高效液相色谱法测定复方聚维酮碘凝胶中氢化可的松的含量

高效液相色谱法测定复方聚维酮碘凝胶中氢化可的松的含量 高效液相色谱法测定复方聚维酮碘凝胶中 氢化可的松的含量 2010,44(3):1,4/江喜春,等中国兽药杂志 高效液相色谱法测定复方聚维酮碘凝胶中 氢化可的松的含量 江喜春,程广龙,王海瑞,张华林,熊家军,滑国华,杨利国 (1.华中农业大学动物科技学院,武汉430070;2.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所,合肥230030) [收稿日期]2009—06—26[文献标识码]A[文章编号]1002—1280(2010)03—0001—04[中图分类号]TQ460.72 [摘要]采用高效液相色谱法(HPLC)测定复方聚维酮碘凝胶中氢化可的松的含量.以C.(4.6 mm×250mm,5Ixm)为色谱柱,乙腈一甲醇,醋酸铵(20:45:35)为流动相,流速1mL/min,检测波 长240nm,柱温37~C.结果显示:氢化可的松在0.025,0.122mg/mL范围内呈良好的线性关系 (r=0.9993),回收率为96.06%,相对偏差(RSD)为0.45%.试验表明,采用高效液相色谱法 测定复方聚维酮碘凝胶中氢化可的松的含量灵敏,快速,准确,可用于该复方制剂的质量控制或检 验分析. [关键词]高效液相色谱;氢化可的松;相对标准偏差;测定 DeterminationofHydr0c0rtis0neinCompoundPovidone IodineGelbyHPLC JIANGXi—chun',CHENGGuang—long,WANGHai—rui,ZHANGHua—lin, XIONGJia—jun,HUAGuo—hua,YANGLi—guo (1.CollegeofAnimalScience,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070; 2.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,AnhuiAcademyofAgriculturalScience,230030;China) Abstract:HydrocortisoneincompoundpovidoneiodinegelwasdeterminedbyHPLCwithC18(4.6mm×250 mm,5Ixm)aschromatographycolumn,mobilephaseconsistingofacetonitrile:methanol:ammoniumacetate (20:45:35).Thedetectionwavelengthwas240nmandtheflowratewas1mL?minat37? ofthecolumn temperature.Theresultsshowedthattherewasagoodlinearrelationshipwithinthehydrocortisoneconcentration rangeof0.025, 0.122mg?mL(r=0.9993),andtherecoveryratewas96.06%withrelativestandard deviation(RSD)of0.45%.ThetestindicatedthatthemethodofHPLCwassensitive,rapidandaccuratefor detectingthehydrocortisoneincompoundpovidoneiodinegel,anditcanbeusedforqualitycontrolorcheckup analysisofthiscompoundpreparation. Keywords:HPLC;hydrocortisone;relativestandarddeviation(RSD);determination 基金项目:"十一五"国家科技支撑(奶业专项)子课题:奶牛疾病综合控制技术 (2006BAD04A12);农业部公益性行 业(农业)科研专项子课题:改善我国南方奶牛繁殖率的研究与推广(nyhyzx07— 036—03) 作者简介:江喜春(1976年一),助理研究员,在读硕士,研究方向为奶牛繁殖疾病技 术防治.E—mail:jxc76@yahoo.corn.C/l 通讯作者:杨利国.E—mail:yangliguo2006@yahoo.corn.an ? 2?中国兽药杂志2010,44(3):1—4/江喜春,等 复方聚维酮碘凝胶是一种混悬乳胶液体,它是 由卡波姆一940,丙二醇等凝胶基质与聚维酮碘,氢 化可的松混合配制而成,具有抑菌,抗炎作用,临床 上用于奶牛子宫内膜炎,乳腺炎的防治.本实验室 研制的复方聚维酮碘凝胶,稳定性好,生物相容性 好,缓释效果显着,为兽医临床应用提供了一种新 的药物剂型.为控制该药品质量,本文采用高效液 相色谱法对其主药之一氢化可的松的含量进行测 定…,为复方聚维酮碘凝胶的进一步开发和质量分 析提供了一定的参考依据. 1仪器与试药 I.1仪器高效液相色谱仪为美国Agilent1100 series:在线脱气机,四元泵,自动进样器,柱温箱,可 变波长紫外检测器;色谱柱为ZORBAXSB—C.(5 m,4.6mm×250mm);保护柱为sB—C】R(4.6 mm×12.5mm);梅特勒一托利多AE240电子天平 (十万分之一). 1.2试药甲醇(色谱纯,美国TEDIA公司,批号 411070);乙腈(色谱纯,上海凌峰化学试剂厂产品, 批号020515);醋酸铵(分析纯,国药集团化学试剂 有限公司,批号LD509201);无水乙醇(分析纯,莱 阳市双双化工有限公司产品,批号为021212);氢 化可的松(国药集团化学试剂有限公司,批号:Lot. NoF20070911,含量为96.0%,104%);复方聚维 酮碘凝胶(本实验室自制,氢化可的松含量为0.25 mg/mL,批号20071211,20071213,20071215, 20071217,20071219);空白复方凝胶按复方聚维酮 碘凝胶制备方法制备,不含氢化可的松. 2试验方法 2.1色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充 剂,采用c色谱柱,以乙腈一甲醇一醋酸铵 (20:45:35)为流动相,流速1mL/min,检测波长 240nm,柱温37cc,理论塔板数不得小于2000,进 样量20L. 2.2样品预处理方法 2.2.1对照品溶液的制备精密称取氢化可的松 对照品约25mg,置100mL容量瓶中,加无水乙醇 30mL,并加适量流动相溶解,并用流动相稀释至刻 度100mL,摇匀,即得. 2.2.2供试品溶液的制备精密称取复方聚维酮 碘凝胶约5g,置烧杯中,加无水乙醇30mL,在水浴 上加热使溶解,再置冰浴中冷却,滤过,如此提取3 次,滤液并人100mL烧杯中,于水浴上挥干,用流 动相溶解,放冰箱中冷藏过夜,迅速过滤,滤液转移 至容量瓶中并稀释至刻度100mL,摇匀,即得. 2.2.3空白对照溶液的制备精密称取空白复方 凝胶约5g,置烧杯中,加无水乙醇30mL,在水浴上 加热使其溶解,再置冰浴中冷却,滤过,如此提取3 次,滤液并入100mL烧杯中,于水浴上挥干,用流 动相溶解,放冰箱中冷藏过夜,迅速过滤,滤液转移 至100mL容量瓶中,稀释至刻度,摇匀,即得. 2.3杂质干扰试验取空白复方凝胶(与复方聚 维酮碘凝胶相比,只是不含氢化可的松,其余成分 相同),复方聚维酮碘凝胶,分别按2.2.3,2.2.2项 方法处理,20L进样,色谱图. 2.4线性关系分析精密量取对照品溶液2,4,6, 8,10mL,分别置20mL容量瓶中,用流动相稀释至 刻度,浓度分别为0.025,0.049,0.073,0.097, 0.122mg/rnL,各进样20L,测定峰面积,以峰面 积积分值为纵坐标,氢化可的松浓度为横坐标,分 别进行线性回归分析,得标准曲线方程. 2.5精密度试验以浓度为0.073mg/mL的对照 品溶液,取20L进样6次,测量每次的峰面积,按 公式RSD=s/x×100%(其中s为标准偏差,平均 值),计算出RSD值. 2.6稳定性实验以浓度为0.073nag/mE的对照 品溶液,取20L分别在0,1,2…345h进样,测定 峰面积,计算出RSD值. 2.7重复性实验依据《中国药典》高效液相色谱 法重复性试验操作J,按供试品溶液制备处理同一 批号样品5份,每份进样1次,依次测定,计算氢化 可的松含量及RSD. 2.8回收率试验精密称取氢化可的松约25mg, 空白复方凝胶约5g,各5份,分别将称定的氢化可 的松加人称定的空白复方凝胶中,按供试品溶液制 备方法制得,以上述色谱条件进样测定,计算回 收率. 2.9含量测定分别精密称取5批供试品各约5 g,按供试品溶液制备方法(2.2.2项),按HPLC色 谱条件(2.1项)上机测试,标准曲线法定量. 3结果 3.1杂质干扰试验结果如图1一图3所示.可 以看出,图1,图2在2,4min出现的峰为氢化可 的松峰,而空白复方凝胶色谱图(图3)未出现干扰 峰,因此,空白复方凝胶对复方聚维酮碘凝胶中氢 化可的松含量测定没有影响. 2010,44(3):l,4/江喜春,等中国兽药杂志 图1氢化可的松对照品色谱图 图2复方聚维酮碘凝胶色谱图 图3空白复方凝胶色谱图 3.2线性关系考察结果表明,对照品溶液浓度 在0.025,0.122mg/mL范围内,峰面积与浓度之 间呈良好的线性关系,回归方程为:Y=35694135X +5714.7,r=0.9993(凡=5).采用Excel制作氢 化可的松线性关系图(图4). 图4氢化可的松线-眭关系图 3.3精密度试验氢化可的松对照溶液重复6次 测定的峰面积依次为1905234,1906389, 1908765198646719068761908342. 1989312,按公式RSD=s/xX100%(其中s为标 准偏差,为平均值)计算得出RSD=0.45%,精密 度良好. 3.4稳定性实验对照品溶液分别在0,1,2,3,4, 5h进样,测定峰面积的RSD=0.42%,稳定性良 好,说明对照品溶液在实验时间内稳定. 3.5重复性实验结果如表1所示.结果表明, 该法重现性良好,此方法可行. 表1重现性实验结果 3.6回收率结果如表2所示,平均回收率为 96.06%,RSD为0.41%,准确度高,方法可行. 表2回收率实验(n:5) 注:回收率=(测得值/加入对照品量)×100%. 3.7样品含量测定结果如表3所示. 表3含量测定结果 4讨论 4.1样品溶解方法的选择样品溶液制备方法先 按《中国药典》2005版中氢化可的松软膏项下供试 品溶液制备方法提取,然后选择合适的流动相溶解,进 样后发现柱效不好,样品液中有沉淀析出,怀疑溶液中 可能含凝胶基质.冷藏后迅速过滤,取续滤液进样,柱 效有明显改善,同时还有利于保护色谱柱. 姗拗瑚如.姗挪瑚如0 中国兽药杂志2010,44(3):l一4/江喜春,等 4.2流动相选择试验开始选择甲醇:水(70:30) 作为流动相,发现柱效不好,后加冰醋酸调节pH值, 并未得到明显改善.经查文献后筛选,以乙 腈一甲醇一醋酸铵为流动相,当乙腈一甲醇一醋酸 铵比例调为20:45:35,流速为1.0mL/min时,被测 物保留时间适当,分离度较好,峰形好,系统稳定. 4.3方法适用性通过线性关系考察,精密度实 验,稳定性实验,重复性实验以及回收率实验等表 明,本方法能较好地将氢化可的松与复方制剂中其 他成分完全分离,准确地测定出氢化可的松的含 量,且重复性良好. 参考文献: [1]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二0o五年版 (一部)[s]. [2]国家药典委员会.中华人民共和国药典二00五年版(一部) [s]. [3]国家药典委员会.中华人民共和国药典二00五年版(二部) [s]. [4]李发美.医药高效液相色谱技术[M].北京:人民卫生出版 社,1999:21o一21o. [5]高同周,慕芳英,韩映晨,等.高效液相色谱法测定复方氢化 可的松栓中醋酸氢化可松的含量[J].延边大学医学, 2002,25(2):1o5一lO5. 2010年国家动物疫病强制免疫计划之一:口蹄疫免疫计划 一 ,要求 对所有猪进行O型口蹄疫强制免疫;对所有牛,羊,骆驼,鹿进行O型和亚洲I型口蹄疫强制免疫;对 所有奶牛和种公牛进行A型口蹄疫强制免疫;对广西,云南,西藏,新疆和新疆生产建设兵团边境地区的 牛,羊进行A型口蹄疫强制免疫. 二,免疫程序 规模养殖场按推荐免疫程序进行免疫,散养家畜在春秋两季各实施一次集中免疫,对新补栏的家畜要 及时免疫. 1.规模养殖家畜和种畜免疫仔猪,羔羊:28,35日龄时进行初免.犊牛:90日龄左右进行初免.所 有新生家畜初免后,间隔1个月后进行一次强化免疫,以后每隔4,6个月免疫一次. 2.散养家畜免疫春,秋两季对所有易感家畜进行一次集中免疫,每月定期补免.有条件的地方可参 照规模养殖家畜和种畜的免疫程序进行免疫. 三紧急免疫 发生疫情时,对疫区,受威胁区域的全部易感家畜进行一次强化免疫.边境地区受到境外疫情威胁 时,要对距边境线30公里以内的所有易感家畜进行一次强化免疫.最近1个月内已免疫的家畜可以不进 行强化免疫. 四,使用疫苗种类 牛,羊,骆驼和鹿:口蹄疫O型一亚洲I型二价灭活疫苗,口蹄疫O型一A型二价灭活疫苗和口蹄疫A型灭 :口蹄疫O型灭活类疫苗,口蹄疫O型合成肽疫苗(双抗原).空衣壳复合活疫苗.猪 型疫苗在批准范围内使用. 五,免疫方法 各种疫苗免疫接种方法及剂量按相关产品说明书规定操作. 六,免疫效果监测 猪免疫28天后,其他畜21天后,进行免疫效果监测. 1.检测方法亚洲I型口蹄疫:液相阻断ELISA;O型口蹄疫:灭活类疫苗采用正向间接血凝试验,液 相阻断ELISA,合成肽疫苗采用VP1结构蛋白ELISA.A型口蹄疫:液相阻断ELISA. 2.免疫效果判定亚洲I型:液相阻断ELISA的抗体效价I>2判定为合格;O型:灭活类疫苗抗体正向 间接血凝试验的抗体效价I>2判定为合格,液相阻断ELISA的抗体效价I>2判定为合格,合成肽疫苗VP1 结构蛋白抗体ELISA的抗体效价I>2判定为合格.A型:液相阻断ELISA的抗体效价t>2判定为合格;存 栏家畜免疫抗体合格率i>70%判定为合格.