温郁金中新二萜类化合物C诱导人结肠腺癌SW620细胞凋亡的相关通路研究(可编辑)
温郁金中新二萜类化合物C诱导人结肠腺癌SW620细胞
凋亡的相关通路研究
??
396?? 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBulletin
2011Mar;27 3 :396,401
温郁金中新二萜类化合物C诱导人结肠腺癌 SW620
细胞凋亡的相关通路研究
沈 雁 ,吕 宾 ,张 烁 ,马忠俊
1(浙江中医药大学附属第一医院消化内科,浙江杭州 310006;2(浙江大学药学院现代中药研究所,浙江杭州 310058
中国图书分类号:R284(1;R329(25;R735(350(22;R979(1 生长并诱导凋亡,其作用机制可能与抑制MAPK信号转导通
路、活化 caspase一3有关。
文献标识码:A 文章编号:1001―1978 2011 03―0396―06
摘要:目的 探讨温郁金二萜类化合物 C诱导人结肠腺癌
关键词:结肠腺癌;温郁金;二萜类;增殖;凋亡;MAPK;
SW620细胞凋亡的作用机制。方法 以5一氟脲嘧啶 5-Flu―
caspase一3
orouracil,5-FU 为阳性对照药物;采用噻唑蓝 methylthia―
zolyltetrazolium,Mrrr 还原法检测化合物 C和 5一Fu对
SW620细胞增殖的影响;用流式细胞术 flowcytometry,
结肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤,在世界范
FCM 检测两种药物诱导细胞凋亡的情况;用 Westernblot法
围内,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势?I2j。鉴
检测化合物C作用后,细胞中ERK、P―ERK、JNK、P―JNK、p38、
于其早期诊断策略尚不成熟,以及放化疗毒副作用
p-p38及caspase一3蛋白水平的变化。结果 化合物 C能抑
所造成的临床应用限制,因此研发传统中药材中潜
制SW620细胞的增殖活性,并明显诱导细胞凋亡,其抑制率
在高效的抗癌活性成分不失为对抗结肠癌的一个新
和凋亡率呈时间 一浓度依赖性,且都明显高于5-FU组;其
选择。
24、48和 72h的 IC 分别为29(75、15(91和6(55mg??L,;
温郁金是姜科姜黄属植物温郁金 Curcumawe(
化合物C能浓度依赖性地下调细胞中ERK、JNK、p38及其相
nyujinY(H(ChenetC(Ling的干燥块根。研究表明,
caspase一3的蛋白表达。结论 应磷酸化蛋白的水平,并刺激
它具有降脂、护肝、抗肿瘤、抗辐射等广泛的药理活
温郁金二萜类化合物C能抑制人结肠腺癌SW620细胞的
性 J。近年来,温郁金的抗肿瘤效应日益受到关
收稿日期:2010―11―04,修回日期:2010―12―27
注:研究发现其多种提取液在体内外均能抑制胃癌
基金项目:浙江省中医药普通课题研究计划 No2009CB014
的形成和发展;其醇提物中的姜黄素和其醚提物中
作者简介:沈 雁 1985一 ,女,硕士生,研究方向:中西医结合消化
的榄香烯已被证实为显效的抗癌成分。在此基础
系统疾病,E-mail:shendanxi61115@163(tom;
上,笔者进一步从其醚提物中分离得到另一种全新
吕 宾 1963一 ,男,教授,主任医师,博士生导师,研究
的二萜类化合物c。本实验拟观察该化合物C对人
方向:中西医结合消化系统疾病,通讯作者,E-mail:lvbin
@ medmai1_com cn
结肠腺癌SW620细胞增殖、凋亡的影响及相关信号
significantlyinhibitedLPS--induced activationofmicro--
neurotoxicitybymeasuringthe[H]DAuptakeand
counting ofTH―immunoreactive cells(Microglia were gliaand production ofTNF一仅(NO and superoxide in
ratmesencephalic neuron--glia culturesand microglia-??
visualizedbystainingfortheCR3complementreceptor
enriched cultures(In addition,the potency order of
withmonoclonalantibody0X-42(Theproductionofni―
thesefiveisoflavoneswas:pratensein daidzein caly―
tricoxide NO wasdeterminedbymeasuringtheaccu―
cosin formononetin ifilone(Conclusions A11five
mulatedlevelofnitriteintheculturesupernatantwith
theGriessreagent,and the releaseoftumornecrosis
isoflavonesfromTrifoliumpratensemayprotectdopam―
- factor―Ot TNF―Ot wasmeasuredwitharatTNF一 en
inergicneuronsfrom LPS―induced injury andtheir
effectsin
inhibitingmicrogliaactivationmaybeoneof
zyme??linked immunosorbentassay kit(The production
themechanisms(Moreover,therankorderofprotective
ofsuperoxidewasdeterminedbymeasuringthesuper―
potencyofthesefiveisoflavonesis:pratensein daid―
oxidedismutase SOD -inhibitablereductionofcyto―
zein calycosin
formononetin ifilone(
chromeC(Results Allfiveisoflavonesdose―depend―
entlyattenuatedLPS--induceddecreaseindopamineup--
Keywords:
Trifoliumpratense;isoflavone;microglia;
dopaminergicneuron;tumornecrosisfactor―OL;nitricox―
take and the numberofdopaminergic neurons in rat
ide;superoxide
mesencephalicneuron―gliacultures(Moreover,theyalso
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通路蛋白表达及活性的变化,来阐述其抗癌作用的 阴
性对照组 A一空白对照组 A ×100,。
生物学机制,为寻找有效的结肠癌治疗药物提供理 1(4
FCM检测细胞凋亡情况 细胞培养并接种于
论依据。 中号培养皿中,每个培养皿6×10 ??L,,3ml,培养
1 材料与方法
24h后换成含化合物C的培养
、 液3ml干预,设40
55、70mg??L 3个终浓度的实验组及阴性对照组,
1(1 药物、试剂和仪器 温郁金二萜类化合物 c
由浙江大学药学院现代中药研究所分离提供 ,其 阳性对照组为相同浓度梯度的5(Fu组,每组重复3
分子量为380,分子式为C::H 0。 次。培养 l2、24、48h和72h后,用不含EDTA的胰
酶消化细胞,PBS漂 洗 2次 2000r??min,,5
min ,并用500 l的Bindingbuffer悬浮细胞,再加
入5 lAnnexinV―FITC混匀,室温、避光、反应 5,
15min后,上机检测。
1(5 Westerblot检测蛋白表达 将对数生长期细
胞 1X10个分别以0、40、55、70mg??L 化合物 C
作用48h后,用0(25,胰酶消化、PBS漂洗,再加入
5-氟脲嘧啶 5-Fluorouracil,5一FU 注射液由天
150Ixl新鲜配置的RIPA裂解液,放冰上裂解 30
津金耀氨基酸有限公司提供 批号:0910221,分子
min,4~C12000r??rain。。离心 10min,收集上清液,
量:130(08 。Leibovitz’SL一15培养基及 0(25,胰
用 Bradford法测定蛋白含量;各浓度组的蛋白均取
酶均为杭州吉诺公司产品;胎牛血清购自北美Gibco
30 g,加等体积上样 Buffer混合,IO0~C变性5min
公司;M1Tr 噻唑蓝 干粉购 自Ameresco公司;An―
后,以每孔20 l的上样体积加入 12,的分离胶和
nexinV,PI凋亡试剂盒购 自Biouniquer公司;兔抗
5,的浓缩胶中进行 SDS―PAGE电泳,之后用半干半
p38、P-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK、caspase一3及
湿转膜仪250mA电转2(5h将蛋白转移到PVDF
B(actin均为CellSignaling公司产品;抗兔二抗及抗
膜上;用含 5, BSA的 TFBS 0(1, Tween一20,10
Thermo 、 鼠二抗为Jaskson公司产品。CO 培养箱
mmol??L,Tris(HC1,pH7(5,150mmol??L NaC1
生物安全操作柜 Thermo 、流式细胞仪 BD 、离心
4~C封闭过夜;分别用抗 ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、
机 Thermo 、电泳仪 BD 、半干半湿转膜仪 BD
p38MAPK、p-p38MAPK、caspase一3、B―actin的一抗
等用于本实验。
和相应二抗孵育,TrBS洗膜3次,每次 10min;最后
1(2 实验细胞系和培养条件 人结肠腺癌细胞
用增强化学发光法 ECL 检测阳性信号,显影后根
SW620 株购自中国科学院院上海细胞库,生长于 据彩色标
准电泳指示条带 marker 中的位置来分析
含10,胎牛血清的L-15培养基中,置37,、体积分
各电泳条带的性质。
数为5,的CO 培养箱中常规培养。实验时取对数
1(6 统计学分析 数据用 SPSS17(0统计软件包
生长期细胞。 分析,结果用 ?s表示,两组间均数比较用t检验,
1(3 噻唑蓝还原法 MTT法 检测细胞增殖抑制
多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比
情况 细胞传代并接种于 96孔培养板中,每孔
较采用 Least―SignificantDifference LSD 法。
结果 10000个细胞,200 l,孵育24h后吸弃上清液,每 2
孔加入含化合物c的L一15培养液200 l,使终浓度
2(1 MTT测定结果 二萜类化合物 C及 5一Fu在
分别为1O、20、40和70mg??L,;设阴性对照组 仅
10、20、40和70mg??L 的终浓度时对SW620细胞
培养液干预 和空白对照组 不含细胞的血清培养 的增殖均呈时间一浓度依赖性的抑制作用 Fig1 ;
基 ,阳性对照组每:fUJI入含5(Fu的培养液200 l,
化合物c作用24、48和72h后的半数有效抑制浓
使其终浓度同化合物 C 每个剂量设 3个重复孔 。
度 Ic5o 分别为29(75、15(91和6(55mg??L,;各
、48和72h,实验终止前4h添加5g?? 时间段、各浓度的化合继续孵育24
物C对SW620的抑制率均较
L 的 MTY液20 l后再培养4h,弃上清并加入 同时间、同浓度的5一氟脲嘧啶为高 P 0(01 。
DMSO150Ixl,上微量振荡器振荡 10min,立刻用酶 2(2 FCM测定结果 两种药物均能不同程度地诱
标仪测定吸光度值 A ,检测波长为570nm。计算 导SW620细胞发生凋亡,其中化合物C的促凋亡效
细胞生长抑制率。抑制率,, [ 阴性对照组A一 应呈明显的时间 一浓度依赖性 Fig2 ;作用 12h,
空白对照组 A 一 实验组 A一空白对照组 A ], 40和55mg??L 化合物C组与同浓度5(Fu组的凋
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Control
3(17?0(285 4(01?0(721 9(04?0(842
8(63士O(551?? 911?O(565?? 4472?1(461??
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亡率问比较,差异无统计学意义;此外各时间段、各
SW620细胞的增殖,并诱导凋亡,从而逆转癌细胞
十 +
c的促凋亡作用均强于5-Fu Tab 本身存在的生长失控、浓度时,化合物
凋亡失能特性,表现出高效的
4 叭
叭 控 盼 ?
? ? 士 ?
1,P 0(01 。
抗癌活性,且其对结肠腺癌细胞的毒性作用明显高
0 1 O 1
2(3 Western1陀bl7ot检测1‘结果 与阴性对照组相比, 于临床上常用的化疗药物5(Fu。
? ? ?
? ? ?
十
化合物c干预组的ERK、JNK及p38MAPK的表达
丝裂原活化的蛋白激酶 mitogen(activatedpro―
十
水平均受到抑制;而三者相应的磷酸化水平,即P― teinkinase,MAPK 通路是细胞信号转导网络中的重
? 踞
加
? ? + 一 ?
ERK、p-JNK和 p-p38的表达则受到更为明显的抑
要成员之一,它能通过高度保守的“瀑布样”磷酸化
0 1 2 O
制;相反,caspase3的蛋白量则呈上调趋势 Fig3,P 级联反应将细胞外刺激与细胞内基因表达和胞质功
粥
? ? ?
? ? ?
$
能活动连接起来,参与细胞的增殖、分化、运动、凋亡
0(01 。上述蛋白的抑制,活化效应均表现出剂
十
O 4 1 8
量依赖性的特点。
等多种生命活动。目前在哺乳动物细胞中鉴定出了
? ?
土 ? 士 ?
3 讨论 O O O O
3条主要的亚通路,即细胞外信号调节蛋白激酶
0 5 8 ,O
?
结肠癌的发生发展是一个多基因参与、涉及多 extracellular―signalregulatedkinase,ERK 通路、C-
? ? ?
? ? ?
阶段演变的复杂过程。在外界致癌信号的过度刺激 Jun氨基末端激酶 c―JunN―terminalkinase,JNK ,应
下,相关转导通路中关键效应子发生异常的激活,失 激活化蛋 白激酶 stressactivatedproteinkinase,
活,引起下游原癌基因和抑癌基因的表达失衡,进而 SAPK 通路和p38丝裂原活化蛋白激酶 p38mito―
导致肠上皮细胞表型的转变。癌转的细胞能逃避生 gen-activatedproteinkinase,p38MAPK 通路,已被证
理性凋亡点的监控而达到永生化,同时还获得对周
实在包括结肠癌在内的多种消化系肿瘤中存在异常
围组织、器官的高侵袭力。因此,诱导肿瘤细胞凋亡 表达或活化,提示其与肿瘤的发生发展问存在密切
将是治疗结肠癌的一条积极有效的途径 J。 联系 HJ。其中ERK通路主要接受有丝分裂原的
温郁金是临床常用的传统中药材,目前国内外 刺激,活化后能促进细胞增殖、分化、骨架重构等,与
肿瘤细胞的恶性生物学行为问关系密切 15];JNK和
对其有效成分的研究主要集中于姜黄素和榄香烯,
并已证实这两种成分具有良好的抗癌活性 J。我
p38通路则主要接受各种应激和病理性损伤信号,
们的前期研究结果显示,_9一 温郁金的水提物、醚
有时也可被有丝分裂原所活化,产生的效应在很大
提物和醇提物在体内外均能抑制人胃癌 SGC一7901 程度上取决于信号
类型和 或 自身亚型的不同,可
细胞增殖,且后两者尚具有良好的凋亡诱导效应,其
以表现为促进凋亡或抵抗、修复损伤这两种截然相
反的结果 16]。Caspase(3是凋亡经典通路的下游蛋
作用机制可能与下调血管内皮生长因子 vascular
endothelialgrowthfactor,VEGF 、环氧合酶一2 cyclox― 白元件,被
活化后则成为最关键的凋亡执行者,能促
ygenase(2,COX一2 的水平以减少瘤灶内微血管密度 进绝大多数凋亡事件的开启 。我们的实验结果
microvesseldensity,MVD 、提高血浆和组织中生长 显示,化合物C能浓度依赖性地抑制 ERK、JNK和
抑素 somatostatin,SS 的表达、抑制胰岛素样生长因 p38的水平,而对三者磷酸化的抑制程度更为显著;
子 insulin―likegrowthfactor,IGF I和?的分泌等
相反,它能明显诱导活性caspase一3的蛋白表达。推
有关。为深入了解并开发温郁金中潜在的其他抗癌 测化合物C可通过下调ERK通路介导的分裂生存
活性成分,我们成功地从其醚提物中提取出一种新 效应、抑制 JNK,p38通路介导的细胞保护效应,同
型二萜类化合物 c,其化学结构和性质都有别于姜 时传递活化信号至凋亡效应子caspase一3,进而诱导
黄素和榄香烯。通过本次实验发现,该化合物 c能 人结肠腺癌 SW620细胞发生凋亡。
以时间 一浓度依赖性的方式抑制人结肠腺癌 综上所述,温郁金醚提物中的二萜类化合物C
中国药理学通报
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ApoptosisofhumancolonadenocarcinomacelllineSW620inducedby
(
diterpenoidC from RadixCurcumaeanditsrelatedpathways
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jun MAZhong-
1(DeptofGastroenterology,the sAffiliatedHospitalofZhefiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou 310006,China;
2(CollegeofPharmacy,ZhejiangUniversity,Hangzhou 310058,China
Abstract:Aim Tostudy the apoptotic effectofthe
cil(Themedianinhibitoryconcentration IC5o at24,
newdlterpenoidCfrom RadixCurcumaeonhumanCO―
48,and72hwere28(31,15(58,and6(14mg??L, ,
Ion adenovarcinama SW620 cells and its underlying
respectively(Theexpression levelofERK,JNK,p38
mechanisms(Methods TheeffectofditerpenoidC on
and theircorresponding phosphorylation productswas
cellproliferationwasassessedbyMTI"assay,thecell
reducedbyditerpenoidCinadose??dependentmanner,
apoptosisinducedbyditerpenoid C wasdeterminedby
whilethelevelofcaspase一3wasincreased(Conclusion
flow cytometry,and the expression levelofERK,P-
Diterpenoid C inhibitsproliferation andinducesap-
ERK,JNK,p-JNK,p38MAPK,p-p38MAPK,caspase一 optosisofSW620 cellsbysuppressingMAPK signaling
3wasdetected by Western blotanalysis(Results
3( pathwayandinducingapoptoticfactorcaspase-
Diterpenoid C inhibitedthecellproliferationandin― Key words:colon adenovarcinama;Radix Curcumae;
ducedapoptosisindose-andtime-dependentmanners,
diterpenoids;proliferation;apoptosis;MAPK;caspase-3
which wassignificantly more potentthan 5-Fluoroura-