BCA蛋白定量方法

BCA蛋白定量方法 一. 二喳淋甲酸(BCA)检测法 这是近来新研制的一种改进的Lowery测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质的影响 优点: 1) 单一试剂; 2) 终产物稳定; 3) 与Lowery测定法相比几乎没有干扰扰物质的影响 缺点: 1) 反应时间长; 2) 蛋白质发生不可逆的变性。 灵敏度范围: 1) 标准检测:10—1200ug/ml; 2) 微量检测:0.5—10ug/ml 原 理 2+2+在碱性环境下蛋白质分子中的肪田结构能与Cu络合生成络合物，同时将Cu还原成++Cu而比入试剂可敏感特异地与Cu结合(形成稳定的有颜色的复合物，在562nM处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比(可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。 二. 溶液配置 一)试剂A，1L 10g BCA 20g NaCO?H2O 23 1.6g NaCHO(?2HO) 24462 4g NaOH 9.5 NaHCO3 加水至1L用Na0H或固体NaHCO调节pH值至11.25 3 二)试剂B 50mL 2g CuSO5HO 。42 加双蒸水至50mL * 试剂A和试剂B在室温下至少稳定12个月 三. 标准工作试剂(SWR) 50份 试剂A 1份 试剂B 混合后，可稳定一周 四. 检测: 1) 将1倍体积样品与20倍体积的SWR混合 02) 在室温孵育2hr或37C孵育一小时; 03) 在37C孵育情况下冷至室温; 4) 于562nm速取光密度(OD)值 五. 注意事项 1) 为促进BCA的反改进程，;可将实验试管置于微波炉中孵育20s以内 2) 在样品冷却至室温后,每10min光吸收值升高2.3% 03) BCA法检测微量蛋白灵敏度在0.5ug~10ug/mL时,应采用浓缩试剂,并需要在60C 反 4) 与Lowery法相比，采用BCA法时(如果样品含有脂类物质将明显提高光吸收值 5) 在含琉基试剂和去垢剂的缓冲液中BCA呈色发生变化,见参考文献 6) 蛋白质样品经DOC-TCA沉淀后，会去除多数干扰物质