【doc】人胎肝细胞裂解液对照射小鼠多能造血干细胞的影响

【doc】人胎肝细胞裂解液对照射小鼠多能造血干细胞的影响 人胎肝细胞裂解液对照射小鼠多能造血干 细胞的影响 182 培养条件下以及移植后的发育情况.采用聚合 法使WistaF-Imamichi大鼠和ICR小鼠的早 期胚胎聚合为一体,然后用于体外培养,并进 行移植.实验结果明,大小鼠异种间嵌合胚 在含2O%FCS的Whitten溶液中有80.8%的 胚可发育为囊胚期胚胎.这种胚胎在受体大鼠 和小鼠,均能着床,着床率分别为51.3%和 53.7%,没有显着差异.着床后的胚胎能够维 持到妊娠第1O天左右,但以后很快退化,死 亡,其原因有待进一步探索. 参考文献 [1]LulieAnnMiller,1084.Bioscience,Vo1. 7 1992,台: 54,?5,290. [2]Tarkowski,A.K.,1961,Nature,190l 857—86O. [3]Mintz,B.,1964.J.Exp,Zool,.157:85— 292.-. 100,273— [4]SternM.S.,1973,Nature,Vo1.243, June,22,472—473. [5]高侨文明.藤代克彦等,1986,哺乳卵研志, Vo1.3No273一-77. [6]Tachi,S.,Tachi,C.,1980,Develop,Bio1. 80,18—27. [7]Tarkowski,A.K.,1O62.J.Embryo|. Morpho1.10,476—49. f2一f 人胎肝细胞裂解液对照射小鼠多能造血干细胞的影响 史剑篷叁v生建平徐萍丁志圣罗伟华莫素珍 (上海医科大学放射医学研究所200032) 在胎肝移植输注中,人们已经注意劐除造 m细胞对患者造血功能的支持和替代外,还有 造血刺激因子的作用.本文采用内,外源脾结 节测定法和流式细胞术,观察了人胎肝细胞经 反复冻融裂解后的胎肝细胞裂解液(fetalliver lysate,FLL)及其洗脱峰组分对受照小鼠多能 造干细胞的影响,为胎肝移植有效作用机理 提供实验依据. 材料和方法 1.动物及照射条件1o一12周龄的BALB/C及 ICR雄性小鼠,体重24?2.5gt鲫CoY射线,照射距 离80cm,剂量率1.0Gy/min. 2.FLL制备及分膏从妊娠4—5月的水囊引产 胎儿中厄菌取出肝脏,制成单细胞悬液,以生理盐水 洗涤后调整细胞浓为1×10'个细胞/ml,反复冻融 破碎细胞,4?22500×g离心,20min,取上清液,此 即为FLL.经SephacrylS-3OO凝胶柱(瑞典Pharm— acia生产)过滤洗脱FLL,以280rim紫外分光光度法 及Hartree盼试剂枪测FLL洗脱液组分的蛋白含量, 并经聚内烯酰胺凝胶电泳确定各洗脱峰的分子量范 围. Rz予' S.外源性牌结书测定经6Gy照射的供体小鼠 于照后24h腹腔注射FLL1ml/鼠,并将其照后3, 7,1O和15天之股骨骨髓,由尾静脉输注至经8Gy 照射的受体小鼠,按Tillf;jMcculloch法进行脾结节 (又称脾结节生成单位,CFU-S)测定. 4.内源性脾结节测定及细胞周期分布分析经 7.5Gy照射的小鼠于照后24h腹腔注射FLL或各峰 组分1ml/鼠,于照后9天杀鼠取脾,计数脾凸面的 结节数;然后切取脾结节,以PBS制成单细胞悬液, 洗涤后乙醇固定.取细胞1X10/管,洗涤后加入 RNase40u/管,37?温有30min,然后加PI50.g/ ml,在流式细胞仪FACSTARPLUS上进行细胞周 期分析.本实验细胞变_片系数(CV)值为5.66? 0.9. 结果 1.层析后的FLL各蜂组分蛋白含量和分 子?范围层析FLL可以得到5个峰蛋白组 分,以峰4,峰5的蛋白含罩为最低,分子最 也最小(表1). 1,志 杂 灾州胞绌 1?何 同 第14卷第4期细胞lL丰物学杂忐 表1FLL各峰组分蛋白含量和分子量范围 表2FLL对受照小鼠骨髓CFU—S的 影响(又?sE) 时间俐FLL处理组 (天)数() 对照 组 0.03?0.01 0.l9?0.O4 0.34?0.08 3.3:?0.72 o 7 10 15 与对照组相比P<O.01. 以正常小鼠骨髓含有4813?372个CFU—s/ femur为100%. 2.FLL对受照小鼠外源性脾结节生成的 影响FLL处理组7,10和15天测得的小鼠 骨髓CFU—S值都明显高于对照组(表2). 3.FLL及其峰组分对小鼠内源性脾结节 生成的影响FLL处理组小鼠的内源性脾结节 数明显高于对照组,其中以峰4,峰5组分的 作用最为明显(表3). 4.FLL及峰5组分对内源性脾结节细胞 周期分布的影响FLL处理组及峰5处理组的 表5FLL及各峰组分对小鼠内?性脾结节生成的影响(?SE) 与对照组相比P<c.05."与对照组相比P<0.01o 表4FLL及峰5组分对细胞周期分布的影响(X?sD) 例数 FLL组 峰5组 对照组 G1/0 62.95?8.10 63.O5?9.00 83.3O?6.15 S 24.73?4.98 29.O5?8.42 12.8O?7.31 G2M 细胞增殖状态(S+GM期),分别为37.05? 8.11,36.95?9.00%,明显高于对照组(表 4).r ' 讨.论 我们在动物整体研究中已经证明,FLL能 提高Y射线大剂量照射小鼠的存活率,增加受 照小鼠外周血网织红细胞和白细胞水平,同 样,在离体培养中亦证实胎肝细胞含有粒系和 红系造血的刺激物,.这些结果促使我们试 图从多能造血干细胞水平来探讨FLL中是否 还存在着CFU—S增殖的刺激物?在FLL中又 是何种组分在发挥作用?……1-…,~-r"一/~-FLL含 ?L 有CFU—S的增殖刺激物,在FLL中,峰4和 峰5是CFU—s增殖刺激作用的活性成分. CFU—s是由脾结节生成细胞经过一定时 问的细胞增殖与分化而生成,而脾结节生成细 胞主要存在于成年小鼠的骨髓中,它可以在照 射小鼠脾中不断地分化成熟?. 正常机体的造血功能由于CFU-S含量的 稳定,通常维持在动态平衡状态,而保持 CFU-S数量的稳定可能取决于CFU-S增殖调 控物质的浓度及活力的相对恒定.一旦造血干 细胞大量损伤,稳定机制即遭破坏,造血细胞 数量的大幅度降低可使CFU-S增殖刺激因子 的活力增加,体内残存的造血干细胞即从Go *} 2279u O191 ???? 0OO2 ??+一? 471O O4O2 ??o? OO_06 0 954 ??? 421 +一+一+一 3O8 398 ??? 273 期提前进入增殖周期进行适应性调节.我们在 以胎肝细胞裂解液处理照射小鼠脾结节测定的 实验中,发现无论是外源性还是内源性CFU-S 形成的实验,均获得了相似的结果,即FLL 能够明显增加照射小鼠骨髓中残留的造血干细 胞在脾脏形成CFU-S的能力.细胞周期分布的 实验也证明了这点.我们对FLL进行层析分 离,分别得到了分子量大小不等的5个组分. 实验结果表明,分子量<70KDa的峰4,峰 5具有明显促进小鼠内源性脾结节的形成能 力,而分子量较大的峰1,2,3的促进作用则 不明显I流式细胞术的分析也表明,峰5能明 显增加脾结节生成细胞的增殖率,加速G1/0 期细胞进入周期,这与Cork报道以5-FU自 杀率胎肝细胞培养上清液组分?(分子量 30—50KDa)的促细胞增殖能力的实验结果相 一 致【.值得注意的是,峰4,峰5的蛋白含 量甚微,但促进CFU~S增殖的活性却很强, 提示FLL中这部分造血细胞生长刺激因子的 效价之高,是很值得进一步探索研究的. 综上所述,我们认为人胎肝细胞裂解液及 其组分 \8一 辐照小鼠造血干细胞的功能恢 复有明显促进作用.这可以部分解释胎肝移植 时造血干细胞虽无植入,但却明显改善了造血 功能的机理.看来进一步分离提纯FLL的有 效成分,将是势在必行的工作. 摘要 本文采用内,外源脾结节形成测定法和流 式细胞术观察了人胎肝细胞裂解液FLL及其 峰组分在丫射线照射小鼠多能造血干细胞损伤 修复中的作用.证明照后24h给予FLL及峰 组分4—5能明显增加受照小鼠残存造血干细 胞形成CFU-S的能力,促进处于G1/0期的 造血干细胞提前进入增殖状态. 参考文献 [1]程文英等,1992,中华器官移植杂志,15. 11—13. [2]丁志圣等,1992,医学生物物理学杂志,5. 5—8. [3]史剑慧等,1992,医学生物物理学杂志,5: 1--4. [4]Wright,EG.eta1.,1987.CellTissue Kinet.,20:191—2O3. [5]Cork,MJ.eta1.,1986.BrJHaemato. fogy.,63:775—783. 人胎胸腺上皮细胞的培养及其上清液中胸腺激素的测定 — 丝堡查查洪庆 (上海市第一人民医院儿科200080) 体外培养人胎儿胸腺上皮细胞的移植, 是巳被用于临床的一种免疫疗法.为有助于 了解这种疗法的机理,本文从细胞形态学及生 物学功能方面,对体外培养胎儿胸腺上皮细胞 进行了研究.结果表明,体外短期生长的胸腺上 皮细胞仍保持了上皮细胞的特性.用生物学方 法检测培养胸腺上皮细胞上清液(ThymicEp— itbelialSupernatants以下简称TES)证明其具 有类似胸腺激素样作川,从而说明上皮细胞在 27. 体外培养的条件下,仍能保持其分泌胸腺激素 的功能. 材料和方法 1.人胎儿胸腺上皮细胞的培养胸腺取自胎龄 18~22周的IIJL.将离体组织尽可能去除表面包膜和 其中的淋巴细胞,经洗涤后切成1,2mm.小块,接种 入培养瓶.用RPMI-1640培养基.每100ml中含2o 小牛血清,0.1mmol/L谷氨酰胺,2mmo~/LHepes 签匆日? 幽