金黄色葡萄球菌hmp基因缺失突变株的构建及抗一氧化氮能力分析

金黄色葡萄球菌hmp基因缺失突变株的构建及抗一氧化氮能力 Research Paper 微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 51(2) :196 , 202; 4 February 2011 ISSN 0001 ,620 9; CN 11 ,199 5 /Q http: / / journals. im. ac. cn / actamicrocn hmp 金黄色葡萄球菌 基因缺失突变株的构建及抗一氧化氮能 力分析 *，，，，姜鹏路新枝侯方杰刘湛军于文功 ，，266003中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室青岛 flavohaeoglobin，) ，:【】RN6390 ( mHMP摘要目的构建金黄色葡萄球菌 黄素血红蛋白基因缺失突变株研 究其 ( Nitric Oxide，NO) 。 【】抗一氧化氮能力及其在细菌生物被膜形成中的 作 用方 法根据同源重组技术的原 ，hmp hmp PCR RN6390 ，理利用 扩增 的 基因上下游同源臂经过抗生素和温度交替培养筛选 基因缺失突，PCR、PCR NP) NO hmp 。( S，变 株利用基因组 对突变菌株进行鉴定以硝普钠为 供体检测了 基因定量 NO hmp RN6390 ，。 【】缺失菌 株的抗 能力并初步研究了 基因在生物被膜形成中的作用结果成功构建了 hmp NO hmp hmp NO ，，的 基 因缺失突变株外源 能够诱导菌株 基因的表达基因缺失菌株抗 能力明显下，。 【】hmp RN6390 ，降但其生物 被膜形成能力有明显提高结论获得了 的 基因缺失突变株该突变株的获得 hmp NO ，。为进一步研究 基因的生物功能以及细菌内源性 的作用奠定了良好的技术平台 :0001-6209 (2011) 02019607: :A--文章编号中图分类号文献标识码: ，( ) ，，，HMP关键词金黄色葡萄球菌黄素血红蛋白缺失突变株一氧化氮生物被 Q933 膜 ，( Staphylococcus aureus ) 动物体内血红蛋白的生理功能已经十分明确金黄色葡萄球菌 是人类 ，、， 化脓感染中最常见的病原菌可引起肺炎心包炎 ，然而微生物中血红蛋白的研究进展却相对缓慢微 、，甚至败血症脓毒症等全身感染也是造成人类食物 生物血红蛋白包括单结构域的珠蛋白和双结构域的 ,1,。 中毒的常 见 致 病 菌 之 一宿主自身先天免疫系 。 HMP蛋 白 广 泛 存 在 于 细 菌 和 酵 黄素血红蛋 白 ( inducible nitric oxide 统包括诱导性一氧化氮合成酶，N ( 母 中其 端具 有 一个血 色素类的结构域 包 括 一 synthase，iNOS) NO 系统 释 放 的 是有效抗击外来B ) ，C 个 型亚铁血 红 素端 为 铁 氧 化 还 原 蛋 白 + ，NO 微 生物入侵的第一道防线可以 直 接 抑 制 微 生 NADP FAD ( 还原酶类结构域包括一个 基团和 ,7 , 8,，DNA 物 的有氧 呼 吸 能 量 代 谢并 抑 制 微 生 物 的 NADPH )。研究发现大肠杆菌的黄结 合域, ,2 , 4,NO NO ，有氧条件下能将 转化为 在缺氧条件下3 ，，制然而金黄色葡萄球菌区别于其他非致病复 素血红蛋白在 还NO，NO 原为 在保护菌体抵御 和硝化压力 方 面 2 NO 性 葡萄球菌的一个主要特征就是其能够抵抗 的,9 , 10,,5,。，发 挥重要的作用与革兰氏阴性菌不同金黄。毒 性研究发 现 黄 素 血红蛋白及与其处于同一 hmp NOS ，色 葡萄 球 菌 除 了 具 有 基 因还 存 在 NO 操 纵子的乳酸脱氢酶可能是金黄色葡萄球菌 脱,11,,6,， S HMPNO类 基 因那 么 蛋 白 和 蛋 白 的 功 。毒 的主要物质 能 是 否 冲 基金项目:国家863 计划(2007AA09Z418，2007AA091506)“” * Tel: +8 6-532-82031680; E-mail:yuwg66@ ouc. edu. cn。 通信作者 :(1981 , ) ，，，，。 E-mail:jp886@ 163. 作者简介姜鹏女山东青岛人博士研究生主要从事微生物学与分子生物学方面的研究 com :2010-09-14;:2010-11-22收稿日期修回日期 P ，HMNO ，Takara ;( spc) 突蛋白是 否 还 具 有 脱 毒 功 能为 了 阐 公司含有壮观霉素抗性基因的自大连 明pUS19 The University of Texas Shuyu 质粒 由美国 的 hmp 基因在金黄色葡萄球菌中的生物学功能及其与 Zhang 。 Luria-Bertani 教授 惠 赠大 肠 杆 菌 培 养 采 用 NOS，内源性的关 系本 文利用 同 源重组技术构建( LB) ( ) ，培养基青 岛 生 物 工 程 科 技 有 限 公 司 金 黄 RN6390 hmp ，了 的 基 因 缺 失 突 变 株并比较了野ryptone Soya roth ( TSB) TB色葡萄球 菌 采 用 培 养 基 NO 。生株 和突变株抗 的能力 ( ) 。 北京陆桥 技 术 有 限 公 司抗生素的使用 浓 度 分 1 材料和方法 :100 mg / L，5 mg / L，别为氨苄青霉素 红霉素 壮观霉 1. 1 材料100 g /L 。m素 1 . 1 . 2 :1. 1. 1 、:RN4220 试 剂 溶 葡 萄 球 菌酶和抗生素购自 菌 株质 粒 和 培 养 基菌 株 是 限 igmaS制，-1， 6- N-DspB) ( 公 司 β 乙 酰 氨 基 葡 聚 糖 降 解 酶 由，性内切酶缺陷的金黄色葡萄球菌可以接受来自大 ，DBI ，本 实 验 室 制 备 核 酸 提 取 试 剂 盒 购 自 公 司 ，Iigo Lasa 肠杆菌的穿 梭 质 粒由 西 班 牙 的 教 授 惠 引 物 的 合 成和基 因 序列测定由北京华 大 基因 有。 RN6390 The 赠菌 株 是 由 英 国 ，限 公 司 完 成 分子克隆相关试剂购自 TaKaRaockefeller niversity brose Cheung RUAm的 教 授 惠 Institute Pasteur Michel p，MAD的载 体 是 由 法 。国。 公 司 赠穿 梭 表 达 ébarbouillé 。 p-18T PCR DMD:1. 1. 3 教授惠赠大肠杆菌质粒 引物引物的序列及克隆位点如表 购1。 表 1 PCR 引物序列及用途 The sequencesa nd functions of primers Table 1 rier sequences(5′3′) eplatPmTmPriers estriction site Length /b p Introductions mR ?e Primer 1 GGATCCCAACTCAGTAGABamHI RN6390 Amplification of the upstream 568 C chromosome AGGGG Primer 2 SaiI of hmp gene GTCGACAATTACGATATGTCGC GA GAATTCTAAGTAAAGGCRN6390 499 Primer 3 Amplification of the downstream EcoRI ACCGTTT chromosome AGATCTAGGTCATGTGTrier 4 of hp gene PmmBgzII CATCCG TCCCTTTTTTTTS1GGAAAGGGAG1146 pUPrier 5 SazI mAmplification of Spectinomycin CTAAAA 9 T TTCTTTCTTCTTGAAGGGAAPrier 6 EcoI mRresistance gene ACATGTT TCTTCTCCCCAAAGAAARN6390 Δhmp 539 Prier 7 mprimers to detect hmp gene TAC chroosoe mm Prier 8 CCTCTTTCCmAAAAGAAG118 real tie priers of m-PCRmRN6390 Δhp mPrimer 9 AGT chromosome the housekeeping gene gyrB rier 10 PmGGCGATTTTACCATTACRN6390 Δhmp 99 real tie-PC priers to mRmchromosome Primer 11 GAGG detect hmp expression Primer 12 CCACCGATTCCTGTACG1. 2 % 100 mL 1LB pMADhmp 菌按 的 体 积 接 入 新 鲜 无 菌 培 养 打靶载体 Δ的构建AA C 基8325-4 根 据金黄色葡萄 球 菌 的 母TTTTCCTGAAAGGAAAA，0. 1 U / mL DspB，37? ，中同时加入 的 震荡培养待 CCTGAA ( RN6390Prie r Preier 5 ，RN6390 ) ，mm软 件设 计 株使用 OD. 6 , 0. 8 ，300 g / L 0m 生长到 约为 时加入 的溶 菌hmpCGGCCATTACAGCTTGT600 GCTA up down ，基因上游和下游同源臂 和 的引物分别为 37? min，，2500 × g 30 酶 于 孵 育 常 温 下离 心 primer1-primer2， prier3-prier4。 mm根 据 质 粒 ,12,10 min，，10 %收集菌体依次用灭菌去离子水和 甘 ml 10% ， ，1 pUS1spc rier5，洗涤最后使菌体悬浮于 的 甘油中分pm设 计 了 抗 性 基 因的 引 物9 ，装油 ,8 0? 。primer6。RN6390 US19 p冻存分别以 基因组和质粒 为 模打靶载体先经过电击转化入金黄色葡 萄 球 菌 PChmp ，( 板利 用基 因 上 下 游 同 源 臂 约扩 增R RN4220 RN6390。 ，中经过修饰后再转入菌 株 电 0. 56 kb，0. 5 kb) spc ( 1. 2 kb) ，和抗性基因 约 产 物,15,，酶切后经过琼脂糖凝胶电泳回收依次连入 ，1。击 条件及筛选过程参考文献重组过程如图 pMAD 1. 4 RN6390 hmp 金黄色葡萄球菌 的 基因缺失突,13,( 10 kb) ，约 载体中获得重组载体 变株鉴定 pMADmp。hΔ PCR hmp spc 1. 4. 1 :鉴定为了检测 基因是否被 基1. 3 打靶载体的电击转化 ，RN6390hp m因替代而缺失分别以突变株 Δ与野,14, 生金黄色葡萄 球 菌 感 受 态 细 胞 制 备 参 考 文 献 RN6390 DNA rimer5 ，p株 的 基 因 组 为 模 板以 m ( OD) ，600 n并加以修改利用细菌在 处的吸光 600 -well ， 200 L 96别取 μ加入 细 胞 培 养 板 中随 后 加 入 ，37? 22 h，NO SNP不同浓度的 供体 静置培养 充 ，600 nm 分 悬浮菌体后使用酶标仪检测 处的吸光。值 1. 7 RN6390 hmp 金黄色葡萄球菌 基因缺失突变 株生物被膜形成能力的检测 金黄 色 葡 萄 球菌 生物被膜形成和 检 测如 文 ,16,，，0. 5 %献过 夜 培 养 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌用 含 葡 TSB ，萄糖的新鲜无菌 培养基稀释至合适的浓度按 100 L 96-well ，每孔 μ加入 无 菌 的 细 胞 培 养 板 中密 图 1 同源重组过程示意图. 1 5 in，， 3 ，150 L 0%m结晶紫染色 水洗清洗 遍用 μ37? 22 h，，封后 静置培养 小心吸出上清去离 子 水 Fig. 1 The process of homologous recombination 33% ，590 nm 冰乙酸溶解结晶紫在 处测吸光primer6，primer7 primer8 PCR 和 为引物进行 扩 。值 。增 1. 4. 2 :RN6390 序列测定鉴定以所筛选的 的 2 结果和分析 hmp ，rier1，pm基 因 突 变 株 的 基 因 组 为 模 板用 引 物打靶载体的构建和鉴定 2. 1 prier4 PC，T-mR进行 将扩增到的产物连接入 PCR ，对经 测 序 正 确 的 产 物 进 行 酶 切通 过 Vector，连 。测序 ，hmp spc 接分别将 基因上下游片段连在 抗性 基 因PCR hmp 1. 4. 3 : 定 量 检 测 基 因 的 表 达提 ，pMA两侧最 终 克 隆 入载 体 构建成打靶载体 取RN6390 RN6390hmp RNA，和 Δ的 总 方 法 参 照 DMADmp，PCR phΔ通 过 和 酶 切 对 此 载 体 进 行 鉴 试 剂 。 定。DEPC ，盒加以改进菌 体 沉 淀 用 水 重 悬加 入 终 浓 PCR p ，pMADhm鉴定结 果 显 示以 Δ为 模 板 PCR 扩300 mg/ L ，37? 30 min 度为 溶 葡 萄 球 菌 酶孵 育 后 up，down，spc ，增能 够 得 到 相应大小的片段而 以 RNA。 RNA 按照试剂盒说明书提取 提取得到的 pMAD 。 为模板则没有扩增产物用不同的限制性 ，upspcdon，--w切 酶酶切打靶载 体可 以 分 别 得 到 cDNA。 SYBR Green 得 到 采 用 实 经 过反转录内 spc，up，down 。 相应大小的酶切片段这些结果表明PCR hmp mRNA 时 荧 光 定量 检 测 基 因 在 水 平 pMADmp 。h打靶载体 Δ构建成功 。 gyrB( DNA B 上 的 表 达以管家基因 促旋酶的 亚RN6390 hmp 2. 2 金黄色葡萄球菌 基因缺失突变) ，primer9 单位蛋白编码 基因为内参用引物 和 株的构建和鉴定1. 5 NO RN6390 外 源 添 加 对金黄色葡萄球菌 primer10，primer11 primer12 PCR。和 进行定量 RN6390 hmp 2. 2. 1 金黄色葡萄球菌 的 基 因 缺 hmp 基因表达的影响 失 :突变株的构建利用电击转化法将金黄色葡萄球菌5 mL TSB 在 无 菌 新 鲜 培 养 基 中 培 养 RN4220 MADmp ph修饰过的打靶载体 Δ转入金RN6390 ，TSB 过夜用无菌新鲜 培养基调节至相同 RN6390，，黄色 葡萄球菌 经抗生素和蓝白斑筛选OD600 . 01，200 L 96-0菌体密度 到 分别取 μ加入 ，对阳性 克隆进行质粒提取和酶切鉴定挑选正确的wel l，细胞培 养板 中随 后 加 入 终 浓 度 分 别 为 30? 40? ，克隆先 后经 双交换和 质粒丢失最终得500 mol/ L ，μ RN6390 hmp 到金黄色 葡萄球菌 的 基因缺失突变1 ol/ L ，2 ol /L ，4 ol /L ，8 ol/ L NO mmmmmmmm的 RN6390 hmp 2. 2. 2 金黄色葡萄球菌 基 因 缺 失 。株 NP，37? 22 h，RNA，S供 体 静置培养 提取总 实 突变 株 的 RN6390 hmp : PC1. 6 金黄色葡萄球菌 基因缺失突变鉴 定 和 序 列 鉴 定分 别 以 突 变 株时荧光 R NO 株对外源 耐受性的检测6390hp RNmRN6390 Δ与野生株 的 基 因 组 PCR hmp 。定量 检测 基因的表达变化DNA 为RN6390 过夜培养野生型金黄色葡萄球菌 及 PCR ，2-A ，模板进行 扩增结果如图 所 示采 用 引 物 hmp RN6390hmp，其 基 因 缺 失 突 变 株 Δ用 无 prier1 prier4，RN6390 mm和 在 和 kb -hmp-down) 2. ( up2. 1kb ( up-和 TSB OD别 得 到 约 菌 新 鲜 培养基 调 节 至 相 同 菌 体 密 度 到 600 2RN6390hmp Δ分 rimer5 p rier6，pmspc-down) ，，RN6390hmp ( 和的 片 段采 用 引 物部分相应片段在 Δ无扩增片段图 2- 分 别 在 rimer5 primer5 p primer4，和和 A) 。 RN6390hmp primer1这些 结 果 初 步 说 明 突 变 株 Δ6390hp 1. 2 kb ( spc) ，1. 65 kb ( spc- RNmΔ扩增出 hmp spc 。 中 基因 已 经 被 抗 性 基 因 替 代 而 缺 失基 down) 1. 7 kb ( up-spc ) ，和 的 片 段而 野 生 型 DNA 因 组 中相应片段扩增和序列测定结果进一RN6390 rimer7、;p无扩 增 片 段而 采 用 引 物 hmp hmp 步证 明了 基因缺失突变株基 因 组 中 基 因 prier8 RN6390 . 5 kb hmp m0在野生型 扩增出约 的 spc 。已 被 基因所替换 基 因 的 6390 hmp PCR PCR 2 RN图 缺失菌株 Δ的 和荧光实时定量 鉴定Fig. 2 Identification of the mutant RN6390hmp by PCR and real-time PCR. A:PCR. M1. DNA marker (15000) ; M2. DNA marker(2000) ; Δ 1，3， 5，7，9. RN6390 chroosoe; 2，4，6，8，10. 6390hp chroosoe. B:The expression of hmp gene in RN6390 and 6390hp.mmRNmmmRNmΔΔ hmp PCR mRNA 2. 2. 3 荧光定量 检 测 基 因 在 水:PCR 平上的表达利 用 荧 光 定 量 对野生型和突 变 hmp 。 2-B 菌株中 基因 的 表 达 进 行 了 分 析如 图 所 ，RN6390 hmp mRNA 示野生 株 中 基 因 的 表 达 ，RN6390hmp hmp 正 常而 突 变 株 Δ中 基 因 的 mRNA 0，的表达几乎为 以上结果都说 明 该 突 变 。菌 株 已 构 建成功 2. 3 hmp 基因在金黄色葡萄球菌抵抗硝化压力中 的作用 PCR hmp ，定量 结 果 显 示基 因 表 达 受 到 外 源 ，NNO mol/ L 供 体，500 的 诱 导 作 用外 源 添 加 μ O hmp -A) 。1 ( 3基因的表达提高了 倍多图 无论是野 NO NO 生型 和 缺 失 突 变 株 对 耐 受 性 均 随 着 供 hmp SNP ，体 浓度的提高而降低而 基因缺失突变 NO ( 3-B) ，体的 耐受性显著低于野生型 图 说明 图 3 SNP 对 RN6390 的 hmp 基因表达的影响和 hmp 基 NO 因缺失突变株对外源 耐受力检测 P HMNO 蛋 白能够降低 对金黄色葡萄球菌的毒 Fig. 3 The effect of SNP on the expression of hmp gene of RN6390 。性 ( A) ( p 0. 01) and the sensitivity of RN6390hmp to SNP ( B) . ， Δ2. 4 hmp 基因在金黄色葡萄球菌生物被膜形成中 Results are the average of six replicates + SD at least three 的作用 independent experients. m细菌生物被膜是由细菌及其分泌的胞外基质形 ，成的多细胞结构它是细菌产生抗生素耐药和逃避 ，失突变株生物被膜形成能力明显增加其形成的生 ,17,。 机体免疫系统攻 击 的 重 要 原 因 之 一实 验 结 果 23% 。物被膜的量提高了约 4 ，，hmp 如图 所示静态生物被膜模型条件下基因缺 ,5, 。的 ，研究表明在细菌感染宿主的过程中宿主可以 ，感知细菌并通过调节免疫系统清除细菌同样细菌 ，也可以感知来自环境或宿主的压力当外界环境不 利时细菌会降低自身毒力因子的产生或形成生物被 ,21 , 22,。 膜等逃避宿主免疫系统的攻 击我 们 检 测 了 hmp hmp ，基因缺失突变株生物被膜形成能力发 现 基因缺失后金黄色葡萄球菌的生物被膜形成能力增 ，hmp 强推测可能 基因缺失后细菌应对环境硝化压 力的能力降低因而更容易形成具有保护作用的生物 ，被膜此外我们在前期研究中还发现生物被膜内部 图 4 金黄色葡萄球菌 RN6390 及其 hmp 基因缺失突变S ，NONO 细菌的 表达上调而外源添加 后细菌的株生物被膜形成检测 ( ) ，生 物被膜形成能力是增强的 结果未显示说明 Fig. 4 Biofil foration of S. aureus RN6390 and 6390hp. mmRNmΔNO ，可以调节金黄色葡萄球菌的生 物 被 膜 形 成而 Results are the average of six replicates + SD at least three hmp NO 基因缺失可以间接引起细 胞 内 的 浓 度 升 independent experiments. ( p 0. 05) .， ，。高从 而引起生物被膜形成的增加本实验对金黄3 讨论RN6390 hmp 色葡萄 球菌 的 基因缺失突变体的成 在实验中我们发现导致金黄色葡萄球菌转化效 NO 功构建为 我们进一步研究此基因及内源性 在,13,，率降低的因素除了致密的胞壁肽聚糖层还包括 。金黄色葡萄 球菌中的生物学功能奠定了基础 在生 长 过 程 中 产 生 大 量 的 细 胞 间质多糖粘附素 PIA / PNAG ( -1，6-N-主 要 是 β 乙 酰 氨 基 葡 聚 参考文献) 。糖 2003 ，Kaplan 年等人首次发现了一种能够通过降解 ,1 , Enright MC，Day NP，Davies CE，Peacock SJ，Sprat t，-1，6-N-这一葡聚糖 的 内 切 酶β 乙酰氨基葡聚糖降 . BG,18,( sp )。 DB解酶 本 实 验 室 也 分 离 得 到 了 一 种 Multilocus sequence typing for characterization of methicillin- sp，DB而且我们发现在菌体生长过程中加入此酶resistant and ethicillin-susceptible clones of Staphyococcus ml aureus. Journal of Clinical Microbiology， PI / P，ANAG能 够降解 由此 而 制备 的感受态细胞 2000，38(3) :1008-转化 1015. ( ) 。 DspB 率会明显提高结果未显示和溶葡萄球 ,2 , athan C. itric oxide as a secretory product of NN 菌 mammalian cells. The FASEB oJurnal，1992，6 RN6390 hmp 酶的联合使用为我们成功构建 的 基 。因 缺失突变株创造了很好的条件 ( 12) : HMP NO 蛋 白 是 很 多 细 菌 中 关 键 和 有 效 的 3051-3064. ,3 , Spiro S. Nitric oxide-sensing mechanisms in Escherichia ，NO 。 解 毒剂它 能 负 责 大 部 分 消 耗在 有 氧 条 coli. Biochemical Society Transactions，2006，34 ( Pt 1) : HMP NO ，件 下 蛋白能够将 硝酸化在厌氧条件下 200-202. NO NO。 可以还 原 为 近 年 来 对 于 微 生 物 2 ,4 , Fang F. Perspectives series: host/ p athogen interactions. HMP 蛋 白 的 功 能及具体调控机 制 的 研 究 逐 渐 增 response of Staphylococcus aureus is required for echaniss of nitric oxide-related antiicrobial activity. Mmm。 Poole Escherichia coli hmp 多等 人 的 研究表明 的 基resistance to innate iunity. Molecular Microbiology， mmThe Journal of Clinical Investigation，1997，99 ( 12 ) : NO 因缺失突变株较 野生 型 对 的敏感性显著增 2006，61(4) :927-939.2818-2825. ,19,,6 , ichardson ，ibby S，Fang . nitric oxide-inducible RALFA 。 ，Bacillus subtilis ，NO 强此 外在 中能 够 通 过 ,5 , Richardson A，Dunman P，Fang F. The nitrosative stress lactate dehydrogenase enables Staphylococcus aureus to ResDE( respiration) 双 组 分 调 控 系 统 诱导特定基因 ,20,resist innate iunity. Scence，2008，319( 5870) :1672- mmi，hmp 。的转录使 基 因表达本研究结果 表 明金 1676. hmp 黄色葡萄球菌中的 基因的表达明显得受到硝化 ,7 , Frey AD， allio PT. Bacterial heoglobins andMcroboogy Letters，1992，73(1-2) :133-138.Kmiil flavohemoglobins: versatile proteins and their impact on ,15, ，，. 高慧路新枝于文功金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶 icrobiology and biotechnology. FEMS Mcroboogy ( nos ) . miil基 因 缺 失 突 变 株 的 构 建 现代生物医学进展 Reviews，2003，27(4) :525-545. ( Progres s In Modern Biomedicine ) ，2008，8( 10) :1845- 1848. ,8 , ndrews S ，Shipley ，een J ，Findlay J ，arrison P ， ADKH Guest J. The haemoglobin-like protein ( HMP ) of ,16, Shanks RM，Donegan NP，Graber ML，Eschercha co has ferrisiderophore reductase activity and Buckingha SE， Zegans E，Cheung AL， iilimM O Toole GA. Heparin stimulates Staphylococcus ’ its C-terminal domain shares homology with ferredoxin NADP + reductases. FEBS Letters，1992，302 aureus biofilm formation. Infection and Immunity，2005， 73(8) :4596-4606. (3) :247-252. ,9 , Anjum M，Ioannidis N，Poole R. Response of the ,17, Fux C，Stoodley P，Hal-lStoodley L，Costerton J. 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Construction of Staphylococcus aureus RN6390 hmp gene mutant and analysis of NO sensitivity * Peng Jiang，Xinzhi Lu，Fangjie Hou，Zhanjun Liu，Wengong Yu Key Laboratory of Marine Drugs，Chinese Ministry of Education，School of Medicine and Pharmacy，Ocean University of China，Qingdao 266003，China Abstract:,Object,To investigate the function of flavohaemoglobin ( HMP) in Staphylococcus aureus RN6390 under the nitrification pressure，we constructed the hmp gened eletion utant of RN6390 strain. ,Methods,ccording to principle of mAhoologous recobination，we obtained the up strea and down strea sequences fo hmp geneb y PCR using mmmm chromosomal DNA of S. aureus RN6390 as template. Antibiotics pressure and alternating temperature culture were applied for utant strain selection. e verified the clones screened out by genoe and realtie quantification. mWmPCR -mPCR Sodiunitroprusside ( S) ，as nitric oxide ( donor，as used for resistance evaluation. In addition，e m NPNO) wNO wcopared the bacteria biofil foration ability of hmp ge ne utant strain with wild type. ,Results ,e successfully mmmmWconstructed hmp gene mutant strain of S. au reus RN6390. The expression of hmp ge ne was direct correlate with the concentration of exogenous . e found that copared to wild type，the utant strain was ore sensitive to and it is NOWmmmNO prone to form bacteria biofilm. ,Conclusions ,The successfully constructed hmp gene deletion mutant of S. aureus provided the possibilities to further investigate the biological function of hmp genein the resistance of S. aureus to NO from host immune system. Keywords: Staphylococcus aureus，Flavohaemoglobin ( HMP) ，homologous recombination， ( ) :本文责编张晓丽biofilm Supported by the National Programs for High Technology Research and Development of China (2007AA09Z418， 2007AA091506)* Corresponding author. Tel: + 86-532-82031680; E-mail:yuwg66@ ouc. edu. cn Received:14 September 2010 / Revised:22 November 2010 檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶 《》微 生 物 学 报 审 稿 程 序 :? ?问贵刊的审稿程序是怎样的一般多长时间可以知道稿件是否被录用 :“”，:，，。 ，2 ，5 答本刊严格遵守三审制即编辑部内审专家外审主编 总 审从投稿日期开始争 取 在 个月之内给出审稿结果, 7 。个月之内发表 (1) ，2 ，，2 。2 收到来稿后首先将请 位专家进行初审再送主编进行最后的总审这个过程一般不会超过 个月如果初审 位专 ，3 ，，2 。家的意见分歧较大编辑部将再请第 位专家进行初审之后再送主编总审那么此稿的审理时间可能会超过 个月 (2) ( ) ，E-mai l( ) 。 完成审稿后即主编给出总审意见编辑会给作者发出 告知修改意见包括学术上的和写作格式上的 作 ，。者在返回修改稿后经本刊审核合格后方可被录用 ，，。在此提醒作者在没有完成全部审稿之前不要在远程系统中看到初审意见时就急于返回修改稿件