干细胞分裂模式和干细胞干性维持的机制研究

干细胞分裂模式和干细胞干性维持的机制研究 一、关键科学问题及研究内容 (一) 拟解决的关键科学问题 面对我国生命医学科学的重大需求和干细胞研究的挑战，结合我们前期的研究基础，本项目拟重点围绕干细胞分裂模式的发生、调控和动态机制及其在正常和病理过程中的意义这一核心内容，解决如下关键科学问题: 1. 以对称和不对称分裂为新的切入点，研究哺乳类组织干细胞干性维持这一重 要生物学课题。 2. 从机理上阐明对称和不对称分裂、细胞周期、miRNA、蛋白质修饰之间的关 系，及其如何调控干细胞的干性维持。 3. 发现新的调控干细胞对称和不对称分裂的关键分子，为临床疾病的诊治提供 线索。 (二) 主要研究内容 1. 干细胞分裂模式对干细胞干性的调控机制:观察哺乳类上皮组织(前列腺、 脑、内耳)在发育及病变过程中的干细胞分裂模式，研究及验证已知的和新 发现的不对称分裂的关键分子的调控机理及其作用，包括与特异信号转导通 路分子的关系。 2. 细胞周期调控干细胞干性的获得及其机理:从干细胞多能性获得与细胞周 期、分裂模式之间的关系与调控机理着手，结合影响细胞分裂模式、细胞周 期变化的关键因子研究，从干性获得的角度逆向解读干细胞的干性与细胞周 期、分裂模式之间的关系与调控机理，并在此系统中研究关键因子通过调节 细胞周期来决定细胞命运的可能机制。 3. miRNA和蛋白质修饰在干细胞对称和不对称分裂过程中的作用及机理:分析 miRNA 302/367集群、let-7和组蛋白修饰HDAC对干细胞分裂模式调控干细胞 干性获得和维持的影响;鉴定let-7缺失、miRNA 302/367集群达和HDAC抑 制诱导多能干细胞的特异靶信号基因;利用miRNA启动子报告体系验证新旧 调控干细胞对称不对称分裂的关键分子对干细胞干性获得和维持的作用;利 用蛋白质组学技术和质谱技术系统分析组蛋白修饰与干细胞对称和不对称分裂的关系。 4. 运用果蝇和线虫研究调控干细胞对称和不对称分裂的新机制:筛选调控对称和不对称分裂的新因子，利用遗传学、细胞生物学、生物化学及分子生物学等方法，在果蝇和线虫中阐述这些新因子的作用机制及调控网络，为哺乳类干细胞对称/不对称分裂机理研究提供新的研究方向及理论依据。 二、预期目标 (一)总体目标 瞄准国家战略需求和国际干细胞科学研究前沿，针对干细胞对称和不对称分裂调控干细胞干性获得和维持这一核心问题，运用哺乳类上皮干细胞、类器官体外重建体系、诱导多能干细胞重编程体系和病变组织培养等体系和方法，系统研究干细胞对称和不对称分裂、细胞周期、miRNA、蛋白质修饰与干细胞干性维持之间的相互关系，阐明其如何通过特异的信号通路影响干细胞的干性维持，揭示干细胞不对称分裂和细胞周期在组织发育、再生修复及病理变化过程中的作用机制;运用果蝇和线虫等模式动物，验证调控干细胞对称/不对称分裂的关键分子的整体功能，并探寻新的因子，分析其在哺乳类的同源功能和分子机制，完善和建立哺乳类干细胞分裂模式的分子机理模型。通过本项目的实施使我国在干细胞干性维持研究的相关领域达到国际领先水平。同时，以本项目实施为契机，促进干细胞生物学、发育生物学、遗传学、生物化学、影像学研究的衔接和拓展，培养一批优秀的交叉学科研究人才。 (二)具体目标 1. 以哺乳类组织为研究对象，运用前列腺、脑、内耳体外培养系统，采取高分 辨显微技术，实时追踪干细胞分裂模式，解析分裂模式与干细胞干性维持在 正常发育和组织病变过程中的分子生物学作用及意义。 2. 全面分析重编程整个过程中的细胞周期变化及其分裂模式，并在此系统中研 究关键因子通过调节细胞周期来决定细胞命运的机制。 3. 阐明特异miRNA、蛋白质修饰相关因子、信号转导途径和基于果蝇和线虫模 式动物中已知的和新发现的关键分子之间的相互作用关系，描绘它们调控干 细胞干性维持的机制图。 4. 利用果蝇和线虫模式动物遗传学筛选平台，发现若干新的调控干细胞分裂模 式和干细胞干性维持及获得的关键分子，确定与哺乳类相应的同源基因在前 列腺、脑、内耳组织中的作用。 5. 取得具有国际影响的原创性成果，在国际重要学术刊物上发表高水平 30-50篇。在Cell、Nature、Science及其系列杂志上发表3至5篇国际顶级 学术论文。申请专利 10项。 6. 培养国家杰出青年基金获得者1-2人，培养一批具有国际竞争力的优秀中青 年研究人员和后备人才，为我国干细胞分裂模式和干细胞干性维持研究的高 水平、可持续发展提供支撑。 三、研究 (一) 学术思路 干细胞干性维持包括自我更新及分化潜能，与分裂模式直接相关。干细胞对称和不对称分裂是干细胞干性维持的核心问题，通过对称分裂扩充干细胞池或分化的细胞数目，通过不对称分裂维持干细胞数量及干性，同时产生分化的子细胞。干细胞分裂模式的异常往往导致许多临床疾病，特别是上皮组织疾病，包括肿瘤等。但是，目前对干细胞的对称和不对称分裂与这些疾病发生发展之间的作用机制知之甚少。因此，哺乳类干细胞分裂模式的研究对揭示上皮组织发育及病变的新机理和有效地防治相关疾病具有重要的科学指导意义。 干细胞分裂模式的调控涉及多方面的因素，尤其是细胞周期因子、miRNA、蛋白质修饰、特异信号转导系统等。这些因素不仅直接调控干细胞对称不对称分裂这一过程，而且与干细胞的功能有关。因此探讨这些因素之间的相互关系，并揭示它们如何调控干细胞干性维持，是干细胞研究的重要方向。 基于以上思路，我们一方面将利用哺乳类上皮干细胞、类器官体外培养体系和诱导多能干细胞体系，研究干细胞对称不对称分裂模式，细胞周期信号转导通路、细胞重编程过程、miRNA功能、蛋白质修饰和干细胞干性之间的相互作用机理;另一方面，利用直观、高效、快捷的果蝇和线虫遗传筛选体系以及这些模式动物先期工作中已经发现的一些调控干细胞分裂模式的重要因子，探索其在哺乳类干细胞干性维持中的同源功能及特异性，揭示调控干细胞分裂模式及干性维持的新机制，为临床应用提供新的理论依据。 总体思路图 (二) 技术途径 根据如上总体学术思路，设立本项目的总体研究技术途径。总体上，本项目将运用多种哺乳类上皮组织体外干细胞培养体系，研究干细胞分裂模式对干细胞干性维持的作用及其机制。以此为主轴，同时展开信号转导、细胞周期、细胞重编程、miRNA、蛋白质修饰、以及果蝇线虫模式动物的研究，多管齐下，系统地探讨干细胞对称不对称分裂和干细胞干性维持以及在细胞重编程中干细胞干性获得的机制。利用果蝇及线虫遗传学方法，筛选调控干细胞不对称分裂的新关键分子，研究它们在哺乳类上皮组织病变肿瘤发生发展过程中可能的作用机制。具体如下: 课题一利用独创的干细胞标记物分离纯化干细胞或特异的转基因荧光报告蛋白，在体外三维胶原蛋白培养体系、组织切片或活体胚胎中直观地、实时地追踪干细胞的分裂模式及分化过程。从特异信号转导系统这一角度，进行干细胞对称和不对称分裂如何影响哺乳类干细胞干性维持的机制研究。阐明在上皮组织再生修复及病理变化包括癌变过程中干细胞分裂模式和干细胞干性维持的作用及 机理。 课题二利用实时荧光成像、荧光标记、基因芯片等技术，实时全方位地观测重编程过程的细胞周期变化与干性获得之间的关系，并明确这一过程中的细胞分裂模式;同时还为其他课题提供成熟的诱导多能干细胞技术平台，用于逆向验证分裂模式、细胞周期关键基因的功能。 课题三运用标记荧光蛋白实时示踪成像技术观察miRNA 302/367集群/let-7诱导多能干细胞分裂模式, 探讨miRNA与干细胞干性获得和维持的相关性。采用免疫沉淀Argonaute- RISCs-基因芯片技术鉴定miRNA 302/367集群/let-7特异的靶信号基因。利用HDAC1和HDAC2敲除小鼠细胞，阐明HDACs与干细胞干性获得和维持的分子机制。建立特异的miRNA启动子报告体系，研究其与已知信号通路分子、干细胞标记及转录因子的作用关系。利用蛋白质组学技术和质谱技术系统分析干细胞分化前后、对称/不对称分裂之间、及HDACs敲除小鼠细胞组蛋白以及其它蛋白质修饰，尤其是乙酰化的变化，为探明蛋白质修饰调控干细胞分裂模式提供依据。 课题四利用激光共聚焦显微镜，结合抗体制备和免疫荧光技术，观察参与不对称分裂的蛋白亚细胞定位。采用高分辨率活体显微成像技术，追踪GFP标记的相关蛋白在不对称分裂过程中的动态变化。通过二次亲和纯化技术和质谱分析，发现调控干细胞不对称分裂的新因子。利用果蝇和线虫遗传学手段(如RNAi、EMS诱变或P因子)发现调控干细胞不对称分裂的新基因。 (三) 创新与特色 目前对干细胞分裂模式的认识主要来自于果蝇和线虫，哺乳类干细胞分裂模式的调控机理非常复杂，许多方面尚属空白，有待于研究。本研究项目具有以下创新和特色: 1. 哺乳类上皮组织与肿瘤病变密切相关，研究哺乳类上皮，尤其是非脑组织上 皮的干细胞分裂模式研究是一大创新。 2. 首次利用诱导多能干细胞系统逆向研究细胞周期、分裂模式相关因子与细胞 干性获得之间的关系。 3. 利用干细胞标记物分离纯化干细胞，首次在体外三维上皮单位/类器官 (organoid)的形成体系中直观地追踪干细胞的分裂模式及分化过程尚无报 导。 4. 在活体示踪方面，将双光子、近红外等最新的荧光影像技术用于实时、无损 地观察哺乳类上皮干细胞的对称与不对称分裂过程;并将最新的超高分辨影 像技术(STORM)在亚细胞层面记录干细胞的对称与不对称分裂的精细变化。 5. 填补肿瘤的发生发展和干细胞的分裂模式之间的关系的研究空白。 6. 首次研究特异miRNA 302/367集群调控重编程过程中细胞分裂模式，阐明其 在干细胞干性获得和维持中的分子机制。 7. 利用组蛋白去乙酰化酶(HDAC)敲除小鼠，首次研究抑制HDAC如何影响细 胞分裂模式提高miRNA重编程效率的新机制。 8. 利用蛋白质组学技术和质谱技术系统分析HDACs敲除小鼠细胞组蛋白以及 其它蛋白质修饰，尤其是乙酰化的变化。 9. 利用蛋白质组学技术和质谱技术系统分析干细胞分化前后组蛋白修饰的变 化，为探明蛋白质修饰调控干细胞干性维持的机制提供依据。 10. 从果蝇和线虫中筛选新基因，对其进行蛋白定位和功能分析，并发现新的结 合蛋白，研究其同源蛋白在哺乳类干细胞不对称分裂过程中的功能及调控机 制。 11. 独创线虫胚胎后期高分辨显微成像技术，活体观察细胞不对称分裂，结合突 变体分析，揭示干细胞不对称分化机制。 12. 首次整合果蝇、线虫和哺乳类各体系的优势，对干细胞对称/不对称分裂调 控机制进行深入系统地研究。 (四)可行性分析 1. 理论上可行 近年来在干细胞干性维持和分裂模式研究方面, 特别是在模式动物果 蝇和线虫干细胞分裂模式研究中取得了很大的进展，已经形成了初步的机理 模型，为理解哺乳类干细胞分裂模式提供了理论框架和概念基础。国际上关 于哺乳类上皮干细胞分裂模式的研究已经开始有相关报道，正在成为干细胞 和发育生物学研究的热点。国内关于对称/不对称分裂模式对干细胞的干性 维持的研究仍然处于起步阶段，本项目整合哺乳类、果蝇、线虫体系的各自优势，并结合在细胞周期、miRNA、蛋白质修饰、信号转导等方面研究的先进技术，为在干细胞干性维持和分裂模式研究领域取得重大突破奠定基础。 2. 课题组能力和条件可行 3. 本项目的科研队伍以从事干细胞科学、发育生物学、遗传学、细胞生物学、生物影像学、分子生物学研究的“985工程”国家重点大学和中国科学院为主体，集中了目前上海、浙江、广东、北京、四川地区从事干细胞研究的优势科研团队。其中，有很好的工作基础 在过去的研究工作中，本项目组成员一直瞄准于干细胞领域的国际发展前沿，在干细胞分裂模式、细胞重编程、miRNA、干细胞分离纯化、干细胞标记物的鉴定、组织修复重建及肿瘤发生发展等等方面均有良好的基础和积累。主要体现在以下几个方面: 1) 本项目组已经利用单个干细胞，成功实现前列腺重建。在内耳毛细胞再 生研究方面，在国际上第一个发现内耳上皮干细胞的定位并可在体外成 功诱导其分化为内耳毛细胞。此外，利用胚胎大鼠脑组织切片培养技术， 已成功地实时纪录神经干细胞的不对称细胞分裂。 2) 在诱导多能干细胞技术研究方面，本项目组成员首次发现Vc能够极大提 高重编程效率，被选为封面文章发表于Cell Stem Cell;在重编程机理研 究方面首次发现成纤维细胞重编程过程中存在间质-上皮转化(MET)过 程，并发表在Cell Stem Cell上。 3) 本项目组成员发现特异转录因子通过调节Wnt信号控制肺上皮祖细胞增 殖和分化，调控肺发育和损伤后气道再生修复，论文和评论在Nat Genet 网站上登出获得了广泛的关注。首次发现miR302/367集群在成纤维细胞 高表达和HDAC抑制可有效地重编程人和鼠体细胞成为多能性干细胞， 其特征为表达多能干细胞标记基因、形成畸胎瘤和高效生成高比例生殖 系嵌合体的小鼠，已被Cell Stem Cell接受为封面故事。 4) 本项目组成员首次在果蝇中发现并鉴定了Pins及Gαi在神经干细胞不对 称分裂中的功能，并发现纺锤体不对称几何形态受到富集在神经干细胞 上部的两个且功能互补的蛋白复合体调控。另外，还发现转录因子Snail 家族蛋白亦参与不对称分裂的调控。这些关于干细胞不对称分裂分化调 控的一系列重要成果多次发表在Cell、Genes & Dev、EMBO J等刊物上。 5) 在线虫细胞不对称分裂研究领域，本项目组成员首次发现了一种新分子 能够调节微管切割蛋白(katanin)的表达水平，进而阐明了调控胚胎不 对称细胞分裂的新机制，成果发表在Journal of Cell Biology上。 这些工作基础将为这一项目研究提供丰富的实验体系与独特的实验手 段。 (五)课题设置 根据总体研究目标和研究内容，本项目拟以干细胞对称与不对称分裂和干细胞的干性维持为核心，以哺乳类上皮干细胞为突破点，将项目分解为各有侧重，但又互相联系、互相促进的四个课题(见总体思路图)，从信号转导、细胞周期、miRNA和蛋白质修饰、果蝇线虫遗传学等方面有机结合地、深入系统地探索干细胞分裂模式在干细胞干性维持中的作用及其机制。 从各课题研究所利用的不同体系和所侧重的不同角度来看，课题一着重应用哺乳类上皮干细胞中干细胞对称与不对称分裂和干细胞干性维持研究体系，系统研究信号转导在其中的参与及作用;课题二研究细胞周期相关因子对干细胞干性获得和维持的作用及其机理;课题三从miRNA和蛋白质修饰的角度研究其在干细胞对称和不对称分裂过程中的精细调控;课题四运用果蝇和线虫模型，发现新的决定干细胞分裂模式的关键分子，为创新药物的研发提供靶标。 从各课题间的有机联系及与项目预期目标的关系来看: 课题一聚焦哺乳类上皮干细胞，为干细胞对称与不对称分裂和干细胞干性维持的研究提供了一个重要的独特体系。 课题二中影响细胞周期的因子、课题三中的miRNA和蛋白质修饰以及课题四果蝇和线虫中新发现的关键分子的作用都将可以在这一系统中进行验证。 课题二利用诱导多能干细胞系统研究细胞周期改变与干性获得的关系，阐明这一过程中的细胞分裂模式，并为其它课题包括模式动物中发现的关键因子从逆向的角度进行验证，同时在这一系统中发现的新的关键因子可在其它系统中进行研究。 课题三分析特异miRNA及蛋白质修饰调节细胞分裂模式诱导维持重编程多能干细胞干性的分子机制，并研究在病变情况下miRNA及蛋白质修饰对干细胞分裂方式与干性的作用，与课题一密切相关。同时miRNA调控细胞分裂模式及其特异靶点，如细胞周期调控信号分子、细胞凋亡调控信号分子和染色体重塑分子等，与课题二紧密联系。此外，这些特异miRNA及蛋白质修饰分子与课题四发现的调控干细胞分裂模式的分子也可互为进一步研究的切入点。 课题四的研究利用模式动物果蝇和线虫直观、高效、快捷的实验手段和技术，寻找参与调控对称/不对称分裂模式的新基因，并明确其在模式动物中的功能和分子机理。本课题可为课题一、二、三提供新的研究思路和整体动物水平的验证平台，并创新性地阐明哺乳类干细胞对称与不对称分裂和干细胞干性维持的作用机制。 各课题具体设置如下: 课题一:干细胞分裂模式对干细胞干性的调控机制。 研究目标: 阐明哺乳类干细胞对称分裂和不对称分裂、特异信号转导系统与干细胞干性维持之间的相互关系。揭示干细胞不对称分裂在组织发育、再生修复及病理变化过程中的作用机制。验证新的调控干细胞不对称分裂的关键分子如何通过特异的信号通路影响干细胞的干性维持及其在临床的应用潜能。 研究内容: 1. 干细胞对称与不对称分裂在哺乳类组织正常发育过程中的研究。 在哺乳类上皮组织(前列腺、脑、内耳)正常发育过程中，利用干细胞的标记物、中心体和纺锤体的标记物、以及已知的在果蝇或线虫系统中发现的与对称与不对称分裂相关的标记物，采用实时光学影像、荧光标记、双光子/近红外/多光谱及高分辨率荧光显微影像等技术和免疫组化，根据纺锤体的方向、干细胞分裂的位置(细胞核上下振荡行为)、分裂板的夹角(垂直、水平以及介于中间)、子细胞位置大小及形态上的差异、特异分子在细胞质中的不对称分布等指标，观察上皮干细胞在体外三维类器官形成过程中或培养的组织切片或活体胚胎中干细胞的分裂模式和干细胞对称与不对称分裂的比例。 A. 实时追踪体外经纯化、分离、三维培养的干细胞形成类器官(Organoid) 的过程。 B. 利用特异的转基因荧光报告蛋白，实时追踪培养的组织切片或活体胚胎 中干细胞的分裂分化过程。 C. 利用免疫组织化学技术，在不同的发育点，观察体内特定微环境下的干 细胞分裂模式及分化过程。 2. 从特异信号转导系统这一角度，进行干细胞对称和不对称分裂如何影响哺乳类干细胞干性维持的机制研究。 A. 研究Notch信号转导系统及其相关的分子与哺乳类干细胞分裂模式及干 细胞干性维持的关系，包括Numb、Hes、Atoh1等。 B. 研究Wnt信号转导系统与哺乳类干细胞分裂模式及干细胞干性维持的关 系，包括beta-catenin、Wnt5a、Frizzled、Axin2等。 C. 研究Shh信号转导系统与哺乳类干细胞分裂模式及干细胞干性维持的关 系，包括Shh、Patched、Gli1等。 3. 进一步深入系统地研究哺乳类干细胞对称和不对称分裂的分子机制。 A. 上皮干细胞干性因子(Bmi、Nanog等)及表面标志分子(CD117、CD133 等)及对上皮干细胞对称和不对称分裂的影响。 B. 采用宫体胚胎电转导和RNAi技术，研究快速基因干扰相关中心体蛋白基 因(CP110、CDK5RAP2等)对神经上皮干细胞对称和不对称分裂的影响。 C. 利用课题二中获得的细胞周期相关因子，研究其和哺乳类干细胞对称和 不对称分裂的关系及在上皮组织发育中的作用。 D. 利用课题三中miRNA和蛋白质修饰，研究其和哺乳类干细胞对称和不对 称分裂的关系及在上皮组织发育中的作用。 E. 利用课题四中果蝇和线虫里已知的及新发现的调控干细胞不对称分裂及 其干性的分子，研究其和哺乳类干细胞对称和不对称分裂的关系及在上 皮组织发育中的作用。 F. 探索以上这些因子和特异信号转导通路的上下游关系，及其在哺乳类上 皮干细胞干性维持中的作用。 4. 研究在上皮组织再生修复及病理变化包括癌变过程中干细胞分裂模式和干 细胞干性维持的作用及机理。 A. 利用免疫组织化学技术，在组织再生修复、重建过程中不同的时间点， 观察体内特定微环境下的干细胞分裂模式及分化过程。 B. 采用干细胞标记物(CD133、CD177、CD44等)，从肿瘤组织中纯化、 分离、三维培养干细胞，观察其克隆及细胞球形成及在体成瘤过程中干 细胞的分裂模式及分化过程。 C. 探索课题二、三、四中有潜力的关键靶标因子对上皮组织再生修复及病 理变化包括癌变可能的临床应用。 预算经费:28, 课题二:细胞周期调控干细胞干性的获得及其机理 研究目标: 从干细胞多能性获得与细胞周期、分裂模式之间的关系与调控机理着手，结合影响细胞分裂模式、细胞周期变化的关键因子研究，从干性获得的角度逆向解读干细胞的干性与细胞周期、分裂模式之间的关系与调控机理，力争取得新的突破。 研究内容: 1. 研究细胞重编程过程中的细胞分裂模式。 A. 利用小鼠成纤维细胞高效快速重编程体系，结合荧光标记和实时观测显 微技术，研究细胞重编程过程中的细胞分裂模式。 B. 利用基因芯片等技术，检测现有重编程过程中不同时间点的细胞分裂模 式关键基因(PAR蛋白等)表达变化。 C. 根据实时观测和基因芯片表达分析结果，研究影响分裂模式的关键基因 与Oct4等重编程因子之间的关系。 2. 全面分析重编程过程中细胞周期的变化与iPS细胞干性获得之间的关系。 A. 利用小鼠成纤维细胞高效快速重编程体系，结合荧光标记和实时观测显 微技术，研究细胞重编程过程中的细胞周期变化。 B. 利用基因芯片等技术，结合前期结果中发现Vc可以提高重编程效率，检 测不同条件重编程过程中，不同时间点的细胞周期关键基因(Cyclins、 CDKs、p27等)表达变化。 C. 根据实时观测和基因芯片表达分析结果，研究影响细胞周期的关键基因 与Oct4等重编程因子见关系。 3. 利用iPS系统研究细胞周期、分裂模式关键因子，系统研究Numb等关键因 子通过调节细胞周期来决定细胞命运的可能机制。 A. 结合前期研究结果，研究Numb基因在细胞重编程过程中的表达变化， 并研究其与重编程因子Oct4之间的关系。 B. 研究果蝇、线虫模型中发现的分裂模式、细胞周期关键因子在细胞重编 程过程中对细胞干性获得的影响及作用机制。 C. 研究Numb在iPS细胞分化过程中调节不对称分裂的作用。 D. 在细胞重编程系统中，研究细胞分裂模式、细胞周期关键因子与重编程 因子Oct4、Sox2、Klf4等协同作用之间的关系和作用机理。 预算经费:24, 课题三:miRNA和蛋白质修饰在干细胞对称/不对称分裂过程中的作用及机理 研究目标: 我们的近期工作发现miRNA和蛋白质修饰可导致细胞重编程(Cell Stem Cell, in press)，本课题将深入研究miRNA和蛋白质修饰是否通过调控干细胞对称不对称分裂从而影响干细胞干性的获得和维持，阐述miRNA和蛋白质修饰与细胞周期及特异信号转导系统之间的相互作用关系，探索miRNA和蛋白质修饰与在果蝇及线虫模式动物中已知的和新发现的调控干细胞对称不对称分裂的关键分子的上下游关系，使我们得以全面系统地理解干细胞干性维持及获得的机理。 研究内容: 1. 明确特异miRNA和蛋白质修饰(尤其是组蛋白修饰)是否通过调控干细胞对 称不对称分裂影响干细胞干性的获得和维持。 A. 在miRNA 302/367集群/let-7诱导多能干细胞过程中，观察重编程的干细 胞分裂模式。 B. 分析组蛋白修饰HDACs调控的重编程过程中干细胞的分裂模式。 C. 确定HDAC1和HDAC2缺陷的ES 细胞中对称不对称分裂的比例及其与干 性维持的相关性。 2(研究miRNA和蛋白质修饰与转录因子、细胞周期及特异信号转导系统之间的相互作用关系。 A. 采用免疫沉淀Argonaute-RISCs-基因芯片技术鉴定miRNA 302/367集群 /let-7下游靶信号基因是否涉及干细胞核心转录因子、Wnt、Notch、FGF、 TGFb等信号转导通路、细胞周期调控信号分子、细胞凋亡调控信号分子 和染色质重塑分子等，证实miRNA 302/367/let-7可影响这些信号分子， 调控细胞分裂模式，获得并维持干细胞干性。 B. 研究组蛋白修饰，尤其是组蛋白去乙酰化酶(HDACs)修饰，是否通过 特异信号转导系统及细胞周期的关键因子调控干细胞分裂模式和干性获 得和维持。 C. 在HDAC1和HDAC2缺陷的ES细胞中，观察特异的信号转导系统或影响 细胞周期的关键因子是否缺失。 3. 探索miRNA和蛋白质修饰与从果蝇及线虫模式动物中已知的和新发现的调控干细胞对称不对称分裂的关键分子的相互作用关系。 A. 建立特异的miRNA启动子报告体系，研究其与已知的如PAR-aPKC蛋白 复合物(PAR蛋白等)、Notch、Wnt 信号通路分子以及干细胞标记(CD133, CD117)和转录因子Gata6等的作用关系。 B. 研究组蛋白修饰，尤其是组蛋白去乙酰化酶(HDACs)修饰，与已知的 调控干细胞对称不对称分裂的关键分子的哺乳类同源分子的作用关系。 C. 用以上方法，探讨miRNA和蛋白质修饰与从果蝇及线虫模式动物中新发 现的调控干细胞对称不对称分裂的关键分子的作用机制。 4. 利用蛋白质组学技术和质谱技术系统分析蛋白质修饰(尤其是组蛋白修饰) 以探索蛋白质修饰与干细胞对称不对称分裂的关系。 A. 系统分析HDACs敲除小鼠细胞组蛋白以及其它蛋白质修饰，尤其是乙酰 化的变化。 B. 系统分析干细胞分化 (包括对称与不对称分裂) 前后组蛋白修饰的变化， 为探明蛋白质修饰调控干细胞干性维持的机制提供依据。 预算经费:23, 课题四:运用果蝇和线虫研究调控干细胞对称和不对称分裂的新机制 研究目标: 利用模式动物果蝇和线虫研究所具备的直观、高效、快捷等技术优势，依据同源蛋白在不同的动物里往往具有类似的生理生化功能的原理，结合遗传学、细胞生物学、生物化学、分子生物学和发育生物学的实验方法，研究特异哺乳类干 ++细胞标记物(如前列腺干细胞CD133、CD117)表面特征在果蝇和线虫中相应的同源基因的功能和分子机理，尤其在组织干细胞不对称分裂方面的作用新机制，从而揭示及探讨其小鼠同源基因对于细胞分裂模式在哺乳类干细胞干性维持中的生理功能，并为上皮干细胞对称/不对称分裂调控与干性维持研究提供新的信息和研究方向。 研究内容: 1. 在果蝇和线虫中，揭示干细胞标记物如CD133和CD117同源基因的功能及突 变体的表型。 A. 在果蝇中，重点研究CD133同源基因CG42310、CG7740和CD117同源 基因CG8222对神经干细胞的分裂模式及上皮细胞形成及结构维持的作 用。利用遗传方式，明确CG42310与CG7740之间的关系。 B. 在线虫egl-15(CD117)和F08B12.1(CD133)突变体内，利用高分辨率活 体时序显微成像技术，通过荧光标记不同的细胞器(如纺锤体、染色体 和细胞膜等)，比较肌肉干细胞以及表皮干细胞不对称分裂动态过程。 C. 验证模式动物果蝇线虫实验结果与小鼠实验的相关性。 在果蝇和线虫突变体里验证小鼠CD133和CD117基因的相关功能， 并分析GFP标记的鼠源CD117和CD133蛋白在果蝇和线虫里的亚细胞定 位和动态变化。 2. 阐明果蝇和线虫CD133和CD117同源蛋白的亚细胞定位 A. 构建果蝇基因G42310、CG7740和CG8222及线虫基因EGL-15及F08B12.1 融合蛋白质粒，并制备相应抗体。免疫荧光标记观察其在不同发育期亚 细胞定位。 B. 构建表达绿色荧光蛋白GFP融合蛋白的果蝇和线虫品系，观察同源蛋白 在细胞周期不同阶段的动态变化。 3. 阐明CD133及CD117的分子通路。 A. 选择CG42310、CG7740及CG8222做诱饵，利用二次亲和纯化 (Tandem-Affinity-Purification TAP)和质谱分析的方法，发现新的结合蛋 白，并分析其功能。 B. 利用正向遗传学(如EMS诱变的方法)筛选抑制线虫egl-15突变体在线 虫产卵(egg-laying)表型方面的抑制子(suppressor)，发现egl-15分 子通路及上、下游的基因。 C. 阐明二次亲和纯化方法识别的果蝇蛋白生理功能及线虫正向遗传学筛选 到的基因功能，确认它们是否与上述CD133、CD117同源蛋白作用在同 一信号通路上。 D. 发现小鼠内与这些新基因同源的基因，与其它课题组合作，检测其与对 称/不对称分裂调控及对前列腺干细胞干性维持的分子功能。 预算经费:25, 四、年度计划 年研究内容 预期目标 度 1. 利用干细胞的标记物(譬如CD133、1. 建立可行的哺乳类干细胞的 CD117)、中心体和纺锤体的标记分裂模式实时成像观察系统， 物、免疫组化及实时成像等方法，结合免疫组化，阐述干细胞对 研究哺乳类干细胞在组织正常发育称与不对称分裂在哺乳类组 过程中或在成纤维细胞重编程过程织正常发育过程或在成纤维 中细胞的分裂模式、干细胞对称与细胞重编程过程中的作用及 不对称分裂的比例及其作用。 机制。 2. 在特异miRNA(302/367集群)和2. 阐明特异miRNA和蛋白质修 蛋白质修饰(HDACs)调控重编程饰通过调控干细胞对称不对第 过程中，运用标记荧光蛋白实时示称分裂模式影响干细胞干性 踪成像技术观察重编程的干细胞分的获得和维持。 裂模式。 3. 明确干细胞标记物CD133和一 3. 在果蝇中，重点研究干细胞标记物CD117三个同源基因 CD133同源基因CG42310、CG7740CG42310、CG7740和CG8222 和CD117同源基因CG8222对神经的蛋白功能及变异体表型，揭年 干细胞分裂模式及上皮细胞形成及示干细胞表面特征抗原 结构维持的作用。 CD133和CD117的蛋白功能 4. 在线虫egl-15(CD117同源基因)和及信号分子机理。 F08B12.1(CD133同源基因)突变4. 明确CD117蛋白的线虫同源 体内，利用高分辨率活体时序显微基因对调控线虫干细胞不对 成像技术，通过荧光标记不同的细称分裂的影响;揭示F08B12.1 胞器(如纺锤体、染色体和细胞膜同源蛋白在线虫发育过程中 等)，比较干细胞不对称分裂动态的生理功能。 过程。 年研究内容 预期目标 度 1. 采用宫体胚胎电转导和RNAi技术，1. 明确中心体蛋白调控哺乳类 研究快速基因干扰相关中心体蛋白神经上皮干细胞对称和不对 基因(CP110、CDK5RAP2等)对称分裂的分子机制。 哺乳类神经上皮干细胞对称和不对2. 揭示干细胞对称和不对称分 称分裂的影响。 裂是否及如何通过特异信号2. 研究特异信号转导系统(如Wnt)转导系统影响哺乳类干细胞 及其相关的分子(包括beta-catenin、干性维持的机制。 Wnt5a、Frizzled、Axin2等)与哺乳3. 将阐明PAR蛋白、Cyclins、 类干细胞分裂模式及干细胞干性维CDKs、p27、Numb等基因在 持的关系。 重编程过程中的变化，并初步3. 检测现有重编程过程中不同时间点研究其与Oct4等干细胞因子 第 的细胞分裂模式、细胞周期关键基的关系。 因表达变化，研究Numb基因在细4. 探索miRNA和蛋白质修饰诱 胞重编程过程中的表达变化。 导多能干细胞的细胞分子机 二 4. 采用免疫沉淀Argonaute-RISCs-基制，证实miRNA 302/367集群 因芯片技术鉴定miRNA 302/367集过表达/let-7缺失可影响干细 群过表达/let-7缺失诱导多能干细胞核心转录因子、细胞周期调年 胞的特异下游靶信号基因是否涉及控信号分子、细胞凋亡调控信 干细胞核心转录因子、Wnt、Notch、号分子和染色质重塑分子等 FGF、TGFb等信号转导通路、细胞调控细胞分裂模式，获得并维 周期调控信号分子、细胞凋亡调控持干细胞干性。 信号分子和染色质重塑分子等。 5. 在果蝇或线虫中，通过分析变5. 研究果蝇CG42310、CG7740、异体表型和变异性状，揭示这 CG8222变异体和线虫EGL-15及些同源基因在上皮/ 肌肉和 F08B12.1变异体，用细胞生物学、神经干细胞不对称分裂方面 遗传学方法、进一步深入分析变异的影响;分析CG42310与 体表型;鉴定CG42310与CG7740、CG7740、CG8222之间的关 CG8222之间的关系及其协同作用系，确定哪一个起主导作用; 年研究内容 预期目标 度 蛋白的生理功能;利用正向遗传学发现新的结合蛋白，阐明这些 (如EMS诱变的方法)筛选，发现蛋白在上皮细胞结构、神经系 线虫egl-15分子通路及上、下游的统发育和神经干细胞不对称 基因。 分裂中的作用和可能的相关 性。 1. 从干细胞干性因子和表面标1. 研究上皮干细胞干性因子(Bmi、 志分子角度，进一步深入系统Nanog等)及表面标志分子(CD117、地阐明哺乳类干细胞对称和 不对称分裂的分子机制。 CD133等)对上皮干细胞对称和不 2. 探索干细胞的分裂模式及分对称分裂的影响。 化过程在组织再生修复、重 2. 利用免疫组织化学技术，在组织再建、肿瘤病变中的作用及其机第 制。 生修复、重建过程中不同的时间点，3. 找到2-3个对重编程起重要影 响的细胞周期、分裂模式关键观察体内特定微环境下的干细胞分 基因，并初步阐明其作用机裂模式及分化过程;采用干细胞标三 理。 4. 阐明组蛋白修饰调控干细胞记物(CD133、CD117等)，从肿 干性获得并维持的特异信号瘤组织中纯化、分离、三维培养干分子可能也与干细胞核心转年 细胞，观察其克隆及细胞球形成及录因子、细胞周期调控信号分 子、细胞凋亡调控信号分子和在体成瘤过程中干细胞的分裂模式染色质重塑分子相关。 及分化过程。 5. 在果蝇和线虫突变体里验证 小鼠CD133和CD117基因的3. 利用重编程过程中细胞周期变化和相关功能，确定果蝇和线虫 分裂模式实时标记跟踪系统，开展CD133和CD117同源蛋白的 年研究内容 预期目标 度 亚细胞定位。 关键基因对重编程影响研究。 4. 进一步探索miRNA和蛋白质修饰 诱导多能干细胞的细胞分子机制， 研究组蛋白修饰，尤其是组蛋白去 乙酰化酶(HDACs)修饰，是否通 过特异信号转导系统及细胞周期的 关键因子调控干细胞分裂模式和干 性获得和维持。在HDAC缺陷的 ES 细胞中，观察特异的信号转导系 统或影响细胞周期的关键因子是否 缺失。 5. 验证模式动物果蝇和线虫实验结果 与小鼠实验的相关性:构建表达绿 色荧光蛋白GFP融合蛋白的果蝇和 线虫品系，观察同源蛋白在细胞周 期不同阶段的动态变化;利用小鼠 CD133和CD117基因过表达载体， 通过转基因，拯救果蝇变异体表型。 1. 选取课题二重点关注的细胞周期相1. 各课题组进一步深入合作，发 关因子、课题三中特异的miRNA和掘影响干细胞分裂模式的新 蛋白质修饰和课题四在果蝇和线虫的关键调控因子，揭示其在上第 模型中获得的新的调控干细胞分裂皮组织再生修复及病理变化 模式的关键分子，聚焦其中有潜力包括癌变过程中新的作用机 的调控干细胞不对称分裂的关键靶理，取得具有我国自主知识产 四 标因子对上皮组织发育、再生修复权的原创性专利。 及病理变化包括癌变可能的作用机2. 完成重编程过程中细胞周期、 制。 分裂模式变化图谱，并阐明其 2. 结合前期研究结果及其他课题如模变化机理。 年 式动物中的研究结果，全面分析重3. 阐明miRNA和蛋白质修饰与 编程过程中的周期变化、分裂模式从果蝇及线虫模式动物中已 调控机理。 知的和新发现的调控干细胞 年研究内容 预期目标 度 3. 建立特异的miRNA启动子报告体对称不对称分裂的关键分子系，研究其与已知的如PAR-aPKC的相互作用关系。 蛋白复合物(PAR蛋白等)、Notch、4. 确定CD133和CD117调控和Wnt 信号通路分子以及干细胞标协同路径中起关键作用的相记(CD133, CD117)和转录因子关蛋白及候选基因;阐明Gata6等的作用关系;研究组蛋白修CD133和CD117的蛋白功能饰，尤其是组蛋白去乙酰化酶及完整信号通路的分子机理。 (HDACs)修饰，与已知的调控干 细胞对称不对称分裂的关键分子的 哺乳类同源分子的作用关系。 4. 将鼠源CD133和CD117克隆到 TAP质粒上，制作转基因果蝇。利 用二次亲和纯化和质谱分析的方 法，解读新蛋白，将结果与果蝇中 检测到的蛋白进行比较和分析;在 果蝇中构建实验确认的新基因的变 异体，观察表型，从遗传学角度， 证实它们是否与CG42310, CG7740 及CG8222作用在同一通路上。 1. 继续深入研究调控干细胞对称不对1. 全面系统深入地阐明干细胞称分裂的新的关键靶标因子对上皮分裂模式影响干细胞干性维组织发育、再生修复及病理变化包持及分化的分子机理，凝练出括癌变可能的作用机制;研究以上若干个调控干细胞对称不对这些因子和特异信号转导通路的上称分裂的关键靶标因子。 下游关系。 2. 阐明细胞分裂模式、细胞周期2. 在细胞重编程系统中，研究细胞分关键因子与干细胞干性获得第 裂模式、细胞周期关键因子与重编之间的关系和作用机理。 程因子Oct4、Sox2、Klf4等协同作3. 深入阐明miRNA和蛋白质修 用之间的关系和作用机理。 饰调控干细胞对称不对称分3. 用已建立的特异miRNA启动子报裂的分子的作用机制。 五 告体系，探讨miRNA和蛋白质修饰4. 阐明CD117和CD133的分子与从果蝇及线虫模式动物中新发现信号通路。 明确CD117和 的调控干细胞对称不对称分裂的关CD133及发现的新基因在干键分子的作用机制。 细胞不对称分裂及上皮细胞年 4. 各课题组相互合作，发现小鼠内与形成与再生过程中的分子功果蝇或线虫中获得的新基因同源的能;确定新的调控干细胞分裂基因。检测其在对称/不对称分裂调模式和干细胞干性维持的关控、干细胞干性维持及上皮细胞形键分子,阐明干细胞对称与不成与再生过程中的分子功能;通过对称分裂及干性维持调控新转基因，用确认的小鼠新同源基因机制。 拯救果蝇遗传变异体表型。用遗传 年研究内容 预期目标 度 学及生物化学方法，确定CD133及 CD117上/下游调控基因。