1中华眼镜蛇毒膜毒素(NNAV—CT)蛇毒 膜毒素是蛇毒的主要毒性组份之一,蛇毒膜毒素 是由60~63个氨基酸残基组成的含大量疏水性残 基的强碱性多肽,由4个二硫键交叉连接的单链 组成.具有三指形结构(three-fingershape),4 个二硫键聚集在一起形成一个致密的内核,由此 核心伸展出3个环就象3个手指.二级结构分析 结果显示它缺乏a一螺旋结构,主要由折叠组 成[1].在第三环和第二环之间的裂隙的大小与该 细胞毒的毒性正相关,而二级结构中的三重和两 重的反平行贝他折叠则是第三环移位的关键[2]. 研究证实,骨骼肌去极化因子,眼镜蛇碱,直接 溶血因子,细胞毒素,心脏毒素,以及中华眼镜 蛇毒的C组份,F组份和J组份,均是碱性多肽, 都作用于细胞膜,被称为膜毒素(Membranetox- in),都是属于眼镜蛇的膜毒素一族[3],约占蛇 毒蛋白含量的25,60,具有广泛的生物学活 性,能引起可兴奋性细胞如骨骼肌,心肌和神经 组织去极化,可增加细胞膜通透性,阻滞轴突传 导,以及溶解肿瘤细胞等口]. 1.2眼镜蛇毒因子(NNAV-CVF)眼镜蛇毒 因子(Cobravenomfactor,CVF),又称为眼镜 蛇抗补体蛋白(Cobraanti-complementarypro— rein),是眼镜蛇毒中的主要抗补体成分[6].20世 纪初Flexner和Noguchi即发现眼镜蛇毒具有抗 补体作用.到20世纪60年代,Nelson,Muller 等发现眼镜蛇毒中抗补体的主要成分是CVFL7]. 1994年Fritzuger等还克隆得到了CVF的cDNA 序列.CVF是一种带负电荷较多的球状糖蛋白分 子,由a,p,丫三个亚基通过二硫键及其它非共 价键的次级键相互联接而成.链间通过二硫键及 [文章编号]1001—5639(2005)04—025I一04 其它非共价键连接[8].CVF含有寡糖链,其中a 链的含糖量高于p链.寡糖链是CVF活性必不可 少的结构,如用N一聚糖酶脱去肽链上的寡糖链, 则CVF的抗补体活性也随之消失[1...随着研究 的深入,发现CVF与人类补体C相似,不仅存 在交叉免疫反应,而且在氨基酸组成及序列,二 级结构,等电点,圆二色光谱分析,电子显微镜 超微结构等方面均有许多共同点,故认为CVF与 C.是同一祖先蛋白质进化的不同产物[1h].CVF 对温度有较好的稳定性,10,65?稳定,65?以 上迅速变性失活[13,14]. 2中华眼镜蛇毒组份抗肿瘤的研究 2.1中华眼镜蛇毒膜毒素(NNAV-CT)的抗肿 瘤作用(1)体外实验.NNAV—CT对体外培养 的多种动物和人的肿瘤细胞有溶解作用,能够强 烈破坏游离细胞,尤其是恶性肿瘤细胞.从印度 眼镜蛇毒中分离出细胞毒素组份,发现其破坏吉 田肉瘤的能力比破坏人或大鼠红细胞的能力强千 倍.Chaim等[11j研究了蛇毒粗毒和细胞毒素P 对鼠BF.黑色素瘤和鼠软骨肉瘤体内外的细胞 毒性作用,发现了很强的,不可逆转的细胞毒性 作用,且具有优先作用于肿瘤细胞的活性.谭 获[4]等观察NNAV-CT(组份C)对HL.等9株 白血病细胞系的毒性作用,量效关系及白血病细 胞经过NNAv-CT处理后的生物化学变化,结果 发现NNAV—CT对9株人白血病细胞系均有明显 的抑制作用,IC5.为0.0046~4.40/~g/ml,且呈较 好的量效关系(r为0.66,0.99).雷丹青L1叼等 检测NNAV-CT对人鼻咽癌细胞(CNE),淋巴 瘤细胞株(YAC),S..癌细胞株,人宫颈癌细胞 株(HELA)和卵巢癌细胞株(HOs...)体外细 胞毒作用,结果是NNAV-CT对体外培养的癌细 胞株有较强的抑制作用.(2)体内抗肿瘤. NNAV-CT在体内能引起肿瘤体积缩小,延长荷 瘤小鼠的存活时间,并抑制肿瘤的转移.李浩 淼[1.等采用腹腔注射NNAV-CT的方法,观察其 对荷S..小鼠瘤体重,结果显示不同浓度的 NNAv-CT均可不同程度抑制肿瘤生长,其中低 25】 2005年第17卷第4期蛇志JOURNALOFSNAKEVo1.17No.4,2005 浓度疗效最好,且随着用药时间的延长,抑瘤作 用更加明显.许云禄0等观察舟山眼镜蛇毒细胞 毒素一F(CTX-F)对小鼠肉瘤S..,宫颈癌Utt, 艾氏腹水癌(EAC)和P...白血病的体内抗肿瘤 活性,发现眼镜蛇毒CXT-F(即NNAV—CT)对 小鼠移植性肿瘤荷瘤小鼠具有实验性治疗作用. (3)临床研究应用.NNAV-CT在临床的研究应 用,报导不多.Plate等分离出细胞毒素,用于乳 腺癌,胃癌,胰腺癌,泪腺癌和梭形细胞肉瘤等 的临床治疗,能有效地控制癌症的发展,减轻病 人的痛苦,延长了患者的生命.国内蛇毒抗肿瘤 的治疗已在临床上广泛试用,主要用于治疗各种 中,晚期癌症,报道较多的有:肝癌,胃癌,食 管癌,结肠癌等消化道肿瘤和肺癌,其疗效主要 是改善患者症状,以精神,食欲,疼痛三大症状 好转明显,使肿瘤缩小,延长生存期.有应用蛇 毒明胶微球治疗肝癌患者,多有症状缓解,食欲 好转,体重增加,肿瘤不同程度缩小,AFP不同 程度降低,生存期延长.谭获【3等用静脉滴注眼 镜蛇毒组份治疗8例恶性血液病患者,结论是: 眼镜蛇毒组份有加强化疗药物的作用,静注无明 显近期毒副作用. 2.2中华眼镜蛇毒因子(NNAV-CVF)的抗肿 瘤作用众多的体外实验显示,CVF本身不引起 肿瘤细胞毒性,只是激活补体后攻击膜复合物才 发挥细胞毒作用.如Juhl[1等将导向GD.神经节 苷酯抗原的单抗3F.与CVF连接成3F.()z-CVF, 用于成神经细胞瘤,最大杀伤达98,CVF一单抗 结合物能促进肿瘤细胞特异性地摄入抗癌胚抗原 的抗体.进一步研究显示,不同的CVF一单抗结合 物对人神经母细胞瘤有不同的细胞毒性. WangE等报道CVF一单抗结合物对人鼻咽癌细胞 具有选择性的细胞毒作用,利用CVF和抗人鼻咽 癌单克隆抗体(BAC)偶联,发现CVF-BAC对 人鼻咽癌细胞株CNE2的细胞毒活性有明显的时 效和量效关系. 3中华眼镜蛇毒(NNAV)抗肿瘤的机制 3.1中华眼镜蛇毒膜毒素(NNAV-CT)的抗肿 瘤机制(1)对细胞膜的影响.研究揭示 NNAv-CT的主要作用对象是直接作用细胞膜, 但怎样使细胞崩解,现在还没有比较统一的认识. Dubovskiic?]认为NNAV—CT与细胞膜的磷脂结 合,使细胞膜受损.Jayaraman[1]认为细胞毒素 是通过抑制细胞膜上Na-K-ATPase,使其失 252 活,细胞内外Na,K比例失调,使葡萄糖等物 质不能偶联转运,从而导致细胞肿胀破裂.由于 各种细胞膜上的Na+_K+_ATPase构象不一样, 这又解释了NNAV—CT的选择性毒性.但Fleteh— er[等的实验表明,NNAV-CT是通过增强细胞 膜上Ca.+_Mg.-ATPase的活性刺激ATP水解和 Caz+的转运而改变细胞的状态,相同条件下, Na+一K+_ATPase和Na-Ca.转运机制不起作 用.而Sumandea[19]的研究认为是毒素芳香族侧 链的作用,该侧链用来修饰PLA.穿过细胞膜的 能力,不同的芳香族侧链作用于不同的细胞膜部 位,而磷脂酶A.(PLA2)进入细胞后干扰细胞 的信号转导起作用,这也解释不同细胞对 NNAv_CT的效应不同.NNAV—CT对细胞膜的 影响,干扰了细胞膜的完整性,从而使毒素更容 易进入细胞中,使NNAV—CT及其它抗癌药易进 入肿瘤细胞,从而说明NNAv.CT理论上至少有 抗肿瘤的协同效用.(2)诱导细胞凋亡的作用. 谭获【3]等观察NNAv_CT(组份C)对HL6.等9 株白血病细胞系的毒性作用,量效关系及白血病 细胞经过NNAV—CT处理后的生物化学变化,结 果:NNAv_CT能使一定比例的J6-1,562, HL..细胞发生凋亡,而且凋亡率也是随蛇毒浓度 的增高而增加.(3)降低血浆内皮素(ET)的作 用.陈凯云[2叩等在探索NNAV—CT对荷肉瘤S.. 小鼠ET的影响时,得出大剂量组荷S...肉瘤小鼠 的血浆内皮素含量明显降低(P<0.05)的结 果.ET是自然界广泛分布的多肽,与肿瘤的发 生发展密切相关,由于肿瘤的浸润,压迫及其自 身分泌,使荷肿瘤个体的ET升高,同时,ET也 能对肿瘤的进一步的发展和浸润有促进作用.(4) 对自由基的影响.龚海云L2的研究显示能够增强 肝癌细胞诱生型NO合成酶的活性,使NO增多, 而NO能使体内产生羟自由基及使脂质过氧化物 酶升高(LPO),从而影响蛋白质的交联,核酸的 合成及细胞膜的流动性,杀伤癌细胞.然而,有 的研究显示应用NNAv-CT则得出相反的结论, 认为NNAv-CT使自由基减少.具体的结论有待 研究. 3.2NNAV—CVF的抗肿瘤机制NNAV—CVF 的抗肿瘤机制是其激活补体的作用,激活补体后 使外周白细胞计数升高,吞噬和粘附作用增强, 可以加强机体对肿瘤细胞的清除作用[6].另外, 抗肿瘤特异性抗原或相关抗原的单克隆抗体(单 2005年第17卷第4期蛇志JOURNALOFSNAKEV0l-17No.4,2005 抗)可与肿瘤细胞结合,但一般元细胞毒性.由 于NNAV—CVF作为导向药物的效应分子,具有 选择性高,毒性小的特点.作为免疫导向的研究, 正在开展. 4中华眼镜蛇毒的抗肿瘤研究前景 目前在中华眼镜蛇毒膜毒素(NNAV-CT) 的抗肿瘤研究中存在不少问题.(1)基础研究滞 后,比较前沿的研究都在国外,尤其是关于 NNAV—CT的结构,组份的分离,筛选和作用机 制的研究.(2)由于各个研究机构的分离方法和 研究方向不同,使得NNAV—CT各组份的命名混 乱,既不利于交流,也可能造成重复立项.(3) 关于NNAV—CT的抗肿瘤研究,体外的实验较 多,临床的实验Z项较少,说明我们有很多的工 作要做. 关于中华眼镜蛇毒因子(NNAV—CT)的抗 肿瘤研究方面:如何减小CVF和单抗偶联物的体 积,以便进入实体瘤的内部,有待进一步研究. 此外,国外的学者在研究蛇毒的组份后,采用生 化手段人造蛇毒以降低研究成本,同时也防止生 物毒素因物种的减少和灭绝而丧失.值得我们借 鉴. [参考文献] Jayaraman-G,Kumar-T-K,Tsai-C-C,eta1. Elucidationofthesolutionstructureofcardiotoxin analogueVfromtheTaiwancobra(Najanajaatra) ———— identificationofstructuralfeaturesimportant forthelethalactionofsnakevenomcardiotoxins [J].Protein-Sci,2000,9(4):637—646. 许云禄,吴国土,林建忠.舟山眼镜蛇毒细胞毒素 一 F的体内抗肿瘤作用[J].福建医科大学, 2003,37(3):298-300. 谭获,应红光,郝玉书,等.中华眼镜蛇组份抗 白血病实验及初步临床应用研究[J].中国现代 医学杂志,19199,9(12):22-23. 梁敏仪,陈家坤,朱蔚云,等.蛇毒心脏毒素对荷 瘤小鼠的抗肿瘤作用初步研究[J].蛇志,1998, 1O(2):1—4. VogtW.Factorsincobravenomsaffectingthe complementsystem[J].Toxicon,1982,20(1): 299. 叶春玲,黄守坚,孙家钧,等.一种从蛇毒中分离 提纯抗补体因子的简便方法[J].中国药理学通 报,1997,13(1):85-87. VogelCW,SmithCA,Muller-EberhardHJ. [83 [93 [1O] [11] [123 [13] [143 [15] [163 [173 [18] [193 Cobravenomfactor:structuralhomologywiththe thirdcomponentofhumancomplement[J] . 1mmunol,1984,133(6):32—35. FritzingerDC,BredehorstR,VogelCW.Molec— ularcloningandderivedprimarystructureofcobra venomfactor[J].ProcNatlAcadSciUSA,1994, 91(26):12775. GowdaDC,PetrellaEC,RajTT,eta1.Immu— noreactivityandfunctionofoligosaccharidesinCO— brevenomfactor[J].Immunol,1994,152(6): 2977—2986. 雷丹青,刘绵林,蓝利,等.广西眼镜蛇蛇毒 细胞毒素的抗肿瘤作用[J].实用癌症杂志, 2004,19(2):127—131. Chaim—MatyasA,BorkowG,OvadiaM.Isolation andcharacterizationofacytotoxinP4fromtheven- omofNajanigricollispreferentiallyactiveon tumourcells[J].BiochemInt,1991,24:415— 421. 李浩淼,杨惠玲,李爱民,等.中华眼镜蛇毒对 荷s..小鼠抑瘤作用及其机制初探[J].河南中 医,2001,19(2):19—22. PlateGJH,Maracaibo-Zulia,Venezucla,eta1. Crotoxincomplexascytotoxicagent[M].United StatesPatent,1992.5164196. JuhlH,PetrellaEC,CheungNK,eta1.Additive cytotoxicityofdifferentmonoclonalantibody——CO-- bravenomfactorconjugatesforhumanneuroblas— tomacells[J].Immunobiology,1997,197(5): 444. WangXM,HuangSJ.Theselectivecytotoxicity ofcobravenomfactorimmunocojugateoncultured humannasopharyngealcarcinomaacellline,1999, 18(2):71. Duhovskii—P—V,Lesovoy-I)_M,Duhinnyi-M—A, eta1.InteractionoftheP-typecardiotoxinwith phospholipidmembranes[J].Eur-J-Biochem, 2003,270(9):2038-2046,0014-2956. Jayaraman-G,Krishnaswamy-T,eta1.Bindingof nucleotidetriphosphatestOcardiotoxinanalogueII fromtheTaiwancobravenom(Najanajaatra). Elucidationofthestructuralinteractionsinthe dATP-cardiotoxinanalogueiicomplex[J].J—Biol- Chem,1999,274(25):17869-17875. FletcherJE,JiangMS.Possiblemechanismsof actionofcobrasnakevenomcardiotoxinsandbee venommelit-tin口].Toxicon,1993,31:69. Sumandea—M,Das-S,Sumandea—C,eta1. 253 ]]]]]]]I=lI!J 2005年第17卷第4期蛇志JOURNALOFSNAKEVo1.17No.4,2005 Rolesofaromaticresiduesinhighintedacialactivi? tyofNajaaajaatraphospholipase[J].Bio— chemistry,1999,38(49):16290?16297. [2O]陈凯云,李爱民,等.中华眼镜蛇毒对小鼠肉瘤 S的抑制作用和血浆内皮素的影响[J].癌症, 2000,19(12):1116-1118. [21]龚海云,余清声,管锦霞,等.眼镜蛇毒直接溶 解因子对人肝癌细胞株H7402产生NO和LPO的 影响[J].中国病理生理杂志,1998,14(1): 18. 大咯血的病因和治疗进展 黎月莲 (梧州市红十字会医院呼吸内科,广西梧州543002) [中图分类号]R441.7[文献标识码]A[文章编号]1001—5639(2005)O4一O254—03 气管,支气管和肺出血,经咳嗽由口腔咯出粘液瘤.全身性疾患亦可表 现为咯血为主,如血 者称为咯血.而大咯血为1次咯血量?lOOml或小板减少,白血病,血友病,DIC,抗凝治疗及 24h?500ml,但部分病人咯血存于气道或吞人食其它血液病,由于出凝血障碍所致咯血.物理因 管,胃,准确估计出血量较难,故有大口咯血,素,如外伤,巨响,振荡均可致大咯血.了解咯 伴心悸,面色苍白,血压下降,脉沉细,冷汗等血的病因复杂,有助于医生广开思路,避免误诊. 重症体征,症状均应视为大咯血.2大咯血的诊断 1大咯血的病因大咯血是内科急危重症,但须明确咯血与上 大咯血的病因复杂[1],最常见的是支气管扩呼吸道出血,消化道出血的鉴别,三者血液均从 张,肺结核,肺部肿瘤.实际上病因包括病原微口腔流出,但治疗方法各有不同,故在开始治疗 生物(如细菌,支原体,衣原体,病毒,寄生虫,前应迅速准确判定出血部位,以免延误治疗时机. 真菌,螺旋体,阿米巴原虫等)及其毒素,代谢来自上气道出血,特别是后鼻道出血,鼻,口腔 产物均可致气道水肿,充血,细胞浸润,血管损同时喷血者及可疑上气道血流人口腔喷出者,应 伤,炎性坏死,气道阻塞,肺不张,肺炎,坏死,在良好照明条件下,检查咽 喉,必要时触摸咽后 空洞导致大咯血.有些感染性肺疾患可以咯血为有无血管瘤,或请专科医生会诊.区别呕血与咯 首发或主要症状,如出血热,钩端螺旋体病,肺血,一般并不困难,但大量咯血而又咽入消化道, 阿米巴病,肺囊虫病,肺吸虫病,AIDS病人合或老年人患食管裂孔疝,出血积存于疝囊,晨间 并卡氏肺囊虫病等.至于肺结核,肺霉菌,肺脓突然呕吐而误为”晨间咯血”.从咯出血颜色,有 疡等咯血机率更高.肿瘤,不论良,恶性,原发无泡沫,混有胃物还是痰液,是否为碱性, 于肺或转移瘤,均可引起大咯血,特别是合并空伴呼吸道抑制或消化道症状,结合病史,体检, 洞时.肺血管病,如支气管动静脉瘘,遗传性毛不难鉴别.但切忌根据有黑大便即诊断为”呕 细血管扩张症,原发性肺动脉高压及肺栓塞.近血”. 年来风湿类疾病(包括结缔组织病)引起肺血管 炎导致的肺泡出血,引起大咯血.这里特别应提 到”肺小血管炎,,[引,如Wegener氏肉芽肿,肾 炎一肺出血综合症(Goodpasture?Ssyndrome),显 微镜下多血管炎,白塞病合并血管瘤大咯血十分 常见.非感染性肺内病变,如外源性过敏性肺泡 炎,过敏性肺炎,肺泡微石症,尘肺,结节病, 肺含铁血黄素沉着症以及肺结构异常,如支气管 肺囊肿,隔离肺合并感染时,亦可致咯血.子宫 内膜异位症,又称月经性咯血,常伴来经咯血. 尤其要提到的是心源性咯血,最常见的为二尖瓣 狭窄所致大咯血,其次为急性左心衰竭,左心房 254 3大咯血的治疗 大咯血的治疗[1.]最重要的是防治”咯血窒 息”,病人往往有面色苍白,烦躁,喉头噜噜作响 的”先兆”,对咯血患者要加强巡视,对反复大量 咯血者或有发生窒息的可能者,应随时准备抢救 器械于床旁,利于不失时机地急救.大咯血来势 凶猛,尽快抬高病人头部,使口腔与气管通畅; 及时清理口腔积血,取出义齿等口腔异物,必要 时拦腰抱起病人,充分利用负压吸引器,吸引管 口径应足够粗,要有侧孔,尽快吸出积血,千万 不要怕病人”出血太多”,让病人”憋住”“少出 血”,这样会导致出血造成窒息.同时尽快开放静