黄连上清片微生物检验方法验证方案解读

黄连上清片微生物检验方法验证解读 黄连上清片微生物限度计数方法适用性 验证方案 方案编号:VOL-QWX-003 年 月 方案编号:VOL-QWX-003 版本号:00 第 2 页 共13页 验证方案审批表 黄连上清片微生物限度计数方法适用性验证方案 验证方案名称 验证方案编号 VOL-QWX-003 方案起草人 起草日期 方案审核部门 审核人 审核日期 审核意见 化 验 室 质 量 部 批准意见 批 准 人 批准日期 执行日期 方案编号:VOL-QWX-003 版本号:00 第4页 共13页 黄连上清片微生物限度计数方法适用性 验证方案目录 1. 概述 2. 目的 3. 依据 4. 范围 5. 验证小组人员及职责 6. 验证实施条件 7. 合格 8. 验证方法 9. 验证结果 10. 验证报告 方案编号:VOL-QWX-003 版本号:00 第4页 共13页 1.概述 1.1样品资料 品名: 黄连上清片 标准依据:《中国药典》2015版四部通则 批号: 试验日期: 1.2处方 :黄连上清片为《中国药典》2015版一部中药成方制剂法定标准。由黄连、栀子、连翘、炒蔓荆子、防风、荆芥穗、白芷、黄芩、菊花、薄荷、大黄、黄柏、桔梗、川芎、石膏、旋覆花、甘草组成。辅料为糊精、淀粉、蔗糖、聚维酮K30、微粉硅胶、硬脂酸镁、薄膜包衣粉。 1.3 功能主治:散风清热、泻火止痛。用于风热上攻、肺胃热盛所致的头晕目眩、暴发火眼、牙齿疼痛、口舌生疮、咽喉肿痛、耳痛耳鸣、大便秘结～小便短赤。 1.4 有效期:18个月。 1.5依据《中国药典》2015版四部通则“非无菌含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准”～根据剂型与产品处方判断～黄连上清片微生物限度检查内容包括需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数～控制菌检查大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌、沙门菌,拟采用“平皿法-培养基稀释法”进行微生物计数方法检查～采用“常规法”进行控制菌检查。 2.目的:确认所采用的方法适用于该产品的微生物计数和控制菌检查～以确保测定方法的可靠性～确保检验结果的准确性。若检验程序或产品发生变化～可能影响检验结果时～计数方法应重新进行适用性试验。 3.依据 《中国药典》2015年版四部“非无菌产品微生物限度检查——微生物计数法” 《中国药典》2015年版四部“非无菌产品微生物限度检查——控制菌检查法” 《中国药典》2015年版四部——“非无菌产品微生物限度标准” 4.范围:本验证方案适用于,,制药有限公司黄连上清片微生物限度检查检验方法的适用性试验。 5. 验证小组人员及职责 姓 名 所在部门 职 责 方案编号:VOL-QWX-003 版本号:00 第4页 共13页 6. 验证实施条件 6.1 检验用水:公司制备的经检验合格的纯化水。 6.2检验仪器设备:验证涉及的检验仪器,设备,与检验方法～经过确认或再确认后合格。所用检验设备如下: SPX-250型生化培养箱 PYX-DHS-400型隔水式电热恒温培养箱 101-2型电热鼓风干燥箱 DHP-9272型恒温培养箱 -9032型恒温培养箱 DHP YX-400型医用双层普型不锈钢双层立式电热蒸汽压力消毒器 DSX-280KB24 立升手提式压力蒸汽灭菌器 GSP-9080型隔水式电热恒温培养箱 6.3 验证培养基:验证所使用的培养基经过培养基的适用性检查～结果符合药典要求。所用培养基如下: 名 称 来 源 批 号 胰酪大豆胨琼脂培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 麦康凯液体培养基 肠道增菌液体培养基 紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基 RV沙门菌增菌液体培养基 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 麦康凯琼脂培养基 胰酪大豆胨液体培养基 6.4 验证菌株: 名 称 来 源 批 号 金黄色葡萄球菌菌株 枯草芽孢杆菌菌株 方案编号:VOL-QWX-003 版本号:00 第4页 共13页 铜绿假单胞菌菌株 白色念珠菌菌株 乙型副伤寒沙门菌 黑曲霉菌菌株 大肠埃希菌菌株 7. 合格标准 7.1在需氧菌、霉菌及酵母菌计数的三次独立平行试验中～试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5，2范围内。 7.2在控制菌检查的试验中试验组应检出试验菌～阳性对照组应检出试验菌～阴性对照组不得检出试验菌。 8. 验证方法 8.1 菌液制备 所有使用的菌株均为西林瓶包装的定量菌株。定量菌株适用于培养基适用性检查、控制菌检查、促生长试验、灵敏度检查等。使用前将金黄色葡萄球菌株西林瓶、枯草芽孢杆菌株西林瓶、白色念珠菌株西林瓶、铜绿假单胞菌菌株、黑曲霉菌株西林瓶从冰箱中拿出平衡至室温～加入含有11ml无菌生理盐水的试管中～盖上瓶盖～静臵约30s～震荡10s～吸取1ml加至适宜培养基中培养～即得含量为10，100cfu的菌落。菌液制备后若在室温下放臵～应在2小时内使用,若保存在2，8?～可在24小时内使用。 8.2 菌液的检验 8.2.1取上述金黄色葡萄球菌株、枯草芽孢杆菌株、大肠埃希菌菌株、铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌菌株的稀释液各1ml～分别用45?的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml注皿～各平行测定两皿～30?，35?培养5天～计数～应为10，100cfu/ml～结果见表1。 8.2.2取上述白色念珠菌菌株、黑曲霉菌株的稀释液各1ml～分别用45?的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml注皿～各平行测定两皿～20?，25?培养7天～计数～应为10，100cfu/ml～结果见表1。 8.3需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法适用性试验 供试液制备:取供试品10g～加ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml～制成供试液～作为1:10的供试液。 8.3.1平皿法:结果见表2，8. 方案编号:VOL-QWX-003 版本号:00 第4页 共13页 8.3.1.1试验组:取供试液分别按1ml/皿加入平皿后～加入上述10，100cfu的试验菌～立即倾注至《中国药典》2015版规定的琼脂培养基中～臵规定的温度培养3，5天～观察结果。 8.3.1.2菌液组:除不加供试液外～同试验组测定方法。 8.3.1.3供试品对照组:除不加菌液外～同试验组测定方法。 8.3.1.4将以上平皿需氧菌臵30，35?培养不超过5天～霉菌、酵母菌臵20，25?培养不超过7天～并在5天和7天分别进行计数。 8.3.1.5回收比值的计算: 试验组的菌落数—供试品对照组菌落数 ————————————————————————— 菌液对照组菌落数 8.3.2培养基稀释法:结果见表2，8。 8.3.2.1实验组:取供试液分别按0.5ml/皿、0.2ml/皿加入平皿后～加入上述50，100cfu的试验菌～立即倾注2015版药典规定的琼脂培养基～臵规定的温度培养3，5天～观察结果。 8.3.2.2菌液组:除不加供试液外～同试验组测定方法。 8.3.2.3供试品对照组:除不加菌液外～同试验组测定方法。 8.3.2.4将以上平皿需氧菌臵30，35?培养不超过5天～霉菌、酵母菌臵20，25?培养不超过7天～并在5天和7天分别进行计数。 8.3.2.5回收比值的计算: 试验组的菌落数—供试品对照组菌落数 ————————————————————————— 菌液对照组菌落数 8.4 控制菌检查方法适用性试验 8.4.1大肠埃希菌 供试液制备:同“需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验”供试液制备。 8.4.1.1试验组:取供试液10ml加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中～加入上述大肠埃希菌10，100cfu菌液～臵30?，35?培养24小时后～取培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中～42?，44?培养24，48小时后～取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上～30，35?培养18，72小时。 方案编号:VOL-QWX-003 版本号:00 第4页 共13页 8.4.1.2阴性对照组:以等体积的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液～除不加菌液外～其他操作同试验组。 8.4.1.3阳性对照组:以等体积的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液～其他操作同试验组。 8.4.1.4供试品对照组:取供试液10ml加入100ml胰酪大豆胨液体培养基中～除不加菌液外～其他操作同试验组。 8.4.1.5实验结果:见表9。 8.4.2耐胆盐革兰阴性菌 供试液制备:取供试品10g～加胰酪大豆胨液体培养基100ml～制成1:10的供试液在20?，25?培养2小时。 8.4.2.1定性试验 试验组:取上述供试液10ml～加臵100ml肠道菌增菌液体培养基中～同时加入上述大肠埃希菌50，100cfu的试验菌～30?，35?培养24，48小时后～划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上～30?，35?培养18，24小时～观察结果。其它实验菌株同法操作。 8.4.2.2阴性对照组:以等体积的胰酪大豆胨液体培养基代替供试液～除不加菌液外～其他操作同试验组。 8.4.2.3阳性对照组:以等体积的胰酪大豆胨液体培养基代替供试液～其他操作同试验组。 8.4.2.4供试品对照组:取供试液10ml加入100ml肠道菌增菌液体培养基中～除不加菌液外～其他操作同试验组。 8.4.2.5同定性试验法做相当于0.1g、0.01g、0.001g的供试品定量试验。若定性试验中～未检出耐胆盐革兰氏阴性菌～则不需要再进行定量试验。 8.4.2.6实验结果:见表9。 8.4.3沙门菌 供试液制备:取供试品10g～加胰酪大豆胨液体培养基100ml,混匀～30?，35?培养18，24小时。 8.4.3.1试验组:取上述培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中～同时加 0入上述乙型副伤寒沙门菌50，100cfu的试验菌～30，35C培养24h后,取少量 RV沙 0门增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上～30，35C培养48h后～观察结果。其它实验菌株同法操作。 方案编号:VOL-QWX-003 版本号:00 第4页 共13页 8.4.3.2阴性对照组:以等体积的胰酪大豆胨液体培养基代替供试液～除不加菌液外～其他操作同试验组。 8.4.3.3阳性对照组:以等体积的胰酪大豆胨液体培养基代替供试液～其他操作同试验组。 8.4.3.4供试品对照组:取供试品10g～加胰酪大豆胨液体培养基100ml～混匀～ 除不加菌液外～其他操作同试验组。 8.4.3.5实验结果:见表9，10。 9.验证结果 表1、试验用菌液检查,菌落计数单位:cfu, 乙型副伤试验 计 数 大肠埃 金黄色葡枯草芽孢 铜绿假 白色念珠菌黑曲霉菌 寒沙门菌 次数 方 法 希菌 萄球菌杆菌单胞菌 平皿法 1 平均 平皿法 2 平均 平皿法 3 平均 表2、白色念珠菌计数方法的验证,菌落计数单位:cfu～沙氏葡萄糖琼脂培养基, 试 验 菌液组 试验组 供试品对照组 方法 比值 次 数 菌落数 平均 菌落数 平均 菌落数 平均 1 平皿法 2 3 1 培养基 稀释法2 ,0.5ml/皿, 3 1 培养基 稀释法2 ,0.2ml/皿, 3 表3、黑曲霉计数方法的验证,菌落计数单位:cfu～沙氏葡萄糖琼脂培养基, 方案编号:VOL-QWX-003 版本号:00 第4页 共13页 试验 菌液组 试验组 供试品对照组 方法 比值 次数 菌落数 平均 菌落数 平均 菌落数 平均 1 平皿法 2 3 培养基 1 稀释法2 ,0.5ml/皿, 3 培养基 1 稀释法2 ,0.2ml/皿, 3 表4、金黄色葡萄球菌计数方法的验证,菌落计数单位:cfu～胰酪大豆胨琼脂培养基, 试 验 菌液组 试验组 供试品对照组 方法 比值 次 数 菌落数 平均 菌落数 平均 菌落数 平均 1 平皿法 2 3 培养基 1 稀释法2 ,0.5ml/皿, 3 培养基 1 稀释法2 ,0.2ml/皿, 3 表5、铜绿假单胞菌计数方法的验证,菌落计数单位:cfu～胰酪大豆胨琼脂培养基, 试 验 菌液组 试验组 供试品对照组 方法 比值 次 数 菌落数 平均 菌落数 平均 菌落数 平均 1 2 平皿法 3 培养基 1 方案编号:VOL-QWX-003 版本号:00 第4页 共13页 稀释法2 ,0.5ml/皿, 3 培养基 1 稀释法2 ,0.2ml/皿, 3 表6、枯草芽孢杆菌计数方法的验证,菌落数单位:cfu/ml～胰酪大豆胨琼脂培养基, 试验菌液组 试验组 供试品对照组 方法 比值 次数 菌落数 平均 菌落数 平均 菌落数 平均 1 平皿法 2 3 1 培养基 2 稀释法 ,0.5ml/皿, 3 培养基 1 稀释法2 ,0.2ml/皿, 3 表7、白色念珠菌计数方法的验证,菌落计数单位:cfu～胰酪大豆胨琼脂培养基, 试验 菌液组 试验组 供试品对照组 方法 比值 次数 菌落数 平均 菌落数 平均 菌落数 平均 1 平皿法 2 3 培养基 1 稀释法2 ,0.5ml/皿, 3 培养基 1 稀释法2 ,0.2ml/皿, 3 表8、黑曲霉计数方法的验证,菌落计数单位:cfu～胰酪大豆胨琼脂培养基, 方案编号:VOL-QWX-003 版本号:00 第4页 共13页 试验 菌液组 试验组 供试品对照组 方法 比值 次数 菌落数 平均 菌落数 平均 菌落数 平均 1 平皿法 2 3 培养基 1 稀释法2 ,0.5ml/皿, 3 培养基 1 稀释法2 ,0.2ml/皿, 3 表9、控制菌检查方法验证结果 控制菌 次数 方法 试验组 阴性对照组 阳性对照组 供试品组 1 常规法 大肠埃希菌 2 常规法 3 常规法 耐胆盐革兰 1 常规法 阴性菌 2 常规法 3 常规法 1 常规法 沙门菌 2 常规法 3 常规法 表10、控制菌耐胆盐革兰阴性菌定量实验检查方法验证结果 控制菌 次数 方法 试验组 阴性对照组 阳性对照组 供试品组 1 常规法 耐胆盐革兰阴性 2 常规法 菌,1:10, 3 常规法 1 常规法 耐胆盐革兰阴 2 常规法 菌,1:100, 3 常规法 方案编号:VOL-QWX-003 版本号:00 第4页 共13页 1 常规法 耐胆盐革兰阴性 2 常规法 菌,1:1000, 3 常规法 注:表中“+”表示试验结果检出控制菌,“-”表示试验结果未检出控制菌。 10.验证报告 验证总结报告 品名: 批号: 总体评价及验证结论: 评价人: 日期: 部 门 批准人: 日期: 质 量 部 验证总负责人 方案编号:VOL-QWX-003 版本号:00 第4页 共13页 书中横卧着整个过去的灵魂——卡莱尔 人的影响短暂而微弱,书的影响则广泛而深远——普希金 人离开了书,如同离开空气一样不能生活——科洛廖夫 书不仅是生活,而且是现在、过去和未来文化生活的源泉 ——库法耶夫 书籍把我们引入最美好的社会,使我们认识各个时代的伟大智者———史美尔斯 书籍便是这种改造灵魂的工具。人类所需要的,是富有启发性的养料。而阅读,则正是这种养料———雨果