兔关节内积血对关节软骨影响的实验研究

兔关节内积血对关节软骨影响的实验研究 中国康复医学杂志,2007年,第22卷,第1期ChineseJournalofRe丝::!!!:丝!!:! . 基础研究. 兔关节内积血对关节软骨影响的实验研究 张继春-陈金栋-陈百成-田德虎 摘要目的:探讨短期关节内积血对关节软骨基础研究的影响.方法:新西兰大白兔36只随机分为2组.A组:右 后膝关节内注入自体静脉血4m1.左后膝关节作为空白对照,在第3天重复一次,剂量同前.B组:右后膝关节内注入 自体静脉血4m1.左后膝关节2ml,其余步骤与A组完全相同.分别于第l周,4周,8周取材,测定水,胶原含量的改 变.同时进行大体及光镜观察.结果:?受出血影响,第l,4周含水率都明显增加(均为P<0.05),第8周时与对照组比 较无明显差异(尸0.05).胶原含量在第l周低于对照组P<0.05),4ml 组低于2ml组(P<0.05).第4,8周与对照组比较均 无明显差异(.o.051.?HE染色结果:实验侧软骨表面不光滑,细胞排列欠整齐,潮线变模糊.4ml侧比2ml侧变化明 显.结论:不同量的关节内出血对关节软骨的影响不同,量大者对含水 率,蛋白多糖,胶原的影响大于量小者. 关键词关节软骨;关节内积血;含水率;胶原 中图分类号:R684,R49文献标识码:A文章编号:1001—1242(2007)一 0l一0031—03 Experhnentalstudyonblood-induceddamagetoartic~rcartilageinGJichun,CHEN Jindong,CHENBaicheng,etalJIChineseJournalofRehabilitationMedicine,2007,22(1):31--33 AbstractObjective:Toexploretheblood-induceddamagetoarticularcartilageinhemarthrosis.Method:Thirty— sixrabbitswererandomlydividedinto2groups.IngroupA,freshautologousblood(4m1)wasinjectedintothe rightkneeposteriorlyatday1.Thesamevolumeofbloodwasinjectedintothesamekneeatday3.Contralateral (1eft)kneewerenotinjectedatalltoactascontro1.IngroupB,4mland2mlbloodwasinjectedintorightknee andleftkneerespectivelytoobservethedestructiononcartilagebydifferentamountofblood.Theanimalsofeach sub-groupweresacrificedatthe1st,4thand8thweekrespectively.Thecontentsofwaterandcollagenwere compared.andthechangesofpathologywereobserved.Result:? Watercontentincreasedsignificantlyattllelst weekand4thweekcomparedwiththecontrolgrouprP<0.05).Therewasnodifferenceofwatercontentatthe8th week(P>0.05).Thecollagencontentwaslowerthanthecontrolatthe1stweekandhigheratthe4weekand8th weekthanatthe1stweekf 尸:<0.05).Thecollagencontentin4mlgroupwaslowerthanthatin2mlgroupatthe 1stweek(尸 <o.05).Therewasnodifferencebetweentwogroupsatthe4thweekand8thweek(P>0.05).(2)Light microscope(HE)observation:Thearticularcartilageofexperimentalsidebecameroughwithmoredivisioncells.The tidemarkbecameunclear.Alloftheseappearancesweremoreapparentin4mlgroupthanin2mlgroup. Conclusion:Differentamountsofbloodresultsindifferentdamagetoarticularcartilage.Morebloodcancause morechangesofthecontentofwater,proteoglycan(PG)andcollagen.Moreattentionshouldbepaidtojoint bleeding.Bloodshouldbeclearedoffthroughpuncturetodecreasethedamagetoarticularcartilage. AuthorsaddressDepartmentofJointSurgery,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang, 050o5l Keywordsarticularcartilage;hemarthrosis;watercontent;collagen 关节内出血在运动损伤中非常多见.如肌腱韧 带拉伤,关节囊撕裂伤,关节脱位,关节内无移位骨 折等.常常造成关节内出血.使关节软骨暂时处于一 种血液浸润的环境临床上多予以保守治疗而令血 液自行吸收.这样使关节发生骨关节炎 (osteoarthritis.OA)的几率明显增加【l1国外已有学 者用细胞培养的方法对相似的病理过程进行了研 究.软骨细胞与血液接触几个小时就会对软骨细胞 造成严重的损害闭.但血液导致关节软骨损害的机制 及与时间的关系还不是十分清楚本实验旨在探讨 其发生机制,为治疗关节内出血.保护关节功能提供 理论依据. 1材料与方法 1.1实验动物 实验动物为8月龄新西兰大白兔36只.雌雄不 限,分笼喂养,体重2.5?O.2kg,河北医科大学动物实 验中心提供. l河北医科大学第三医院手外科,河北省石家庄市自强路139号, 050o5l 作者简介:张继春,男,教授,主任医师,博士 收稿日期:2005—12—20 !里墨垦兰墨查:!!!篁丝堂!篁塑竺竺!型!垒生丝!: 1.2主要试剂侧变化稍明显. 氯代十六烷基吡啶.鼠抗人?型胶原抗体,SP 试剂盒f含封闭用山羊血清,生物素标记的羊抗人 IgG1单抗,辣根酶标记的链酶卵蛋白素),DAB显色 剂,羟脯氨酸,二甲氨基苯甲醛. 1.3实验方法 1-3.1实验动物分组及模型制作:将36只实验动物 随机分为2组.A组于第1天,用3%戊巴比妥钠 30mg/kg行静脉注射麻醉.预先在右后膝关节内侧 髌股间隙放置一头皮针.然后从颈静脉采自体静脉 血4m1.自体血不使用抗凝剂,经头皮针注入关节 内此时可观察到关节腔髌骨两侧呈对称性膨胀,证 明自体血准确无误地注入关节腔于第3天重复注 射自体血一次,剂量同前.左后膝作为空白对照组. B组:每只动物的右后膝关节内每次注入4ml自体 静脉血.左后膝关节每次注入2m1.其余步骤与A组 完全相同 1.3.2组织学取材与固定:A组和B组再各随机分 为3组,每组6只,分别于1周,4周,8周处死动物 后立即取材在取材时行大体观察,观察内外髁关节 软骨的色泽,质地,表面光滑程度.于内髁取材一块, 取材部位位于股骨内髁后部负重区的内缘与外缘中 点,此点距内髁后缘3mm.宽约2mm.将关节软骨连 同软骨下骨一同取下用手术刀小心将关节软骨剥 下,避免带上软骨下骨质.以免影响结果的准确性. 一 半用于含水率的测定,一半用于胶原含量的测定. 去除多余软骨下骨.置人含有1%氯代十六烷基吡 啶的l0%中性甲醛溶液固定48h.用于组织切片 1.4统计学 结果用均值?标准差表示.采用SPSS10.0统计 软件,同一组内不同时间点的比较采用方差分析.两 组之间同一时间点的比较采用配对t检验.检验水 准a:0.05 2结果 2.1大体观察 正常关节软骨表面十分光滑.均匀一致.有光 泽,呈瓷白色.实验侧关节软骨色泽稍暗,表面粗糙. 术后第l周最为明显,第4周渐好转.第8周恢复至 正常光泽4?d组比2?d组变化稍明显 2.2HE染色 正常关节软骨表面光滑,软骨细胞分布均匀.无 簇聚软骨细胞.潮线清晰完整.实验组软骨表面不光 滑,可见细小碎屑.细胞排列欠整齐,细胞分裂相增 多,可见软骨细胞簇聚,潮线变模糊4ml侧比2ml 2.3含水率的改变 实验组关节软骨的含水率在第1周及第4周显 着增加.与空白对照组比较P<0.05.第8周时与对 照组无明显差异0.05);第4周的含水率低于第1 周fP<0.05),第8周含水率低于第4周(尸<0.05)(见表 1). 4ml与2ml两实验侧在第1,4周,两侧的含水 率有显着性差异.4ml侧大于2ml侧f均P<0.05).在 第8周两侧比较无显着性差异(P>0.05)(见表2). 2.4胶原含量的改变 4ml与2ml两侧在第1周胶原含量经配对t检验 有显着性差异fP<0.05),4ml侧低于2ml侧.两侧在 第4周及第8周比较无显着性差异fP>0.05). 表1两组不同时间的含水率比较?s,%) 相同时间比较P<O.05 表24ml组与2ml组不同时间的含水率比较?s, 同时间比较P<O.05 表34ml组与2ml组不同时间的胶原含量比较?s,m 相同时间比较P<O.05 3讨论 反复关节内出血在临床上较常见.临床医生多 采取保守的治疗方法.而最终会导致关节软骨的损 害,这已为临床学者所公认.然而在关节软骨代谢活 动改变之时与可被MRI,放射检查,关节镜检查发现 之时相距一定的时间,在若干年后,受损关节表现出 退行性改变,这已引起临床学者们的重视.有些学者 认为关节内出血首先对滑膜产生影响.滑膜吸收血 液后产生的炎症介质再作用于关节软骨.引起继发 损害【3】.另有一些学者则认为.关节内出血可直接对 关节软骨造成损害.因为在滑膜产生病理改变之 前,关节软骨已有所改变.不管何者在先何者在后. 关节软骨都将产生一定病理变化主要变化主要集 中在软骨细胞,胶原,蛋白多糖和水含量与其功能的 改变上 中国康复医学杂志,2007年,第22卷,第1期 3.1关节内出血对关节软骨含水率的影响 ChineseJournalofRehabilitationMedic,.!!!!:!!:! 水在关节软骨中所占的比例最大.关节软骨中 的水有利于气体,营养和废物的弥散,在软骨细胞和 周围营养丰富的滑液之间相互交换.水与基质中的 胶原和蛋白多糖结合成凝胶状.既维持了关节软骨 基质的正常结构.同时又参与软骨组织中的流体静 压力的形成.与关节软骨生物力学性能密切相关.本 实验表明出血后第l周含水率明显增多,以后随时 间的推移而下降.至第8周降至正常水平.含水率的 影响因素较复杂.和胶原含量及结构,亚成分变化均 有关系.关节软骨中的水可分为游离水和结合水两 部分.前者主要靠渗透现象由关节腔进入.渗透压的 大小主要取决于蛋白多糖的数量多少;后者多与胶 原或蛋白多糖内的阴离子呈非共价结合.主要靠胶 原或蛋白多糖的水合作用形成[51.因此渗透与水合作 用的变化将引起软骨内含水率的改变.这种改变可 随病理过程的不同而不同.在关节内出血早期.虽然 蛋白多糖和胶原含量下降.但组织损害加重.组织渗 透性,电荷密度和应力改变引起炎症介质释放.软骨 细胞合成和增生反应性下降.蛋白多糖聚集体减少. 小分子量单体增多.引起渗透压的持续增大.关节软 骨内的水有增加的趋势.从而导致含水率的增加嘲. 至后期.虽然蛋白多糖和胶原合成有所增加.但其新 合成的蛋白多糖分子量较小.蛋白多糖与胶原生物 学性能下降.同时炎症介质减少.组织肿胀减轻.导 致水合作用降低.含水率逐渐减小.本实验发现出血 4IIll组较2ml组在相同时间点上的含水率增加显 着.说明出血量的多少对关节软骨有明显的影响.因 此含水率的多少可作为关节软骨病理改变的一项灵 敏指标. 3.2关节内出血对胶原含量的影响 本实验表明关节内出血后仅在第l周胶原含量 减少.至第4周时已恢复至正常水平说明关节内出 血对胶原的影响较对蛋白多糖和水的影响小.其原 因可能是因为胶原分子的半衰期比蛋白多糖的半衰 期长.其减少部分可能是已经降解的胶原.短期少量 出血尚不足以引起胶原网络的广泛破坏.胶原在第 4周已无可探测到的明显变化.但并不能说明胶原 网络的结构及其功能完全恢复正常,因同时伴有含 水率及蛋白多糖的变化.其功能是作为一个整体而 发挥作用的. 3.3对关节内出血是否进行穿刺抽吸在目前仍存 在着争论 对血友病患者进行穿刺有可能造成进一步的损 伤171.一些学者认为少量关节内出血很快会吸收,不 会造成软骨损害.且穿刺有招致关节内感染的可能. 本实验研究结果表明短期.关节内出血造成关节软 骨一段时间的病理变化.并且其病理变化与关节内 出血量的多少有关.这与Mulder等【81的报道相一致. 他们认为.单次关节内出血在若干年后会不可避免 地造成关节退变.所以关节内出血应尽量穿刺抽吸. 减少关节内血液的残留.这对于干预退变性骨关节 炎的发生有一定的临床意义. 总之.不同量的关节内出血对关节软骨的影响 不同.量大者对含水率,胶原的影响大于量小者.临 床上应对关节内出血引起重视.在条件允许的情况 下.尽量进行穿刺.以减少血液对关节软骨的影响. 参考文献 【1】LohmanderLS,RoosH.Kneeligamentinjury,surgeryandOS- teoarthrosis:truthorconsequences【J】?ActaOrthopScand,1994, 65:605—609. 【2】HooivldM,RoosendaalG,VianenM,eta1.Blood-inducedjoit damage:Longtermeffectshumaninvitroandinvivo?】.J Rheumatol,2003,30(2):339--44. 【3】HakobyanN,KazarianT’ValentinoLA.Synovitisinamurine modelofhumanfactor~deflciency[J1.Haemophilia,2005,1l(3): 227—32. [41TanAH,MitreAK,ChangPC,eta1.Assessmentofblood—in- ducedcartilagedamageinrabbitskneesusingscanningelec- tronmicroscopy[J].JOrthopSurg,2004,12(2):199--204. 【5】MarondasA,VennM.Chemicalcompositionandswellingof normalandosteoarthroticfemoralheadcartilage[J].AnnRheum Dis,1997,36:399—4o6. 【6】曹月龙,石印玉,张戈,等.兔骨关节炎关节软骨含水率随时间 变化的实验研究?】.中华风湿病学杂志,2001,5:332—333. 【7】RibbansWJ,GiangrandeP,BeetonK.Conservativetreatment ofhemarthrosisforpreventionofhemophilicsynovitis[J1.Clin OrthopRelRes,1997,343:12—18. 【8】MulderK,LlinasA.Theargetjoint[J1.Haemophilia,2004,10, (supp14):152--156.