中华蟾蜍卵巢性类固醇激素受体的免疫细胞化学研究

中华蟾蜍卵巢性类固醇激素受体的免疫细胞化学研究 中华蟾蜍卵巢性类固醇激素受体的免疫细 胞化学研究 第29卷3期2006年6月安徽师范大学(自然科学版)JatmalofAnhuiNormalUniversity(NaturalScience)Vo1.29No.3 Jan.2006 中华蟾蜍卵巢性类固醇激素受体的免疫细胞化学研究 汪安云,吴孝兵 (安徽师范大学生命科学学院,安徽芜湖241000) 摘要:为探讨两栖动物卵巢内不同性类固醇激素受体在卵子发育中的调控作用.采用免疫细胞化 学方法,对中华蟾蜍不同发育时期卵泡中的雌激素受体,孕激素受体和雄激素受体进行了定位检 测.结果发现,三种受体在不同发育时期的卵泡中均有阳性反应:雌激素受体在卵黄合成期和卵黄 合成后期的滤泡细胞表达为强阳性,在卵母细胞胞质和核膜中呈弱阳性反应;孕激素受体在卵黄合 成早期的滤泡细胞和卵母细胞质,核膜中表达均较弱,在卵黄合成后期表达均增强;雄激素受体在 卵黄合成早期的滤泡细胞和卵母细胞胞质,核膜中表达也均较弱,在卵黄合成后期卵母细胞胞质和 核膜中表达略有增强. 关键词:中华蟾蜍;性类固醇激素受体;免疫细胞化学 中图分类号:Q492,5文献标识码:A文章编号:1001—2443(2006)03—0262—04 在脊椎动物的生殖发育过程中,雌激素受体,孕激素受体和雄激素受体发挥着重要的生理作用.随着蛋 白质化学的发展与放射免疫测定和免疫组织(细胞)化学技术的广泛应用,两栖类动物卵巢类固醇激素受体 的研究进展迅速,且在两栖动物已有报道?J,但仍存在分歧.中华蟾蜍(Bzgargarizans)属两栖纲蟾蜍 科,其卵巢中雌激素受体,孕激素受体和雄激素受体的分布尚未见报道.本文采用免疫细胞化学方法,对性类 固醇激素受体在中华蟾蜍卯泡发育中的分布进行研究,旨在进一步探讨类固醇激素受体在卵子发育中的调 节机制,以及中华蟾蜍生殖活动的特点和规律,并为两栖动物生殖生理学研究积累相关资料. 1材料与方法 1.1材料 雌性成体中华蟾蜍,共32例,体重33—98g.于2(X)4—03—10购自芜湖市吉和农贸市场,每月4例.解剖 取其性腺,切成数小块,浸入新配制的Bouin氏液固定24h,梯度酒精脱水,石蜡包埋,切片厚6tan. 1.2方法 切片脱蜡入水后,放入新鲜配制的3%H2o2溶液中10rain,抗原热修复15rain,然后采用SABC(strept avidin—biotincomplex)法进行免疫细胞化学反应.第一抗体分别为兔抗人雌激素受体(estrogenreceptor,ER, 兔抗人孕激素受体(progesteronerceptor,PR),兔抗人雄激素受体androgenreceptor,AR).4?孵育18h.第二抗 体为即用型羊抗兔I},室温下孵育20rain;再加SABC复合物,室温下孵育20rain;最后用二氨基联苯胺显色5 — 10rain.阴性对照片用PBS代替第一抗体进行孵育,为阴性反应.抗体及药品均为武汉博士德公司产品. 本实验统计了免疫染色反应的3种受体各10张切片,各5O个不同发育时期的卵母细胞.按阳性部位免 疫反应着色强弱,分为四级:+++为强阳性反应,显深棕色;++为中等阳性反应,显棕 色;+为弱阳性反 应,显浅棕色;一为阴性反应,显浅黄色或无色. 2结果与分析 2.1雌激素受体在卵巢中的分布(表1) 收稿日期:2006一O1—18 基金项目:国家自然科学基金(3o47O244);安徽省高校青年教师科研资助计划项目(No.2004jq123);安徽省优秀青年基金(N0,04043049) 作者简介:汪安云(1980一).女,安徽枞阳人,硕士研究生;E.mail:way1222@sohu.一;通讯作者:吴孝兵(1965一),男,安徽全椒人,教授,博士,博 士生导师,E.mail:wuxb@mil1.ahnu.edu.? 29卷第3期汪安云,吴孝兵:中华蟾蜍卵巢性固醇激素受体的免疫细胞化学研究263 在卵巢I一?期卵泡中,受体阳性反应广泛分布于滤泡细胞,卵母细胞胞质和核膜等部位.其中滤泡细 胞为中等阳性反应,卵母细胞胞质和核膜为弱阳性反应.?一?期,随着卵泡体积增大,滤泡细胞阳性反应增 强,呈强阳性反应(图版l:1—3). 2.2孕激素受体在卵巢中的分布(表1) 卵巢I一?期卵泡中,孕激素受体阳性反应定位于滤泡细胞,卵母细胞胞质和核膜.滤泡细胞呈弱阳性 反应,卵母细胞胞质和核膜星中等阳性反应.?一?期卵泡中,滤泡细胞阳性反应有所增强(图版1:4—6). 2.3雄激素受体在卵巢中的分布(表1) 在卵巢I一?期卵泡中,滤泡细胞,卵母细胞胞质和核膜均呈免疫阳性反应;?一IV期,雄激素受体阳性 反应定位于滤泡细胞,卵母细胞胞质和核膜,且阳性反应均有所增强(图版1:7—9). 表1中华蟾蜍不同发育时期卵泡中类固醇激素受体的分布 Table1DistributionofsteroidhormonereceptorsatdifferentstagesoffoUidedevelopmentof 邺ri蠲Ils +++强免疫阳性反应(sngimmunopo~itivereaction)++中等阳性反应(Miumpositivereaction)+弱阳性反应(Wtpositivereaction) , 阴性反应(N喇ivereaction)ER雌激索受体(Estrogenrecept0r)PR孕激素受体(Progesteronereceptor)AR雄激素受体(Androgenreceptor) Fc滤泡细胞(F0llidecel1)cpJ~(Cytoplasm)Nm~(Nuclearmembrane)Np核质(Nude0Pla8n1) 3讨论 3.1中华蟾蜍滤泡细胞,膜细胞性类固醇激素受体的分布与变化 Duda等[9用免疫组化方法对猪卵巢的雄激素受体进行了检测,结果发现雄激素受体在滤泡细胞核,膜 细胞核,黄体细胞核等中均有表达.雷忻等用免疫细胞化学方法对隆肛蛙卵巢进行了检测,发现雌激素受 体,孕激索受体和雄激索受体在不同发育时期的滤泡细胞和卵母细胞胞质,核膜中均有表达.方永强等_1.用 免疫细胞化学方法对文昌鱼卵巢中雌激素受体,孕激素受体和雄激素受体进行定位研究,结果发现:在小生 长期,三种受体通常定位在卵原细胞和早期初级卵母细胞的胞质或核膜;在大生长期和成熟期,则定位在胞 质和核质.我们的研究发现,三种受体免疫反应广泛分布于中华蟾蜍不同发育时期滤泡细胞和卵母细胞的胞 质,核膜等部位,同Duda和方永强的研究结果相似,与雷忻研究隆肛蛙卵巢类固醇激素受体分布特征一致. 但是与隆肛蛙相比较,在中华蟾蜍卵巢不同发育时期的滤泡细胞,卵母细胞中,雌激素受体,孕激素受体和雄 激素受体免疫反应的表达强弱程度不尽一致.中华蟾蜍和隆肛蛙都属两栖类无尾目动物,前者主要生活于水 田旱地及水沟池塘小河静水水域附近的农作物或杂草中,芜湖地区2月份产卵.后 者栖居于山区的溪流里,5 — 8月间产卵.它们的卵巢类固醇激素受体的分布特点存在一定共同点,体现了二者生殖生理的共性,但又 有一些不同点,这可能与它们的生活环境和繁殖习性不同有关,类固醇激素受体在卵巢中的表达不同也显示 了较大的种间差异. 3.2三种性类固醇激素受体与发育的关系 传统观点认为,类固醇激素受体主要存在于卵母细胞核.性类固醇激素受体与相应激素结合作为转录活 性因子,改变基因转录活动,从而调节卵母细胞的发育和成熟(过程较慢),可能涉及一种基因组作用机 制u引.本实验在中华蟾蜍卵母细胞核膜中观察到三种类固醇激素受体均有表达,暗示在中华蟾蜍卵母细 胞发育和成熟过程中,雌二醇,孕酮和睾酮也可能通过与核内受体结合,作为核内转录活性因子作用于DNA 的特定部位,改变基因的转录活动,从而调控卵母细胞的发育和成熟. 近年来,人们又发现另外一种调控方式,类固醇激素受体可存在于卵母细胞的胞质中,作为信号转导因 子通过快速的非基因组机制来调节类固醇激素在卵母细胞发育和成熟中的作用,可能是一种非基因组作用 机制_2】.Migliaceio等…在爪蟾中发现雌激素受体也可存在于卵母细胞胞质中,并发挥其信号转导作用;Bayaa 等[3对爪蟾孕酮受体转导卵母细胞成熟的研究发现卵母细胞胞质中有孕酮受体,且在去核卵母细胞中,仍能 激活分裂原活化蛋白激酶(MAPK),提出孕酮受体在胞质中有转导卵母细胞成熟的非基因调控作用;Lutz 264安徽师范大学(自然科学版) 等用免疫组化方法对爪蟾雄激 素受体的表达进行研究后发现,雄 激素受体广泛分布在卵母细胞中 包括质膜和胞质,因而认为其在卵 母细胞发育成熟中介导睾酮的活 动.这些研究都证明了两栖类卵母 细胞可能存在这种非基因调控机 制.本实验观察发现,中华蟾蜍各 期卵母细胞胞质中也均有雌激素 受体,孕激素受体和雄激素受体的 表达.因而推测在中华蟾蜍卵母细 胞胞质中,3种激索受体也可能作 为核外胞质信号转导因子,对卵母 细胞的生长,发育和成熟进行非基 因调控.结合上述分析,推测这两 2006定 叠 种调控方式在中华蟾蜍卵母细胞冈1中华蟾蜍卵巢类固醇激素受体的免疫细胞化学研究 中可能同时存在,相互协作,共同F'guunf~ytceh时0fsexteroidReceptorsinth.ovt}l.gargari~ans 控其誊育和成熟,但具体如何调嚣蝴j姐锅待进—由升r,乞?3ER免疫m性物定位在?期滤泡细胞×1000 实验还发现,三种类固醇激素4PR免疲阳性物定位在【J期早期卯母细胞胞膜,胞质100 受体在中华蟾蜍的各期滤泡细胞5PR免疫阳性物定位存JJ—m期卵泡的滤泡细胞,卵母细胞胞质,棱膜xlOO 中都有表达,尤其是雌激素受体表6PR免疫阳性物定位在?期卵泡的滤泡细胞x200 :0oo0 受体的表达研究发现,雌激素受体1ERlocatedinth.cyt洲ofI1earlystage00cx40 (3可在滤泡细胞中表达.Isola等n42ERlocatedinthefoUlclecell,cytoplasmandIluclesJrlnembraneof?stag(oocyte.×200 对鸡卵巢的孕激素受体进行定位3ERlocatedinthefolliclecellof?stageoocyte?×1ooo 窑孕煮竺4;Rlocatedinthecytoplasm,m,e删mbran—eofUearlystageooc硼yte..Rlocatedinthefolliclecell删.... 中显阳性.Duda等-9用免疫组化方:;R.0cmedi...ceu'.of?姆删x1oo 法对猪卵巢的雄激素受体进行了7ARlm甜jth.folli.1.ell,.帅l衄mandnu.llTIb呻.of?姆恤x100 检测,结果发现雄激素受体在滤泡 8ARlocatedinthefolliclecell,cytoplasmandnuclearmembraneofmstagee.x100 细胞核有表达.在两栖类对黑斑蛙9ARlocatedinI—m$tlt~follicl×40 (Rananiomaculata)和其他四种蛙注:一示免疫阳性物定位在滤泡细胞;H示免疫阳性物定位在卵母细胞的胞质,核膜;O示免 卵巢的射免疫测定法检测中发疫阳性物定位在卵原细胞的胞膜,胞质? 现滤泡细胞能产生孕酮和雌二醇,睾酮是孕酮和雌二醇转化的中间产物_】.故而推测在中华蟾蜍卵巢滤 泡细胞中雌激素受体和孕激素受体可能对雌二醇和孕酮的合成与分泌有重要作用,雄激素受体在三种激素 的转化和分泌中也可能有一定的调节作用. 参考文献: [1]MIGLIACCIOA,P1CCOIDD,CASTORIAG.ActivationtheSre/p2lro,dErkpathwayb yprogesteronereceptorviac舢一talkwithe8曲0g?r.cept0r [J].EMB0,1998,17:2008—2018. [2]CASTORIAG,BARONEMV,D1DOMENICOM,et.Non—transcfiptional~ctlonoft~stradlolandprogestlntriggersDNA8[J].EMBO,1999, 18:25OO一2510. [3]BAYAAM.BOOTHRA,SHENGY.Theclassicalprogestert~ereceptormediatesXenop u~oocytematurationthe#ftnongenomic脚chani锄[J].Pnas, 2000.97:2607—26I2. 【4]JINGDONGT,SAMMYK,ELIANBEIHHeta1.IdentificationofXPR-1,aprogesteronece0TrequiredforXen~so0cytemiwtion[J].Pn~.q, 29卷第3期汪安云,吴孝兵:中华蟾蜍卵巢性固醇激索受体的免疫细胞化学研究 265 20o0.97(26):14358—14363. [5]LUIZLB,COLELM,GUPrAMK,eta1.Evidencethatit/alr~llSathe删 IIystmoidspwduc~byXenopuslaevlsovariesandmayBit}IroIl曲the clicalandrogreceptortopromoteoocytematur~don[J].Pnas,2001,98(24):13724__13733. [6]LUVZLB.JAMNONGJITM,YANGWH,eta1.Selectivemodulationofgenomicnongenom/can目msesbyttnd~融群0rli孕nd8[J]. MolecularEndocrinology.20O3,17(6):1106—1116. [7]SKOBIJNAMN.F~cctsoftheantagonistoftheclassicalproges~mnereceptorollovulationandmaturationofcomn~l1(RanatemporariaL)eocytes invitro[J].ol1t蹭?ez,2O02,33(6):465—470. [8]雷忻.张肯辉.隆肛蛙卵巢类固醇激素受体的免疫细胞化学研究[J].西北农林科 技大学:自然科学版,20O4,4,32(7):33—36. [9]DUDAM,BUREKM,GALASJ,eta1.1mnmnohistochemicallocalizationofandrogenreceptorandaromatas~intheovaryofthepregnantpig[J].R印 Biol,2OO4,11,4(3):289—298. [1O]方永强,翁幼竹,胡晓霞.性类固醇激素及其受体在文昌鱼性腺和神经系统中 的分布[J].动物,2001,47(4):398—403. [11]IIAGCBIMK,AIMJ,OMALLEYBW.eta1.Analysisofthemechanismofsteroidhormonereceptor—dependentgeneactivationincell—freesystems [J].1,2adocrRev,1992,13:525—535. [12]rrRUSM,BEATOM,Steroidhormone 印:interactionwithdeoxyribonucleicacidandtranscrlptionactors[J].EndocrRev,1993,14: 459—479, [13]MADHABANANDAS,FRANKW.Differentialexpressionofestregenreceptor-aandestrogen一口intheratovary[J]y.Endocrinology,1999,140(2): 963—971. [14]ISOiAJ,KOf矾 JM,TUOHIMAAP,lmmunccytochemieallocaliratlonofprogesteronereceptorinthechick0vary[J].Endocrinology.1987,121(3): 1034—1040. [15]AHNRS.YOOMS,KWONHB.Evidencefortwocellmodelofsteoidogenesisinfourspeciesofamphibian[J],E印Zoo1.1999.284:91—99, [16]KWONHB.AHNRS.Relativemlesof凼删 andgl"d3111](1~acellsinOVaIianfollicularstereidogenesisontheamphibian.Rananigronu~culata[J].Gen CompEndc~fino1.1994,94:207—214. [17]KWONHB,CHOIHH,AHNRS.Steroidproductionbyamphibian(Rananigromaculata)Ovarianfolliclesatdifferentdevelopmentalstages[J].E砷 7.ool,1991,260:662—673. ImmunoeytoehemiealLocalizationofSexSteroid ReceptorsintheOvary WANGAn?yun,WItXiao—bing (CollegeofLifeSciences,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241000.China) Abstract:Itisresearchedthatsexsteroidreceptorsregulatetheoocyedevelopmentofamphibian.1mmunocytochemical localizationisinvestigatedatdifferentstagesofthefolliclesofBufogargarizansusingestrogen,progesteroneandandrogen receptors,Theresultsindicatethatthereceptorsofestrogen,androgenandprogesteroneexistinoogeniaandoocytesof differentdevelopmentalstages._Estrogenreceptorisexpressedstronglyinfolliclecellsandweaklyinthecytoplasmand nuclearmembraneofoocytesatvitellogenicandpostvitellogenicstages;Progestogenrecept orisexpressedweaklyin folliclecellsandcytoplasm,nuclearmembraneofoocytesatvitellogenicstage,butatpostvitellogenicstagethe immunopositivereactioninthesecellsisstrengthened,showingmediumpositivereaction;Androgenreceptorshows weaklypositivereactioninfolliclecellsandcytoplasm,nuclearmembraD_eofoocytesatvitellogenicstage.the immunopositivereactionisstrengthenedalittleincytoplasm,nuclear1TiP21qbranceofoocyteatpostvitellogenic. Keywords:日gargarizans;Sexsteroidreceptor;lmmunocytochemistry