细胞凝集反应

细胞凝集反应 科目 细胞生物学实验 实验题目 细胞凝集反应 日期 2013.03.14 姓名 *** 系 2011级生物基地 学号 *** 实验二 细胞凝集反应 一( 实验目的 1. 了解细胞膜的面结构; 2. 掌握凝集素促使细胞凝集的原理; 3. 学习研究细胞凝集反应的方法; 4. 用土豆凝集素诱导血细胞凝集，观察血细胞凝集现象; 5. 学习实验的平行、对照原则。 二( 实验原理 1.凝集素 凝集素(lectin)是一类含糖(少数例外)并能与糖专一性结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。目前已发现近千种植物中含有凝集素，在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物，人体的各种组织和器官中及某些病毒体内也含有凝集素。常用的有植物凝集素(phytohemagglutinin, PNA)，通常一起被提取的植物命名，如伴刀豆凝集素A、麦胚凝集素、花生凝集素和大豆凝集素等，凝集素是他们的总称。 土豆块茎凝集素(potato tuber lectin )是一种能结合几丁质的富含羟脯氨酸的糖蛋白，单体分子量约50, 000，包含至少三个不同的结构域，其中富含胱氨酸的区域与麦胚凝集素(wheat germ agglutinin ，WGA)等几丁质结合蛋白具有同源性。土豆凝集素含有 50% (质量分数)的糖组分，其中 90% 是阿拉伯糖，另有少量半乳糖;最丰富的氨基酸是羟脯氨酸，其次是半胱氨酸。土豆凝集素在水溶液中主要以单体形式存在，能与细胞膜寡糖链上的 N- 乙酰葡萄糖胺特异性结合，这是其具有凝集活性的主要原因。 2.细胞凝集 细胞凝集是指细胞彼此聚集在一起，成为一簇不规则的细胞团。细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。目前认为，细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。 在细胞表面，组成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖链，形成细胞外被(又称为糖萼)。凝集素引起的血细胞凝集(hemagglutination)，其细胞膜结构没有发生变化，与血液凝固中发生的复杂生物化学过程完全不同;另外，凝集素能与不同的糖蛋白特异性集合，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集，但是凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，因此，Ponder(1983)提出应称“凝集素组织化学”而不能称“凝集素免疫组织化学”。 凝集素使细胞凝集的原理是:它可以与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果。人们利用凝集素与不同的糖蛋白特异性结合的原理，识别和研究不同类型膜结构的生物学特征，以及进行血型鉴定。 三( 实验原理 1. 器材 离心机、离心管、滴管、注射器、双凹片、普通光学显微镜，等。 2. 试剂 土豆、PBS缓冲液、兔子静脉血、生理盐水，等。 四( 实验步骤 1.取土豆去皮块茎2克，加10mlPBS缓冲液，浸泡24小时，浸出的粗体液中即含有可溶性土豆凝集素。 2.抽取兔子静脉血(加抗凝剂)1ml，加生理盐水3ml，在1000r/min条件下，离心5分钟。重复三次离心，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成1%的红细胞悬液。 3(分别用滴管吸取土豆凝集素和1%的红细胞悬液各一滴，置双凹片的左孔内，充分混匀。 4(同时分别用滴管吸取PBS缓冲液和1%的红细胞悬液各一滴，置双凹片右孔内，充分混匀，作对照实验。 5.摇晃5-10分钟后，观察有无发生细胞凝集并置显微镜下观察。 6.先以白纸为衬托，直接观察双凹片凹槽内混合样品发生凝集的现象，注意左右 凹槽内不同现象的对比，对于发生凝集的一边注意观察凝集与不发生凝集的区 别。直接观察后在光学显微镜下观察两凹槽内现象的区别，并用照相机拍摄实 验结果。 五( 实验结果 1.实验现象记录及结果分析 实验组 对照组 试剂 土豆凝集素 PBS缓冲液 在振荡过程中，溶液中的红细胞渐在振荡过程中，红细胞不断向中间现象 渐凝集成颗粒状，逐渐聚拢，最后靠拢，最终形成中间颜色较深，边 在液滴中形成红色血细胞团。 缘颜色较浅的红细胞浑浊溶液。 结论 土豆凝集素可使血液发生凝集，PBS缓冲液不能使血液发生凝集。 3. 实验过程中宏观效果对比: 用肉眼观察，整个过程中，对照组中红细胞沉积在双凹片凹槽底部成大红点; 用凝集素处理的实验组，颜色越来越浅，透明度逐渐变高，最终，背景颜色变为透明，红细胞呈颗粒状聚集。 0min 实验组 对照组 说明:开始时，由于二者还没有充分混合，加入PBS缓冲液和加入土豆凝集素的两滴细胞悬液差异不大，此时还未发生细胞凝集作用。 5min 实验组 对照组 说明:5min后，两者对比已经比较明显，其中加入土豆凝集素的细胞悬液发生了细胞凝集现象，红细胞凝集在一起，呈颗粒状，周围的悬液较澄清，而只加入PBS缓冲液的未发生凝集作用，从整体上来看形成的仍为均匀的胶状液体。 10min 实验组 对照组 说明:10min后，加入土豆凝集素的细胞悬液细胞凝集程度更高，而只加入PBS缓冲液的几乎无变化，从整体上来看形成的仍为均匀的胶状液体。 4. 实验过程中微观效果对比: 实验组 (10×10) 对照组(10×10) 低倍镜下可以看到对照组中红细胞分布较均一，无凝集(右);实验组中，红细胞凝集在一起(左)。 六( 思考讨论 1. 哪些因素影响细胞凝集反应, 答: 影响细胞凝集反应的因素有很多，次实验中主要有以下两点:(1)温度。温度影响酶的活性。(2) 时间。随着时间的延长细胞聚集程度增大。 2.结合凝集素的特性，简述凝集素在生物学中有何应用,研究凝集素有何意义, 答:凝集素( lect in) 是一类具有糖结合专一性, 是可促使细胞凝集的蛋白质。凝集素对糖的特异结合性决定了它在动植物体内具有一些重要而特殊的生物学功能。利用这些功能, 凝集素在生物养殖、生物工程、生理活动调控、疾病防治等方面展示出广阔的应用前景。凝集素在临床疾病防治、机体生理活动调控以及生物工程等方面也展示出了十分广阔的应用前景。如:植物凝集素可抑制受精;细胞膜表面糖复合物的糖链结构与肿瘤细胞增殖、侵染、转移等发展过程密切相关，凝集素芯片技术实现了对癌症的快速、高通量检测，有助于筛选出癌症相关的糖链标志物。掌握凝集素的生物学功能, 对了解动植物的生物学进程、生理功能都有重要意义。 七( 注意事项 1. 浸出土豆凝集素时选发芽的或发青色的土豆,因其所含土豆凝集素可让血细 胞发生凝集。 2. 把液体滴加到双凹片上时，注意用量，防止悬液过多而溢出，使两个细胞悬 液接触，导致实验结果不可靠。 3. 滴加1%的红细胞悬液时，可适当的多加点儿，便于实验结果的观察。 4. 用手晃动双凹片时，注意摇晃的姿势:一只手用手掌处贴紧双凹片，另一只 手抵住双凹片的另一侧上下晃动。 5. 摇晃的时间可适当延长，提高红细胞凝集程度。