血清清蛋白及γ－球蛋白的分离

血清清蛋白及γ－球蛋白的分离 血清清蛋白及γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定 目的要求 1( 1(熟悉蛋白质分离纯化的总体思路。 2( 2(掌握盐析、离心、层析、浓缩、电泳等技术在蛋白质分离纯 化中的综合作用。 3( 3(学会设计和制定分离纯化蛋白质的方法。 实验原理 血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类:清蛋白、α-球蛋白、1α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16,，2 100ml血清中约含1.2g左右。 首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度硫酸铵溶液溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。 用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中(因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。清蛋白、α,球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0;γ,球蛋白的PI为7.2左右。因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α,球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合;带正电荷的γ,球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有γ,球蛋白，从而使γ,球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下:用上述 方法分离得到γ,球蛋白是否纯净，单一。可将纯化前后的γ,球蛋白进行电泳比较而鉴定之。 提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。将醋酸铵溶液的浓度提高至0.3mol/L，则清蛋白被洗脱下来，此时收集的流出液即为纯化的清蛋白。 试剂和器材 1.试剂 (1)饱和硫酸铵溶液:称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70一80?水温中搅拌溶解。将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。 (2)葡聚糖凝胶G一25的处理:按每100ml凝胶床体积需要葡聚糖凝胶G一25干胶 25g。称取所需量置于锥形瓶中。每克干胶加入蒸馏水约30ml，用玻璃棒轻轻混匀，置于90,100?水温中时时搅动，使气泡逸出。1h后取出，稍静置，倾去上清液细粒。也可于室温中浸泡24h，搅拌后稍静置，倾去上清液细粒，用蒸馏水洗涤2,3次，然后加0.017mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。 (3)DEAE一32(二乙基氨基乙基一32)纤维素的处理:按100ml柱床体积需DEAE纤维素14g称取，每克加0.5mol,L盐酸溶液15ml，搅拌。放置30min(盐酸处理时间不可太长，否则DEAE纤维素变质)。加约l0倍量的蒸馏水搅拌，放置片刻，待纤维素下沉后，倾弃含细微悬浮物的上层液。如此反复数次。静置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4为止。加等体积lmol/L氢氧化钠溶液，使最终浓度约为0.5mol/L氢氧化钠，搅拌后放置30min，以虹吸除去上层液体。同上用蒸馏水反复洗至pH<7为止。虹吸去除上层液体，然后加入0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。 (4)0.0175mol,L磷酸盐缓冲液(pH6.3) A液:称取磷酸二氢钠(NaHPO4.2H0)2.730g溶于蒸馏水中，加蒸22 馏水稀释至1000ml。 B液:称取磷酸氢二钠(NaHPO4.12H0)6.269g，溶于蒸馏水中，22 加蒸馏水稀释至 1000mL。 取A液77.5ml，加于B液22.5ml，混匀后即成。 (5)20%磺基水杨酸溶液 (6)奈氏(Nessler)试剂应用液 贮存液;称取碘化钾(KI)7.58g于250ml三角烧瓶中，用蒸馏水5ml溶解，再加入碘(I) 5.5g溶解，加7,7.5gHg用力振摇10min(此2 时产生高热，须冷却)，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾液为止，过滤上清液倾入100ml容量瓶，洗涤沉淀，洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至100ml。 应用液:取贮存液75ml加10,NaOH 350ml，加水至500mL。 7)0.9,氯化钠溶液 ( (8)乙酸纤维素薄膜电泳有关试剂: (1)醋酸纤维素薄膜; (2)pH8.6 巴比妥缓冲液(离子强度0.06,0.07):取巴比妥0.83克，巴比妥钠6.38克，加蒸馏水加热溶解后，定容至500ml。 (3)染色液:取氨基黑10 B 0.5克，溶于50ml甲醇中，再加冰醋酸10ml，蒸馏水40ml混匀。 (4)漂洗液:95%乙醇4.5ml，冰醋酸 5ml，蒸馏水50ml混合。 (5)透明液:95%乙醇80ml，冰醋酸20ml混合。 2(器材 (1)人血清。 (2)层析柱。 (3)长滴管。 (4)电泳仪。 操作方法 1(盐析――中性盐沉淀 取正常人血清2.0ml于小试管中，加0.9,氯化钠溶液2.0ml，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml，混匀后于室温中放 置10min，3000r,min离心10min。用滴管小心吸出上清液置于试管中，即为血清清蛋白液。 离心管底部的沉淀加入0.6mL蒸馏水，振荡溶解，即为γ-球蛋白液。 2(脱盐――凝胶柱层析 (1)装柱:洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0ml洗脱液。一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。在凝胶表面可盖一园形滤纸，以免加入液体时冲起胶粒。 (2)上样与洗脱:可以在凝胶表面上加圆形尼龙滤布或滤纸使表面平整，小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析球蛋白溶液，小心缓慢加到凝胶床表面。打开下端出口，将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口，小心加入少量磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为0.5ml/min。 (3)洗脱液中NH与蛋白质的检查:取比色板两个(其中一个为4+ 黑色背底)，按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加20,磺基水杨酸溶液2滴，出现白色混浊或沉淀即示有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度;于另一比色板中，加人奈氏试剂应用液l滴，以观察NH出现的情况。合并球蛋白含量4+ 高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。 3(纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析 (1)DEAE纤维素处理:量取 DEAE-纤维素25mL，加0.5mol/L HCl 溶液50mL，搅拌后放置20min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，再用蒸馏水反复洗数次直至pH 4.0 为止。加等体积 0.5 mol/LNaOH 溶液，搅拌后放置20min，虹吸去除上清液，同上用蒸馏水反复洗至pH7.0为止。然后转移到烧杯内，加0.02mol/LpH 6.5醋酸铵缓冲液60mL放置30min。待装柱。 (2)装柱平衡:取层析柱1.5×20cm 1支，按以上装柱方法将处理好的DEAE-纤维素装入柱中，调节柱下端流速2 mL/min，用2倍柱床体积的醋酸铵缓冲液平衡。关闭下口夹。 (3)吸附洗脱:打开下口夹，使床面上的缓冲液流出，待液面降到凝胶床表面时，关闭出水口。 将脱盐后的γ-球蛋白溶液上柱吸附，方法与上述脱盐法相同。用0.02 mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液洗脱。同样待核酸蛋白检测仪开始出现峰时立即收集，流出的蛋白液即为纯化的γ-球蛋白溶液。。 再将脱盐后的清蛋白溶液上柱吸附，用0.06mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液洗脱，流出约6mL后，将柱上的缓冲液液面降至与纤维素床表面平齐。再改用0.3mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液洗脱，待核酸蛋白检测仪开始出现峰时立即收集，流出的蛋白液即为纯化的清蛋白液。 4(浓缩 经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ,球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴定，常需浓缩。收集较浓的纯化的γ,球蛋白溶液2ml，按每ml加0.2, 0.25gSephadex G一25干胶，摇动2,3min， 3000r,min 离心5min。上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液。 5(鉴定――乙酸纤维素薄膜电泳 血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.3。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，电泳移向正极。可分为五条区带。γ-球蛋白的等电点为7.3，在pH8.6的巴比妥缓冲液中，带的负电荷最少，在电场中比其它蛋白质移动速度慢。而清蛋白等电点为4.9，带 的负电荷最多，在电场中移动的速度最快。取三张醋酸纤维薄膜，分别点样:血清蛋白、清蛋白、γ,球蛋白，然后电泳鉴定纯度 注意事项 1(凝胶及DEAE纤维处理期间，必须小心用倾泻法除去细小颗粒。这样可使凝胶及纤维素颗粒大小均匀，流速稳定，分离效果好。 2(装柱是层析操作中最重要的一步。为使柱床装得均匀，务必做到凝胶悬液或DEAE纤维素混悬液不稀不厚，一般浓度为l:l，进样及洗脱时切勿使床面暴露在空气中，不然柱床会出现气泡或分层现象;加样时必须均匀，切勿搅动床面，否则均会影响分离效果。 3(本法是利用γ-球蛋白的等电点与α-、β-球蛋白不同，用离子交换层析法进行分离的。因此层析过程中用的缓冲液pH要求精确。 4(凝胶贮存:凝胶使用后如短期不用，为防止凝胶发霉可加防腐剂如0.02,叠氮钠。保存于4?冰箱内。若长期不用，应脱水干燥保存。脱水方法:将膨胀凝胶用水洗净。用多孔漏斗抽干后，逐次更换由稀到浓的乙醇溶液浸泡若干时间，最后一次用95,乙醇溶液浸泡脱水，然后用多孔漏斗抽干后，于60,80?烘干贮存。 6(离子交换剂的再生和保存;离子交换剂的价格较贵，每次用后只需再生处理便能反复使用多次。处理方法是:交替用酸、碱处理，最后用水洗至接近中性。阳离子交换剂最后为Na型，阴离子以Cl型是最稳定型，故阴离子交换剂处理顺序为碱一水一酸一水。由于上述交 换剂都是糖链结构。容易水解破坏，因此须避免强酸、强碱长时间浸泡和高温处理，一般纤维素浸泡时间为3-4h。 离子交换剂容易长霉引起变质，不用时，需洗涤干净，加防腐剂置冰箱内保存。常用0.02,叠氮钠防腐。叠氮钠遇酸放出有毒气体，也是剧毒与易爆的危险品。使用时要加倍小心。 除用凝胶层析法去除无机盐类外，最常用的去盐法就是透析。细的透析袋效率高，所需时间短。将透析袋一端折叠，用橡皮筋结扎，试验是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白质溶液。勿装太满，将袋的上端也结扎好，即可进行透析。开始可用流动的自来水，待大部分盐被透析出后，再改为生理盐水、缓冲液或蒸馏水。透析最好在较低的温度下，并在磁力搅拌器上进行。此法简单，易操作，仪器及试剂要求不高，但不如凝胶层析法效率高。 浓缩γ-球蛋白粗提液除上述方法外还可用透析袋浓缩。将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中，置入搪瓷盘内。透析袋周围可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物质在使用后(吸了大量水)都可以通过加温及吹风而回收;将装有蛋白质溶液的透析袋悬挂起来，用电风扇高速吹风(10?以下)，也可达到浓缩目的，以上两法虽不如 Sephadex G一25干胶快，但价格较便宜，方法也不烦琐。