中药独活及其单体蛇床子素抗血管生成的实验研究道

中药独活及其单体蛇床子素抗血管生成的实验研究道 ,,,,,,,,;,,, ，,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, , ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,(,,,,,,?, ,,,,,, ,,,,,,,,,:,,, ,, ,,,,,,,: ,,,, ,,,,—,,,,，,,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,;,,,，,,,, ,,,，,,,,,学号:,,,,,,,, 硕士学位论文(中药独活及其单体蛇床子素抗血管生成的实验研 究)作者姓名林黎 申请学位级别 临床医学硕士学位指导教师姓名 钱晓萍教授刘宝瑞教授职 称主任医师学科专业中西医结合临床医学 研究方向 中西医结合肿瘤内科学学习时间自 ,,,,年,,月,,日 起至,,,,年,,月,,日止论文提交日期,,,,年,,月,,日 论文答辩日期,,,,年,,月,,日学位授予单位南京中医药大学 学位类型 临床医学专业硕士学位以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名: 球彖 舢忙,月旷日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 ,保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密曰。 (请在以上方框内打“???)学位论文作者(需亲笔)签狡 环麓 , ,年,月心日导师(需亲笔)签名: 幽纠年莎月„,?,,,?, , ((((((((((((((((((((((((((((((((，，，第一章研究背景………………………………………………………………(, 一肿瘤血管生成和抗血管生成治疗…………………………………………一, 二中医药在抗血管生成治疗中的相关研究……………………………, 参考文 献…………………………………………………………………(,第二章中药独活及其单体蛇床子素抗血管生成实验研究……………………,, 一材料和方法……………………………………………………………………, , 二结 三讨 参考文献………………………………………………………………………………,,第三章文献综述……………………………………………………………(,,中药独活及其化学成分抗肿瘤作用的研究进展………………………………(,,攻读硕士学位期间取得的研究成果………………………………………………(,,致,射………………………………………………………………………………………………(,,,,,(,,、,,,(,,,、人肺腺癌细胞株,,,,、人乳腺癌细胞株,,,(,及人结肠癌细胞株,,,,的增殖抑制率，从中筛选出对药物最敏感的细胞株。以最敏感的肿瘤细胞为参照，采用,,,法观察中药独活醇提物及其单体蛇床子素对人脐静脉血管内皮细胞(,,,,, ,,,,,,;,, ,,,, ,,,,,,,,,,, ;,,,，,,,,,)的增殖抑制作用，通过,,,,,,,,,,,室趋化实验、体外小管形成实验以及流式细胞术，观察并比较独活醇提物及单体蛇床子素对,,,,,迁移、小管形成、凋亡及周期的影响。建立鸡胚尿囊膜(,,,)模型，观察并比较独活醇提物及其单体蛇床子素对体内新生血管的抑制作用。结果:蛇床子素在体外能够抑制,,,(,,、,,,(,,,、,,,,、,,,(,和,,,,的增殖，,,,,值分别为,,(,,,, , ,,,,、,,(,,, ,, ,,,,、,,(,,, , ,,,,、,,(,,, , ,,,,,、,,(,, , , ,,,,，且，〕,,,,细胞为本实验中对蛇床子素最为敏感的肿瘤细胞株。相同条件下，独活醇提物对,,,(,,、,,,(,,,、,,,,、,,,(,和,,,,细胞增殖的抑制作用较弱，，,,,值分别为,,(,,,,,,,,、,,,(,,,,,,,,、,,(,,,,,,,,、,,(,,,,,,,,和,,(,,,恚纾 恚欤 睿校蹋希郑舷赴 臼笛橹卸陨叽沧铀丶岸阑畲继嵛镒钗 舾械闹琢鱿赴 辍,常 罚?,， ,,,,,,一,, ,,,,,的独活醇提物及蛇床子素作用,,,时对,,,,,的细胞增殖抑制率分别在,(,,,,,,(,,,和,,(,,,?,,?,,(,,,之间，均有明显的剂量(效应关系，两种药物对,,,,,的细胞增殖抑制作用均优于对,,,,细胞增殖抑制作用，具有差异细胞毒作用 (,,,(,,)。体外小管及小管迁移实验显示，,(,, , ,,,,?,,,,, ,, ,,,,的蛇床子素作用,,,时,,,,,小管形成数目减少，且管腔不完整，相 ”,,同浓度独活醇提物则没有明显抑制小管形成的作用，,(,,,, ,,,,, , ,,,,的独活醇提物和蛇床子素处理,, ,对,,,,,迁移抑制率分别在,(,,,?,,?,(,,,和,,(,,,?,,?,,(,,,之间。,(,, ，, ,,,,”,?,, ,, ,,,,的 中药独活及其单体蛇床子素抗血管生成的实验研究独活醇提物和蛇床子素作用,,,,, ,,,后，诱导,,,,,细胞凋亡率分别在,(,,,,,(,,,,〔,,,(,,?,?,,(,,之间。,(,, , ,,,,,,一,,, ,,,,蛇床子素作用,,,,, ,,,后，使内皮细胞周期主要阻滞在,,(,,期，相同浓度独活醇提物对细胞周期没有明显的影响。 京中医药人学硕十论文 ,,,,,,,, ,,,,;,,,,,:,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,,,;, ,,, ,,, ,,;,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,,;,, ,,,, ,,,,,,;, ,,,,,;,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,, ,,,,( ,,,,,,,:(,,, ,,,,, ,,, ,,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,,,;, ,, ,,,,,,, ,,,,,;,, ,,,, ,,,,,,;, ,,,,,;,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,;, ;,,;,, ;,,, ,,,?,,、 ,,,,,,,，,,,,, ,,,, ;,,;,, ;,,, ,,,,，,,,,, ,,,,,, ;,,;,, ,,,?, ;,,, ,,, ,,,,, ;,,,, ;,,;,,,,, ;,,;,, ,,,, ,,,,(,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,, ,,,, ,, ,,, ,,,,;,,, ,,, ,,,, ,;,,,,,,(,,,,, ;,,, ,,,;, ,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,, ,,,, ,, ;,,,,,,，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(,)缺乏像传统化疗那样的相对固定统一的;(,)当患者合并患有在恢复过程中需促进血管生成的疾病时，抗血管生成治疗与之相矛盾，同时，抗血管生成治疗可能增加血栓性疾病的风险;(,)无法直接检查用药后肿瘤血管生成情况变化。因此，还需进一步深入研究肿瘤血管生成机制、开发新的抗肿瘤血管药物、确立合理的疗效评价体系等，以期抗肿瘤血管生成治疗能更好地在肿瘤治疗中发挥作用。二、中医药在抗血管方面的研究: 传统中医理论认为，肿瘤系由正气不足、外邪侵袭致体内痰饮、血瘀等多种病理产物搏结而成，属中医“瘤积”、“岩”的范畴。近年临床实践中发现中医药治疗肿瘤发挥着重要的作用，而大量实验芯恐な担 幸?芄灰种浦琢鲂律 艿纳 桑 馕?, 南京中医药人学硕十论文肿瘤的治疗开辟了新的前景。 (一)单味中药粗提取物抗血管生成作用 乳香为橄榄科小乔木植物卡氏乳香树及其同属植物树干皮部渗出的油胶树脂。何秀娟等【,,】发现，乳香水提取物能明显抑制,,,,,的增殖。 重楼为百合科植物云南重楼(,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,;,()的干燥根茎。中医认为本品味苦，性微寒，有小毒，归肝经，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、凉风抽搐等症。体外实验已经证实中药重楼醇提物具有显著的抗肿瘤作用【,,。近年有研究证实，重楼醇提物能够抑制血管生成，胡静【,,】等采用,,,法、,,,,,,,,,小室趋化实验、体外管腔形成实验观察重楼醇提物对人脐静脉血管内皮细胞(,,,,,)、人肠癌,,,,细胞增殖的影响，对,,,,,迁移、成血管能力的影响。结果发现，重楼醇提物在体外能有效抑制血管生成，其机制可能与能够抑制血管内皮细胞增殖、体外管腔形成、内皮细胞迁移，诱导内皮细胞凋亡，抑制内皮细胞,,,的合成有关。 独活为伞形科(,,,,,,,,,,,,)当归属(,,,,,,;, ,()植物重齿毛当归 (,,,,,,;,,,,,,;,,, ,,,,,(,(,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,,,)的干燥根。主产于四川、湖北、安徽等地。性味辛、苦，微温。归肝、肾、膀胱经。其功能主治祛风胜湿;散寒止痛。主要用于治疗风寒湿痹;腰膝疼痛;少阴伏风头痛，头闯萃吹戎?,幸?阑畲继嵛锞哂忻飨缘目怪琢鲎饔谩荆常保保 梢种迫敫伟 樱停停靡唬罚罚玻薄?龋澹穑且唬病?赴 拢牵茫 福玻场?Π 樱祝 ?,,、,,,,、食管癌,,,,(,,细胞株的增 殖，其中对人肠癌,,,,抑制作用最明显。 邹玺等【”】在体外实验研究中采用,,,法检测不同浓度独活水提物对人肝癌细胞株,,,,(,,,,和人脐静脉内皮细胞株,,,,,增殖的抑制作用，发现独活水提物在体外对肝癌细胞株,,,,(,,,,和人脐静脉内皮细胞株,,,,,存在差异细胞毒;通过体内鸡胚尿囊膜实验观察新生血管生长情况，发现独活水提物在低浓度时即能抑制鸡胚尿囊膜血管生成。 合欢皮为豆科(,,,,,,,,,,,)植物合欢(,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,?,,,,,()的干燥树皮，性味甘、平。有解郁、和血、宁心、消痈肿之功能。用于心神不安、忧郁、失眠、肺痈、痈肿、瘰疠、筋骨折伤等症。花慧等【,,】通过体内外实验观察合欢皮提取物的抑制血管生成情况，结果证实合欢皮醇提物在体外能抑制人微血管内皮细胞(,,,,,,)的增殖和迁移;在体内同时具有抑制鸡胚尿囊膜和肿瘤组织中血管生成的作用。 (二)中药单体抗血管生成作用 然而由于单味中药粗提取物所含成分复杂，对新生血管的抑制作用亦比较有限，而随着研究的深入，近年来许多研究者从部分具有抗肿瘤活性的中药中进一步提取出有效单体，并对其抗肿瘤新生血管生成作用及其机制进行了深入探讨。 研究背景 人参为五加科植物人参(,,,,, ,,,,,,, , ,(,,,)的干燥根。人参皂苷,,,是中药人参中的四环三萜皂苷，最早是由日本学者北川勋在,,,,年制备和确定其分子式，此后大量研究证实人参皂苷,邸具有抗肿瘤作用【,,,,,】，多项研究明，其抑瘤机制可能与抗血管生成相关。高勇等【加】利用鸡胚绒毛尿囊膜(,,,)实验，观察到,,,能够抑制新生血管形成的;同时通过建立,,,,,肺癌模型发现,够组的瘤体内新生血管数明显减少，使瘤体生长受到抑制。王兵等【,，】运用,,,法检测,,,对血管内皮细胞,,,)、胃癌细胞,,,(,,及,,,(,,细胞诱导,,,增殖的影响，发现,够可能是通过下调增殖期,,,相关生长因子受体的表达，使,,,对肿瘤细胞分泌生长因子的敏感性降低，从而抑制了,,,增殖。陈大富等【,,】通过建立裸鼠原位癌模型，发现,西可通过降低肿瘤组织的微血管密度和血管内皮生长因子的表达，抑制瘤体内新生血管的生长。陈明伟等【,,】通过实验发现,,,可使,,,,细胞凋亡，并通过抑制肿瘤细胞内源性分泌的,,,,来抑制肿瘤血管生成。 姜黄姜黄主要活性成分是姜黄色素和挥发油，具有抗炎、抗氧化、降血脂和抗肿瘤等多种作用。姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素是姜黄中的,种主要色素，混称姜黄色素。李剑吲删研究证明，,种姜黄色素单体能够抑制人脐静脉内皮细胞(,,,,,)的生长。,,,,,等【,,】采用兔和小鼠角膜小囊实验观察了姜黄色素对角膜血管生成的影响，结果发现，姜黄色素可明显抑制血管生成。,,,,,,,等【,,】采用重组基膜,,,,,,,,和小鼠皮下,,,,,,,,栓模型研究了姜黄色素的抗血管生成作用，发现姜黄色素不仅可以抑制细胞微管的形成，还可破坏已形成的血管网状结构，其机制可能是通过调节蛋白水解酶的活性，从而抑制基质金属蛋白酶的合成。 白芨为兰科多年生草本植物白芨的地下块茎，白芨提取物中主要成分为葡配甘露聚糖。冯敢生【,,】等通过体外细胞培养及大鼠移植性肝癌动脉化疗栓塞实验发现，白芨微球栓塞组肿瘤微血管密度(,,,),？显降低，肿瘤生长率明显减少，可能是通过抑制,,,,与其受体结合从而抑制肿瘤血管生成的。 川芎为伞形科多年生草本植物川芎的根茎，其提取物四甲基吡嗪，即川芎嗪。徐晓玉等【,,,,,】通过体外实验发现， 川芎嗪不仅能抑制血管内皮细胞的增殖，还能阻止,,,,受体与其放射性配体的结合;体内实验发现川芎嗪能抑制,,,,,肺癌小鼠模型的肿瘤生长，川芎嗪组肿瘤体积、重量和肺转移灶数明显低于对照组，并能降低肿瘤微血管密度【,?，还能抑制大鼠,,,,及,,,, ,,,,的表达【,,,。 黄连为毛莨科植物的根茎，其提取物小檗碱(,,,,,,,,,)，又称黄连素是一种异喹啉类季铵生物碱，主要用于肠道炎症伴发热，具有抗菌、止泻、抗心律失常、抗高血压、降血脂等作用。近年研究发现黄连素还具有抗肿瘤作用【,,(,,,。还有研究发现，黄连素能够抑制血管生成，娄金丽【,,】等通过,,,法和流式细胞仪检测发现，小檗碱能明显 , 南京中医药大学硕士论文 抑制,,,,活化的,,,,,增殖，且存在剂量依赖关系，其可能通过将,,,,活化 的,,,,,细胞周期阻滞在,,”,,,,期，抑制活化的,,,,,增殖;诱导活化,,,,, 细胞发生凋亡等机制，阻止新生血管形成。 斑蝥为芫青科昆虫南方大斑蝥或黄黑小斑蝥的虫体，经研究发现，其衍生物去 甲斑蝥素(,,,,)抑制,,,,,正常分裂。范跃祖【, ,】等研究发现，去甲斑蝥素能够 抑制胆囊癌血管的生成，进而其机制可能与去甲斑蝥素诱导内皮细胞凋亡、直接损伤 内皮细胞、下调血管生成诱导因子,,,,、,,,,,和上调血管生成抑制因子,,,、,，,,, 有关。莫日根部】等运用免疫组化法观察发现，去甲斑蝥素不仅能够抑制肝癌细胞 … ,,,(,,,,分泌,,,,而且能下调,,,,的特异性受体,,,的蛋白表达。 砒石为三氧化二砷(,,,,,)是中药砒霜的主要成分，是一种癌剂，中国古代曾被用 于治疗牛皮癣、梅毒、风湿病及一些恶性肿瘤。,,, ,,„,,】等通过体内外实验发现， ,,,,,有明显的抑制内皮细胞增生作用，还能抑制,,,血管形成，其机制可能与损伤 参与血管形成过程的原始问充质细胞、破坏内皮细胞的结构和功能有关。,,,,,等【,,, 采用体外实验发现,,,,,可能是通过下调白血病细胞株,,, ,,,,的表达，从而抑制 内皮细胞的增殖的。而,,, ,,等【,,】对,,,,,的研究也证实,,,,,可抑制,,,,或 ,,,,的表达，阻断生长因子信号途径，使细胞停滞于,,期和,,,,期，从而抑制 ,,,,,的增殖。 , 除此之外，从雷公藤中提取的雷公藤红素(;,,,,,,,,)【,,删、从苏木中提取的 ,,,(,【,,,、从青黛、青蒿中提取的青蒿琥酯(,,,,,,,,,,)〔,,,,,,、从苦参中提取的苦参 碱和氧化苦参碱【,,,,,,、从绿茶中提取的茶多酚【,,川,(;,,,,,,, ,,,,,,,,)等具有抗肿 瘤活性的中药提取的活性单体均具有抗肿瘤血管生成的作用。 目前，随着抗血.