山羊卵巢腔前卵泡卵母细胞的采集

山羊卵巢腔前卵泡卵母细胞的采集 县农业科.1997…,30(4)?=:cmntiaAr】cultura~mtca 山羊卵巢腔前卵泡卵母细胞的采集 盟—堡—盈李裕强V—————'',_.-_——一 (西北农业大学发育生物学研究室.陕西杨馥712100) CollectionofPreantra!FollicularOocytes fromGoat0varies 3 / 7l RuiRongZhangYongLiYuqiang (厶?.,o,DevelopmentalBiology,NorthwesternmricalturalUniversity.Yangling712100) AbstractTlheisolationofpreantralf0lliclesfromgoatovarieswasperformedusing tWOmethods.Method1.TheovarieswereCUtintosmallpieceswithscissorsandwereput into1eollagenasemediumfor15,25rain(prepubertygoats)or45,60rain(adult goats).Thenthesepiecesweresqueezedwithrubberpolicemaninameshfilterandthe preantra1follicularoocytesdroppedintoMEMmediumoutsidethemeshfilter.Method2. TheovarieswerecUtintosmallpieceswithatissuechopper.Theobtainedsuspensionwas filteredsuccessivelythrough450andZOOp.rnmeshfilters.Method1resultedin189.5O士 79.87(~3month—oldgoat),83.40士49.O2(3,6month—oldgoat)and30.00士14.18 (adultgoat)preantralfollicularoocytespergoat,respectively.Thismethodwaaavailable fortheisolationofpreantralfolliclesfromprepuberrygoatovaries.Method2resultedin 68.00~5.29preantralfollicularperadultgoatandwaasuperiortomethod1intheisola— tionofpreantralfolliclesfromadultgoatovaries. KeywordsGoat;Preantralfollicles;0ocytes;Collection 关薯词,竺一!塑堕多L 从卵子发生角度看,参与受精后一系列生命活动所需的调控物质早在卵子发生早期就 已产生,贮存.因此,无论从体外生产成熟卵子角度还是从研究卵子发生机制的角度,腔前卵 泡卵母细胞已受到愈来愈多的重视.取得家畜腔前卵泡是开展众多相关研究的基础,且难度 较大.为了解决腔前卵泡卵母细胞的来源问题,笔者在研究山羊腔前卵泡卵母细胞体外发育 与成熟的过程中,试图建立一套有效的山羊腔前卵泡卵母细胞采集方法,以期为进一步研究 其体外成熟机制奠定基础. 收蒋日期1996—04—15 *国家自熊科学基金资助项目和农业部辞技攻关珥目, 4期芮荣等:山羊卵巢腔前卵泡卵母细胞的采集 1材料与方法 1.1卵巢来源 6月龄以内的初情期前山羊11只购自西北农大附近农村,手术摘除卵巢,置37,39? 生理盐水(用时添加200IU/ml青霉素和2ODg/m】链霉素)内备用;成年山羊8只为本实验 室超排采卵或移植手术2次以上淘汰羊,年龄3,6岁,原购自西北农大附近农村,手术摘除 或屠宰后无菌采取卵巢,置37,39?生理盐水中,恒温下1h内送回实验室备用 1.2腔前卵泡卵母细胞的采集 方法1;将采集的卵巢用含2001U/ml青霉素和200~g/ml链霉素的生理盐水清洗1,2 次;剪去韧带,系膜等结缔组织,沿卵巢门切开,去掉髓质及黄体组织,再用37,39?杜氏磷 酸盐缓冲液(PBS)清洗2次;吸去组织面液体,置培养皿内;用眼科剪剪碎卵巢组织(碎块 <3ram),加入1呢瞍原酶液(以无血清MEM培养液配制),置于38.5?CO培养箱内培养 15,25rain(<6月龄山羊)或45,60rain(成年山羊);取出用?1mm吸管吹打15,20次, 并装入带盖刻度离心管内;以1000r/rain离心lmin,去掉上清酶液,反复洗2,3次后将组 织块置于~450Wa网筛内;用橡皮警反复挤压组织块,使腔前卵泡卵母细胞落入网筛外 MEM培养液中,移去阿筛,回收渡装入离心管内离,O(1O00r/min,lmin)弃上清,收集沉淀 并用lOmlMEM培养液+5FCS稀释,恒温水浴锅内静置3,5rain检卵. 方法2:将方法1清洗的卵巢吸去表面液体后,卵巢表面向上平铺于组织切碎机工作台 横,斜向切割每个卵巢}将悬液倒入 上;调整切距为40m,沿卵巢纵轴分别依次以纵, 450pm网筛内过筛,再将留在筛内的大块组织收集于组织切碎机上按前法重新切割,过筛} 过筛液用?5.0m吸管吹打20次,其悬液再用c)200~ra网筛过筛;过筛液收集于离心管 内离,5~(1000r/nfin,1min)沉淀,弃上清液,收集沉淀并以lOmlMEM培养液+5FCS稀 释,恒温水浴锅内静置3,5rain检卵". 1.3卵泡和卵母细胞直径测量 有泡膜包被的腔前卵泡,测量其泡膜内缘直径;无泡膜但有数层颗粒细胞包被的腔前卵 泡测量其外观最外缘直径;裸卵测量其透明带外径}有颗粒细胞包被的卵母细胞则测量其镜 下最清晰透射影像外径. 1.4腔前卵泡卵母细胞的判断及质量评估 1.4.1判断标准(1)未用胶原酶处理者常有清晰泡膜,且卵泡较圆;(2)包被颗粒细胞1 ,4层;(3)卵泡直径<150m;(4)卵母细胞直径<108}(5)卵母细胞已有透明带 1.4.2质量评估大体分成可用卵和裸卵两大类.裸卵划为C级可用卵包括A,B级,A 级;有1,4层完整颗粒细胞包被,卵母细胞胞质均匀,胞质中无异常颗粒,无大型卵黄泡状 物,颗粒细胞和卵母细胞结合紧密,无损伤;B级:颗粒细胞包被不完整,卵母细胞胞质基本 均匀,无损伤 2结果与讨论 2.1方法1对不同年龄山羊采卵效果的影响 由表1可见,用方法1采集山羊腔前卵泡卵母细胞以3月龄以内的山羊效果最佳,平均 每只羊可获得189.5O枚腔前卵泡,其中可用卵平均为58.17枚随着山羊年龄的增加,该法 中国农业科学30卷 采卵效果显着下降,3,6月龄山羊平均采卵数明显减少,用于成年山羊效率更低.笔者在试 验过程中感到,缺少橡皮警的挤压作用,腔前卵泡回收效果就很差,甚至回收不到腔前卵泡. 由于山羊卵巢随年龄增加,其结缔组织逐渐增多,因而使用该法的效果也随之下降.一般说 来,初情期前山羊卵巢结缔组织较少,剪碎较易,酶处理效果较好,因而通过挤压作用采卵率 较高.而成年山羊卵巢结缔组织很多,不易剪碎,酶处理效果也不确切,使用该法则效果不理 想因此,该法是适用于初情期前山羊卵巢腔前卵泡卵母细胞回收的有效方法. 表1方法1对不同年龄山羊噪卵效果的影响 Table1Effectofmethod1oncollectionofpreantralfolliclesfromgoatovariesatvariousages 2.2成年山羊腔前卵泡卵母细胞的采集 由表2可见,采用方法2采集成年山羊腔前卵泡卵母细胞,效果明显优于方法l(P< 0.05).我们在使用方法l进行成年山羊的采卵试验过程中发现,必须选择另外的方法才可 取得回收成年山羊腔前卵泡卵母细胞的突破.本试验参考了Figueiredo等的操作程序,建立 了用于山羊腔前卵泡分离的方法2.用该法采集腔前卵泡,每只山羊平均获得68枚腔前卵 泡,尚低于Figueiredo等在牛每头平均采卵298枚.笔者认为,方法2采卵数偏低的原因可 能有三:(1)尚未掌握最佳配套条件;(2)山羊年龄偏大,又经过数次超排处理,因而从客观上 减少了腔前卵泡数,增加了采卵难度;(3)Figueiredo等报道的数据中包括了初级卵泡卵母 细胞,而奉试验过程中舍弃了初级卵泡. 衷2两种方法采集成年山羊腔前卵泡卵母细胞的效果比较 Table2ComparisonoftheresultsbetweentWOcollectingmethodsforadultgoats 参考文献 1FigueiredoJR,ctal—Developmentofacombined呻wmechanicalandenzymaticmethodfortheisolation.fintact 即nEffQIllclesfrom建taI,calfandad~Itbovineo睇fs.Thed~geaology19934仉789~799