人移植胰岛低血管再生

人移植胰岛低血管再生 人胰岛移植实验中的低水平血运重建 The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2002, 87(12):5418-5423 IF=5.799 摘 要:胰岛移植后初期是无血管的。虽然胰岛会迅速进行血管再生，但是不能确定再生血管能否为移植胰岛组织产生充足的氧。我们测量植入裸鼠1个月后的老鼠或人胰岛的氧分压、血流量和血管密度。用Clark型微电极测量组织氧分压，用激光多谱勒血流仪测量血液灌注，而血管密度通过西非单叶豆凝集素(BS-1)染色的组织学标本来确定。老鼠和人移植胰岛的氧分压都只有内源性老鼠胰岛的15-20%。此外，移植胰岛的血管密度比内源性老鼠和人胰岛的血管密度都低。移植胰岛的血流灌注大约是肾皮质血流量的50%。发现在供者年龄和人移植胰岛的血流灌注之间存在负相关的关系，供者年龄和这些移植胰岛的总血管密度之间的相关性也类似。总之，与内源性胰岛相比，人移植胰岛的的血管密度和氧分压都显著降低。这可能对临床胰岛移植将产生深远影响，因为差的血管移植可能显著增加需要用来免用胰岛素的胰岛细胞数量。 最近介绍的Edmonton方案表示，大多数严格遵循特定标准进行胰岛移植的1型糖尿病病人可以达到不依赖胰岛素的水平，例如，一种无类固醇免疫抑制剂规则。但是，胰岛移植的主要障碍是可用的人胰岛组织供应有限。因此，器官培植中优化胰岛移植，降低治愈糖尿病病人的胰岛需求数目是非常重要的。尽管如此，很少有研究参与胰岛移植中是否存在充分的血管再生。通常胰岛有复杂的肾小球样血管结构，确保胰岛的任何一部分都不远离动脉血。此外，动物研究证明胰岛外分泌腺的血液供应明显要高，与肾皮质中一样(~5-7ml/min*g)。这种特有毛细血管网和高血液灌注对于胰岛细胞氧气和营养的高输送量、对于分泌激素有效的分散到它们的靶器官都是必须的。但是，移植前对胰岛进行分离和培养，胰岛的血管被破坏、脱分化或变性。移植后早期，胰岛只能通过扩散作用从周围组织的血管中获得氧气和营养。移植胰岛在7-14天内进行血管重建，但是动物研究提出的问题是:新形成的血管是否有能力充分满足胰岛细胞旺盛的代谢需要。我们以前的记录表明同源老鼠移植胰岛的氧压和血液灌注都明显降低。这种低氧压和低血液灌注是否也能应用于人移植胰岛还不知道。现在的研究目标是测量老鼠和人的胰岛移植入无胸腺裸鼠移植后的氧压和血管密度。另外，测量移植胰岛的血液灌注，用来调查人移植胰岛血管密度和血液灌注与供体年龄是否具相关性。 材料和方法 动物 胰岛分离和培养:在β-细胞移植中，分离来自7个心脏停博的供体的人类胰岛(Brussels)并空运至Uppsala。器官供体的平均年龄是40+5年(范围，19-35)。在Brussels用电子显微镜进行胰岛分离和胰岛细胞活力的描述(86+3%)，进行胰岛细胞的成分(57+-4%胰岛素阳性细胞)和外分泌组织(<1%)计数。到达Uppsala后，将胰岛放入添加5.6mmol//l葡萄糖、10%(vol/vol)小牛血清0.17mmol/l卞青霉素和0.17mmol/l链霉素的RPMI1640培养基培养4-6天。这种成分的培养基对人类胰岛培养最有利。 雄性C57BL/6小鼠的胰岛用胶原酶消化，在添加51.1mmol//l葡萄糖、10%(vol/vol)小牛血清0.17mmol/l卞青霉素和0.17mmol/l链霉素的RPMI1640培养基中培养4-7天，培养基每2天换一次。 胰岛移植:培养之后，用制动管吸取C57BL/6老鼠的200-250个胰岛或0.6微升人胰岛，注入用阿佛丁[2.5%(vol/vol)用10g97%(vol/vol)2,2,2-三溴乙醇与10ml2-甲基2-丁醇溶解]麻醉的C57BL/6老鼠左侧肾小囊下面。 测量内源性和移植胰岛的氧压:用阿佛丁麻醉动物，置于手术台上，维持37度的体温，切开气管。聚乙烯输尿管插入右侧颈动脉和左侧颈静脉。前面的输尿管与一个Statham P23dB 压力传感器相连，用来监测平均动脉血压，而后面的输尿管用来连续灌注格林氏溶液(5ml/kg*h)，来补偿体液的流失。 左肋下侧边缘进行切口，支撑移植物的左肾固定于一个塑料杯中。肾脏内塞入浸泡过格林氏溶液的棉絮，外面覆盖一层矿物油以防止蒸发和保持湿润和体温。用改良的Clark微电极测量移植胰岛和相临肾实质的氧压。在立体显微镜下通过显微操作器将Unisense微电极(尖端外直径为2-6微米)插入组织中。移植胰岛和肾皮质都至少要测10次。计算每个组织和动物所有测量值的平均值，作为一项实验。为测量内源性胰岛的氧压，将胰腺裸露并固定，用以前描述过的同样的方法使其胰岛可见。每个动物至少要测三个或更多外侧胰岛和周围外分泌腺的氧压。同一胰岛要进行多次测量;取平均值作为一个胰岛的氧压值，然后一个动物的胰岛氧压值的平均值作为一项实验。氧压测量期间，血压、体温和组织温度也相继被与电脑相连的MacLab仪器记录下来。 移植胰岛血流量的测量:用具针状探针的激光多谱勒血流仪测量移植胰岛和相临肾皮质的血液灌注。用显微操作器将血流探针垂直定位于固定的组织表面，注意不要造成任何组织挤压。每个动物移植胰岛和相临肾皮质的血流至少要测三次，计算这些测量的平均值，作为一项实验。所有血流量值规定为任意组织灌注单位。由于尺寸太小，激光多谱勒血流仪不能确定内源性胰岛血液灌注。 血液和尿液参数测量:用尾部切尖得到的样品检测试剂条来确定血糖浓度。血流量和氧压测量结束时，收集血液样本做血球容积计和血液气体分析。pH小于7.30、po小于10kPa、pco22大于6.8kPa或血球容积小于40动物不用于研究。 光学显微镜评价:对照动物支撑移植物的左侧肾脏或胰腺在氧压和血流量测量之后就被移走，用10%(vol/vol)的甲醛固定，石蜡包埋。运用胰腺切除技术得到标准人胰腺样本，同样方法处理。胰腺供体的平均年龄58+9年(范围，26-74)。准备移植胰岛和胰腺的连续切片(5微米厚)，用西非单叶豆凝集素(BS-1)或荆豆染色，用苏木精进行复染色。阳性对照切片由BS-1染色和苏木精染色的老鼠肺石蜡切片组成。只有BS-1能对所有老鼠和人血管样本进行持续染色，因此在后续方案中选择BS-1染色。每个动物，胰腺或移植胰岛所有部位的BS-1染色切片，至少要选择12片来进行评价。在立体显微镜下(放大率600)确定内源性和移植胰岛的血管染色切片数目。移植物中，结缔组织包围着移植胰岛，因此，内分泌腺和结缔组织的血管数目要分开计数，由直接圆点计数法来确定两者的比列。用放大倍数为600的光学显微镜对移植胰岛内结缔组织和内分泌细胞的交叉重叠数目进行计数，每个移植胰岛中大约有12个区域(相当于~500个点)。调查的内源性和移植胰岛的面积由形态测量学计算机系统来决定。然后计算血管密度即染色血管数目/胰岛当量或移植面积(平方毫米)。 统计分析:所有值都规定为平均值+SEM。用ANOVA进行数据间的多重比较，用Bonferrni法进行P值校正。用简单线性回归方程进行相关分析。至于接受同一供体的两只老鼠，计算它们血管密度、po和血液灌注的平均值，在后面的统计计算中作为一个数据。P<0.05时，2 所有的比较被认为有统计学意义。 结果 体重和血糖浓度:调查动物体重平均值为27.5+0.4g(n=22)。所有实验老鼠糖耐量正常，进行氧压和血流量测量时，血糖浓度为6.1+0.3mmol/l(n=22)。实验组老鼠体重和血糖浓度无差异。 组织氧压:记录的结果显示:老鼠内源性胰岛组织pO约为40mmHg，而相邻的外分泌腺稍2 微要低些(~25mmHg)(图1)。同样，老鼠和人类移植胰岛组织氧分压降低也比较显著(图1)。靠近移植物的肾实质外侧组织pO约为15mmHg(图1)。 2 图1:内源性胰岛(黑色)、植入血糖含量正常裸鼠肾囊膜下的老鼠(白色)和人(斜纹)胰岛的平均PO。还给出了胰岛周围组织的pO值，分别是外分泌胰腺(黑色)和肾皮22 质(斜纹和白色)。移植一个月后进行测量。6-8个动物的所有测量值都表示为平均值+SEM，P<0.05时可与内源性胰岛相比。所有的比较都用ANOVA。 动脉血压和血流量测量:所有动物平均动脉血压值接近85mmHg，老鼠和人的移植胰岛血液灌注都大约是肾皮质血流量的50%(图2)，人供体的年龄范围是19-53岁。移植胰岛的供体年龄和血液灌注呈强烈的负相关(图3)。 图2:植入血糖含量正常裸鼠肾囊下的老鼠(白色)和人(斜纹)胰岛的血流量。还给出了接受移植物的肾皮质的血流量值。移植一个月后进行测量。6-8个动物的所有测量值都表示为平均值+SEM。 图3:人移植胰岛血流量与供体年龄有关。移植一个月后，测量植入血糖含量正常裸鼠肾囊下的人胰岛的血流量。注意加粗的圆点(箭头指示)表示两个差不多重叠的观察数据。用简单线性回归方程进行分析(n=7;r=0.91;P<0.05)。 血管密度:人肺部和内源性胰岛微血管内皮能进行苏木精染色，但老鼠内源性胰岛和老鼠、人移植胰岛的血管却未能上色。相比之下，三者毛细血管内皮都可以用BS-1染色(图4)。 染色的组织切片中，相当于未染色微血管的组织不能被识别。经苏木任何被调查的、BS-1 精和BS-1染色的人内源性胰岛中的血管数目相同(分别是1129+97和1012+60毛细血管/平方毫米;n=5)。BS-1染色切片的评价表明老鼠内源性胰岛血管密度比人内源性胰岛的高，但是老鼠和人移植物内分泌组织的毛细血管数目是一样的，并且都比内源性胰岛明显要低(图5)。移植物中，结缔组织基质环绕着人和老鼠的胰岛，其中毛细血管的数目比移植物内分泌部分的明显要高，因此移植物的平均血管密度也要高(图5)。结缔组织基质约占老鼠和人移植胰岛的30%。将人移植胰岛血管密度与供体年龄联系起来，二者在整个移植物中呈负相关(图6)，但是与移植物的内分泌腺或基质间隔不成负相关。 图4:微血管内皮(红色)用BS凝集素染色 A，人内源性胰岛(比例尺，20微米)B，植入肾小囊以下空间的人胰岛(比例尺，20微米)。 图5:老鼠和人内源性胰岛、植入血糖含量正常裸鼠肾囊下的老鼠和人胰岛的血管密度。给出了内分泌腺本身(黑色)和整个移植物(斜纹)的值。移植后一个月进行测量。6-8个动物的所有测量值都表示为平均值+SEM，P<0.05时可与老鼠内源性胰岛相比，P<0.05与对应的内源性胰岛比较。所有的比较都用ANOVA。 图6:整个移植物的血管密度与供体年龄有关。移植后一个月，测量植入血糖含量正常裸鼠肾囊下的人移植胰岛的血管密度。用简单线性回归方程进行分析(n=7;r=0.91;P<0.05)。 讨论 胰腺β-细胞通常对代谢活动和耗氧量有很高的要求，以满足胰岛素分泌的不同需要。为满足这些需求，胰岛组织必须有充足的氧气。在以前的研究中我们发现老鼠内源性胰岛的组织氧压大约40mmHg，而老鼠移植胰岛中的明显要低。现在的研究显示，老鼠和人胰岛移植入裸鼠后1个月，氧压都明显降低。这些研究结果表明，移植胰岛低氧压的情况并不局限于老鼠胰岛的同源移植，也存在于人胰岛移植。 移植胰岛组织的低氧合作用表明血管重建不足。但是，一般认为移植后7-14天内，移植胰岛会迅速血管化。研究目标是对啮齿目动物移植胰岛的血管进行定量，但是直到现在都没有比较移植胰岛和内源性胰岛血管密度的定量研究。现在的研究发现，与内源性胰岛相比，移植入肾囊下的老鼠和人胰岛的毛细血管密度都要低。至少对于老鼠胰岛来说，如果脾内或肝门静脉内移植入，并不会提高血管重建水平。老鼠和人移植胰岛血管的调查揭示移植物中每个胰岛周围的结缔组织的毛细血管数目巨大。老鼠胰岛肝门静脉内植入或注射入脾脏的实验中，我们已经有相同的研究结果。移植物中毛细血管不一致和看来似乎不恰当的分布的原因还不清楚。分散基质中高血管密度可能补偿了移植物内分泌腺部分的低血管密度。同样，这也显示内分泌组织血管重建的一些不足。很难将移植胰岛血管密度的结果和之前测量啮齿 目移植物血管的研究结果进行比较，因为Menger等和Heuser等只评价植入皮脂室的单个胰岛，而Merchant等没有提到内分泌腺和结缔组织部分是否要分开评价。 我们之前已经观察到，BS-1凝集素对啮齿目内源性和移植胰岛微血管进行染色能保持着色。BS-1对不同物种的血管内皮细胞染色，但很少对人类组织染色。现在的研究说明用凝集素染色非常适合人内源性和移植胰岛。有趣的是，苏木精凝集素对人内皮细胞具特异性，对内源性胰岛染色，而对人移植胰岛不着色。这进一步支持了人工移植胰岛新形成的毛细血管网来源于供体的观点。 激光多谱勒血流仪显示移植胰岛的血液灌注总计只有肾皮质血流量的50%左右，也就是说接近内源性胰岛血流量的50%。人和老鼠移植胰岛的血液灌注没有差异。在老鼠中用激光多谱勒技术记录的血流量同样低。在这篇文章中应该注意到激光多谱勒血流仪测量的是全血灌注，即组织中全部活动的血细胞。现在的研究和最近的一篇报道揭示大多数移植物内毛细血管是基质毛细血管，因此它可能对移植物物全血灌注有充分的贡献。但是，由于氧气扩散距离的局限性，可以预期内分泌腺部分毛细血管血流量主要作用是输送氧气到内分泌细胞。后者血流量必须远低于最近研究所记录的移植物的全部血流量。其实，实验中联合使用微电极和超声波探针，发现营养性移植胰岛血液灌注只有内源性胰岛中的10%左右。对动物实施胰腺部分切除技术，进行胰岛自体移植入肾囊以下，其内源性胰岛血流量的测量结果与此相同。但是，后面的这些实验中部分胰腺切除术的影响很难弄清。 人移植胰岛血液灌注随器官供体年龄降低。由于观察数据的数目有限(n=7)，所以实验必须小心，好像存在一个非常强烈的相互关系。有趣的是，供体年龄和移植物的血管密度总数也有一个相同的负相关关系。这些研究结果联合起来表明移植物中，越年轻供体的胰岛诱导血管形成的能力越强，机制仍待确定，可能与随年龄增长血管化因子产量的减少有关。如胰岛血管内皮生长因子或基本成纤维细胞生长因子。供体年龄和人移植胰岛氧压没有相关性。特定部位的组织氧压依赖于一些参数，即由血液灌注给该位点的氧气供应、氧气扩散能力、氧气 (依照Bohr方程，主要依赖于血液pH的改变)和细胞耗氧量。很难见到氧压和血液灌注之间的简单关系。尽管血管密度和组织氧压降低，移植胰岛仍保留功能性活动，可以由胰岛素免疫组织化学来证实。但是，还不能确定移植后胰岛的功能是否达到最佳。临床胰岛移植中，令人奇怪的是，即使运用Edmonton方案，仍有大量胰岛(>900000胰岛当量)依赖胰岛素。对胰岛瘤βTC3细胞细胞系进行研究显示低于25mmHgpO水平将细胞从有氧代谢2 逐渐转变为无氧代谢，同时伴随着乳酸产量的增加。pO低于7mmHg时可以发现βTC3细胞2 的胰岛素分泌减少。同样的，低于12mmHGg时，单个老鼠胰岛细胞(5-10个细胞)葡萄糖诱导的胰岛素分泌总数受到影响。 总之，人移植胰岛的血管密度降低，同时还伴随着一个较低的组织氧压。很明显需要尝试提高胰岛的血管重建水平，因为这可能降低依赖胰岛素的移植胰岛β细胞的数目。