氨基甲酸酯类农药的快速检测
《现代食品科技》ModernFoodScienceandTechnologyVo1.22No.2(总88)
文章篇号:1007—2764(2006)02—0229—081
氨基甲酸酯类农药的快速检测
张淑平,经媛元,单联刚
(上海水产大学食品学院,上海200090)
摘要:综述了氨基甲酸酯类农药快速
的研究进展,并对其种
类原理进行了比较.
关键词:氨基甲酸酯类;农药残留;快速分析方法
TheRapidAnalysisofCarbamateResidual
ZhangShu?ping,JinYuan-yan,ShanLian-gang
rCollegeofFoodScienceandTechnology,SFU,Shanghai200090,China)
Abstract:Inthispaper,therapidanalyticalmethodsforcarbamatepestcideresidualaresummarizedandcompared,involving
spectrophotometry,biosensor,immunoassayandsomeothermethods.
Keywords:Carbamate;Pesticideresidues;Rapidanalyticalmethods
自20世纪70年代以来,由于有机氯农药受到禁用
或限制使用,以及抗有机磷杀虫剂的昆虫品种日益增
多,因而氨基甲酸酯类农药的用量逐年增加,这就使
得氨基甲酸酯类农药的分析检测倍受关注.对于不同
介质(如水,土壤,水果,蔬菜等)中氨甲酸酯类农药
及其代谢产物的测定已经发展了很多的分析方法.如
液相色谱法,柱后水解电化学库仑法等,由于其前处
理烦琐或设备昂贵不太适用于目前国内的现状;从而
也发展了很多快速检测的方法.本文主要介绍氨基甲
酸酯类农药快速检测方法的研究进展.
1比色分析法
利用氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶和羧酸酯
酶的特异性抑制作用发展的酶化学比色分析法已广泛
应用于痕量和微量农药残留的检测.其原理是氨基甲
酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶都有强抑制作
用,所以用比色法测定反应产物和显色剂反应后的颜
色,即可检测氨基甲酸酯类农残.该方法的检出限大
多在meJkg水平,有的可达ug/kg水平.
黄文风等”以碘化硫代乙酰胆碱为底物,在乙酰
胆碱酯酶(AchE)催化下,分解生成碘化硫代胆碱,
能与DTNB作用生成5一巯基一2一硝基苯甲酸(黄色)再于
特征波长处测定溶液的吸光度,根据其变化显示酶抑
制程度,从而知道样品受农药的污染程度.此方法对
十六种农药进行了检测,效果较好.杨东鹏等为了
缩短检测时间对抑制时间为lOmin时的最适条件进行
收稿日期:2005-09-29
了研究.提出了新的最适条件确定标准,从而确定了
新的检测结果判断标准.但由于乙酰胆碱酯酶来源于
动物体,材料昂贵,且保存困难,近年来发展了用植
物酯酶代替乙酰胆碱酯酶的分析方法,该法利用植物
酯酶水解2,6一二氯乙酰靛酚,根据反应溶液在水解前
后颜色的变化,辨别农药对酶的抑制程度.钟树明
等应用植物酶抑制技术检测蔬菜中的氨基甲酸酯类农
药,取得了一定的成果,并根据有关标准提出了抑制
率阈值.比色分析法为定性分析提供了一种快捷简便
的方法,但对氨基甲酸酯类农药的精确定量分析有一
定的局限.
2酶片法
酶片即为浸渍有胆碱酯酶或其它敏感酶类的滤纸
片或类似载体物质,根据纸片的颜色变化来反映酶活
性受氨基甲酸酯类农药抑制的程度.这种简单的载体
作用,可以达到便于携带和现场操作的目的.王林等
人用固化有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的试纸片建
立了适合我国蔬菜中部分农药残留限量的现场监督检
测的速测卡法,检出限一般在0.3—3.5mg/kg,检出时
间为15min,操作简单,速度快,测试成本低廉.宋
茹等人以酶抑制法为依据,研究了一种成本低廉,
适用范围广,灵敏度高,可以作定性及半定量分析的
酶片快速检测法.以马血清中的乙酰胆碱酯酶与底物
氯化乙酰胆碱作用生成醋酸,根据反应前后的pH值变
化及根据指示剂的颜色变化情况判断氨基甲酸酯类农
药的抑制程度及残留量.应用于实际情况检测中黄瓜
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《现代食品科技》ModernFoodScienceandTechnologyVo1.22No.2(总SS)
的效果较好.与气相色谱法比较也足以用于实际检测.
但酶片法会常遇到酶活性和灵敏度降低,测不出超标
农药的现象,有时甚至还会产生假阳性.
3生物传感器
生物活性单元的固定化技术是生物传感器制作的
核心部分,它既要保持生物活性单元的固有特性,又
要避免自由活性单元应用上的缺陷.生物活性单元的
固定化技术决定着生物传感器的稳定性,灵敏度和选
择性等主要性能,也决定着生物传感器是否有研究和
应用价值.早期的生物活性物质测量法,如酶分析法,
是在水溶液状态下进行的,由于酶在水溶液中一般不
太稳定,且酶只能和底物作用一次,因此使用起来很
不方便.要使酶作为生物敏感膜使用,必须研究如何
将酶固定在各种载体上,这称为酶的固定化技术.
固定化酶是指通过化学或物理学手段将酶束缚在
一
定区间内,限制酶分子在此区间内进行活跃的催化
作用.固定化酶技术是酶学研究中的新领域.通过酶
的固定化技术,可以极大改善酶对热,强酸,强碱,
有机溶剂等不够稳定的性质,并且在反应结束后,很
容易将酶与反应液分开,同时酶也可以多次使用,极
大地提高了酶的使用效率.酶的固定化技术在60年代
以后得到广泛重视和积极研究,部分固定化酶已获大
规模工业化应用.目前固定化酶技术的应用多局限于
单级酶反应方面,而对一些复合酶,多级酶反应的固
定化研究将更有意义.因为酶在细胞中的定位通常是
一
个多酶体系,酶与酶之间往往是前一个酶的反应产
物就是下一个酶的反应底物,酶在此细胞环境中才能
发挥最大催化效率.
常用的固定化技术有四种:吸附法,共价法,交
联法,包埋法.
吸附法:吸附法是最简单,最具经济吸引力的方
法,操作简单,可供选择的载体类型多,吸附过程可
以同时达到纯化和固定化的目的,且酶失活后可重新
活化再生.分为物理吸附法和离子交换吸附法.常用
载体有无机载体,有机载体,有机大分子物质等.
包埋法:包埋法是将酶物理包埋在多聚物内的一
种方法,反应条件温和,便宜,简便.分为凝胶包埋
法和微囊化法(界面聚合法,分相法,流体干燥法,流
膜法).常用包埋载体有聚丙酞胺,淀粉,聚乙烯醇,
海藻酸盐,胶原,明胶等.
载体偶联法:将酶分子的必需基团经共价健与载
体结合的方法,又称共价法.载体含功能基团:芳香氨
基,羟基,羧基,羧甲基,氨基等,是研究中最活跃
的一类方法.
交联法:利用双功能或多功能试剂,使酶分子之间
或酶蛋白与其它惰性蛋白之间发生交联,凝聚成网状
结构,对酶进行固定.戊二醛是应用最广泛的双功能
试剂.
没有一种固定化方法能普遍适用于每一种酶.寻
找合适的固定化方法和选择相应的载体是酶固定化研
究的重点.一方面载体和酶要尽可能在温和条件下操
作,另一方面要使操作相对简单,成本相对低廉,还
要保证酶活.酶经过固定后,可用测定以下参数来判
断固定化方法的优劣以及所得固定化酶的实用性:固
定化酶的活力,固定化酶的活力回收,固定化酶的半
衰期.而目前的固定化酶研究中要么酶活不高,操作
半衰期不够长,要么成本过高,不符合大工业生产的
.
纵观生物传感器发展的历史可知,生物传感器的
发展史就是固定化技术不断改进和完善的历史,固定
化技术的研究就是对固定化方法和生物活性载体的研
究和开发.目前使用的固定化载体,方法或技术存在
着这样或那样的问题,难于从根本上提高生物传感器
的稳定性,选择性,灵敏度,准确度和响应速度等性
能.因此,使用更简单,更实用的新型固定化技术和
性能更优异的载体材料以促进固定化生物活性单元获
得更多的实际应用仍是该领域今后研究的重要方向之
O
用于氨基甲酸酯类残留分析的生物传感器是基于
乙酰胆碱酯酶被一种或几种分析物的抑制作用的检
测,生物敏感层是利用酶的固定化方法将特异性酶与
载体结合在一起,因此可以反复使用.这种生物传感
器的类型一般包括电位型和安培型两种.乙酰胆碱在
酶的催化作用下可以水解为乙酸和胆碱,乙酸进一步
电离,从而使溶液pH值发生变化,由此可
成电位
型酶电极;如在上面的反应中以硫代胆碱代替乙酰胆
碱,生成的巯基胆碱则可在Pt,玻碳等电极表面氧化,
据此可设计成安培型酶电极.朱玲,安哲等用尼龙网
共价键合法固定胆碱氧化酶与氧电极偶合制成传感
器.并采用将乙酰胆碱酯酶溶于溶液中的双酶体系测
定氨基甲酸酯类农药,实际测定了水体中农药残留量,
结果较为满意.目前生物传感器技术在农药中的应用
大多还停留在实验阶段,尚未形成产品应用于实际测
定中,因此加强该方面的研究是必不可少的.
4免疫检测
农药及其代谢物的酶免疫分析是9O年代的一项新
《现代食品科技》ModemFood~ienceand1khn0l0gyv0I.22No.2(总懿)
技术,具有快速,灵敏,费用低,特异性强和适于现
场大批量样品筛选等优点.联合国粮农组织(FAO)
已向许多国家推荐此技术,美国化学会将免疫分析和
气相色谱,液相色谱列为农药残留分析的支柱技术.
农药残留酶免疫测定技术(EIA),是生物酶技术,
免疫分析技术应用于农药残留分析领域的一门新技
术,主要是依据抗原和抗体之间的特异性识别和结合
反应来进行的.此方法的关键就是要制备高效价特异
性的抗体,以提高检测的特异性和灵敏度.为揭示微
量抗原与抗体的免疫学反应进行情况,需要引人一种
酶作为示踪物,常用的为辣根过氧化酶等随着EIA的稳
定性和灵敏度不断改善,自1983年以来,农药分析中
几乎都使用此法尤其是酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)
使用最广泛,现己成为首选的方法,该技术虽然开发
难度和投资都较大,但具有快速,灵敏,特异性强,
价廉,不需烦琐的预处理,可现场操作,不需专门操
作人员等优点,因此越来越受到重视.近年来,免疫
检测技术已广泛应用于氨基甲酸酯类农药残留的检
测.
一
般而言,具有免疫原性的物质分子量应大于1.0
×104Da,而一般农药的分子量小于1.0×103Da,不具备
刺激机体产生针对农药抗原决定簇的特异性抗体,因
此必须与大分子载体偶联后才具有免疫原性.要实现
与大分子物质的偶联,半抗原分子上必须具备能共价
结合到载体上的一个活性基团(如氨基,羧基,羟基
和巯基等).然后再进行免疫,抗原与抗体之间的反
应无论在体内,体外均可特异性的进行,这是EIA得以
实现的保证.
由于氨基甲酸酯类农药多为低分子量的小分子,
必须与载体结合(如蛋白质)形成抗原,才能免疫兔,
羊等动物使机体产生抗农药的抗体,并取其免疫动物
血清,然后进行分离,鉴定其特异性抗体.抗体的产
生一般可采用两种途径:多克隆抗体技术和杂交瘤技
术生产单抗,再通过被测定物与特定抗体之间相互作
用,进行定性定量测定.
氨基甲酸酯类农药免疫检测发展也很迅速,且多
采用克隆抗体技术,~IItakfg]等人用抗体磁颗粒ELISA
法检测水中的西维因,此技术可使颗粒均匀地分布在
反应混合物中,检测限为0.22,0.25ugm,且与液相色谱
(LC)检测结果有极好的相关性.应用该技术还可以
检测水,果汁和土壤中的多菌灵(苯菌灵的酸分解物),
涕灭威等.Lehot),等应用利用酶免疫检测技术生产的
一
种商品试剂盒测定了肉和肝样品中的呋喃丹和涕灭
威砜.另外,有报道肉样品中的呋喃丹和其他农药经
过SFE提取后采用磁性颗粒酶免疫检测法检测….我国
的研究者也自行开发了许多免疫检测方法,胡秀卿,
朱国念等纠通过活化酯法与牛血清蛋白联接,制备出
较高活性的人工抗原,以此来免疫兔子制备抗克百威
的多克隆抗体.该方法对克百威标准品的最低标准量
为0.175ng/ml,线性检测范围为0.256—4000.0ng/ml,
在线性检测范围内,添加不同浓度克百威的蔬菜样品
检测的批内,批间变异系数均小于10%,在甘蓝菜样
品中的添加回收率试验回收率为93.096,变异系数为
4.3%.所得克百威抗体特异性强,与丁硫克百威的交
又反应率为9.15,与呋喃酚的交叉反应率为5.29,与
供试的其它3种氨基甲酸酯类的交叉反应率均小于
0.5.然后在获得人工抗原后经免疫兔子获得了高效价
的抗克百威抗体.
刘曙照等人成功地合成了克百威,西维因的
人工抗原,并在免疫兔子体内获得对克百威,西维因
具特异性的高效价抗体,建立并优化了痕量克百威,
西维因的竞争性酶联免疫吸附检测法,该法测定克百
威的线性浓度范围为l0(L_l04ul1L检测限低于
0.01n~mL,测定西维因的线性浓度范围为l0u_lOr4
ug/InL,检测限低于0.01n~mL.
多克隆抗体方法具有生产成本低,方法简便等特
点,但是其抗体的特异性不够强,会随着动物种类及
个体差异而有变化,从而在一定程度上限制了其在免
疫检测中的应用.随着单克隆抗体技术的日渐成熟,
该技术己成为ELISA在农药残留速测技术中应用发展
的新趋势.单克隆抗体是作用于同一抗原决定簇的,
完全均一的单一抗体,不易产生交叉反应,使检测具
有很高的特异性.由于氨基甲酸酯农药是一种小分子,
是一种半抗原,无免疫原性,所以要根据农药的结构
选择合成路线,人工合成抗原,将免疫抗原免疫实验
用鼠,一般为BALB,c小鼠,然后取免疫鼠脾细胞(B淋
巴细胞)与骨髓瘤细胞杂交,并进行克隆化繁殖培养,
最后筛选出能稳定分泌产生特异性抗农药的单克隆抗
体的细胞株,并分离鉴定其产生的特异性抗体,测定
其效价,再进行体外一定环境条件下的繁殖培养,生
产出单克隆抗体.用于农药免疫监测.
Abad等用西维因与牛血清蛋白结合免疫小鼠,
制备了单克隆抗体,同时制备多抗血清进行比较,用
竞争和非竞争EUSA法检测西维因,西维因单克隆抗体
与几种N一甲基氨基甲酸酯及西维因主要代谢产物萘酚
无交叉反应,西维因多抗血清与萘酚交叉反应达12%.
随后,Abad等在对西维因结构分析的基础上,用不同
载体蛋白制备单克隆抗体和多克隆抗体,发现其灵敏
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性和特异性不受载体蛋白的影响,单克隆抗体技术具
有极好的特异性和灵敏性,用之检测水样,检测限达
0.01ug/L,而西维因的主要代谢物萘酚却没有检出,
再次证明单克隆抗体技术是水中低含量西维因免疫分
析的理想方法.单克隆抗体技术是由单一的B淋巴细胞
克隆,针对单一的抗原决定簇产生的均一的免疫球蛋
白,具有理化性质高度均一,生物活性单一,与抗原
结合的特异性和亲和力高等优点,因此比多克隆抗体
技术更适于各类农药的免疫检测.虽然单克隆抗体在
农药免疫分析中已显示出明显的优越性,但仍存在一
些不足,主要表现为抗体制备过程复杂麻烦,假阴性
和假阳性偏多,有的单克隆抗体在进行检测时存在一
定的交叉反应,只能检测一类结构相似的化合物,样
品的一些成分对检测结果干扰大,一次实验仅能检测
一
种农药残留等”.随着免疫分析技术的快速发展,
免疫分析中存在的问题正在或将会很快得到解决.如
分析农药小分子的结构,深入探讨其抗原决定簇的位
置,通过化学方法封闭或突出某个(某些)特定的抗
原决定簇,就可以制备该决定簇的特异性抗体,以增
加检测的特异性,避免交叉反应;而免疫学技术和
其他技术相互结合,也能发挥各种技术的优势.近年
来,国内外已经开发出杀虫剂,杀菌剂,除草剂等40
余种农药的酶免疫分析方法.其中用于田问快速筛选
的酶免疫分析试剂盒已商品化,在现场1h可完成16个
样品的测试,且具有特异性强,灵敏度高(检测限可
达10’9__一10g),分析容量大,分析成本相对较低等特
点,配备一台便携式分光光度计,可以实现定量的目
标.测试结果与常规方法比较一致,但不需要费时的
样品抽提,净化,使用溶剂量少,方法不需要经过培
训就可以掌握.免疫分析具有上述如许多突出的优点,
因此越来越受到人们的重视,新成果不断推出,从而
测定方法也越来越完善.这种学科交叉技术应用于农
药残留分析将成为世界各国的学术研究和开发研究的
新热点.
5小结
随着有机磷农药的禁用,氨基甲酸酯类农药用量
的不断增加,氨基甲酸酯类农药残留的分析检测方法
也越来越受到大家的关注.氨甲酸酯类农药及其代谢
产物的测定已经发展了很多的分析方法.这类农药的
测定由于热稳定性差多采用液相色谱法,但它的前处
理繁琐,测定周期长,测定成本高限制了它的使用范
围.基于酶抑制技术的快速检测分析方法已发展了多
种检测技术,但灵敏度方面还有待提高.生物传感器法
232
和酶免疫分析法对氨基甲酸酯类农药的检测还有很大
的研究空间.目前各种方法均有各自的优点,但同时
也不同程度地存在不足,在实际应用中应根据实际条
件和研究需要选择相应的检测技术.
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