三七总皂苷对低氧大鼠肺动脉压和肺组织p38

三七总皂苷对低氧大鼠肺动脉压和肺组织p38 三七总皂苷对低氧大鼠肺动脉压和肺组织 p38 ? 2438?国病理生理杂志ChineseJournalofPathoph();塑二 [文章编号]1000—4718(2010)l2—2438—04 三七总皂苷对低氧大鼠肺动脉压和肺组织 p38MAPK表达的影响:l: 梁瑛琦,贾旭广,石璐,吴成云,王万铁 (温州医学院教务处,病理生理学教研室3附属第二医院呼吸内科,浙江温州325035) [摘要]目的:探讨三七总皂苷(PNS)对低氧大鼠p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)表达的影响,及 预防低氧性肺动脉高压(HPH)的作用和机制.方法:将30只sD大鼠随机分为3组:正常对照组,低氧组和低氧 +PNS组.观察各组大鼠平均肺动脉压(mPAP),平均颈动脉压(mCAP)和右心室/(左心室+室间隔重量)比 [RV/(LV+S)],免疫组化法和RT—PCR法分别检测肺小血管壁磷酸化p38MAPK(P—p38MAPK)蛋白和肺组织 中mRNA的含量.结果:与对照组相比,低氧组大鼠mPAP,RV/(LV+S)明显升高,肺小动脉P—p38MAPK及肺 组织p38MAPKmRNA含量显着升高(P<0.05).低氧+PNS组mPAP,RV/(LV+s), P—p38MAPK及 肺小动脉 肺组织p38MAPKmRNA含量明显低于低氧组(P<0.05).结论:PNS具有显着预防HPH的作用,其机制可能与 其降低p38MAPKmRNA的表达有关. [关键词]三七总皂苷;肺动脉高压;低氧;p38MAP激酶 [中图分类号]R363[文献标识码]Adoi:10.3969/j.issn.1000—4718.2010.12.029 EffectofPanaxnotoginosideonpulmonaryarterialpressureandexpres- sionofp38MAPKinlungtissuesofhypoxicrats LIANGYing—ql一,JIAXu—guang,SHILu,WUCheng—yun,WANGWan—tie (Dean"sOff'we,DepartmentofPathophysiology,DepartmentofRespiratoryDisease,eSecondAffiliatedHospital, WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325035,Chino.E—mail:wzwwt@tom.corn) [ABSTRACT]AIM:ToobservetheeffectofPanaxnotoginoside(PNS)onthepulmonarya~erypressureandthe D38mitogen— activatedproteinkinase(p38MAPK)inlungtissuesofratstreatedwithhypoxia.METHODS:Thirtyaduh maleSDratswererandomlydividedinto3groups.Theratsinnormalcontrolgroupwereexposedtonormalconditions,the ratsinhypoxiagroupwereexposedtoisobarichypoxia,andtheratsinhypoxia+PNSgroupweretreatedwithPNSunder theconditionofhypoxia.After4weeksoftreatment,themeanpulmonaryarterialpressure(mPAP)andthemeancarotid arterialpreSSHre(mCAP)weremeasuredbycardiaccatheterization.Theheartwasisolated,andtherightventricle(RV), leftventricleplusventricularseptum(LV+S)were'weighedtocalculatetheratioofRv/(LV+S).Thequantityofphos— pho—p38MAPK(P— p38MAPK)inratpulmonaryarterioleswasdeterminedbythemethodofimmun0hist0chemistryand themRNAcontentofp38MAPKwastestedbyRT— PCR.RESULTS:ThemPAPandRV/(LV+S)inhypoxiagroup werehigherthanthoseinnormalcontrolgroup.TheexpressionofP— p38MAPKinratpulmonaryarteriolesandp38 MAPKmRNAinthelungtissueswerehigherthanthoseinnormalcontrolgroup(P<0.05).ThemPAP,RV/(LV+S), theexpressionofP—p38MAPKinratpulmonaryarteriolesandp38MAPKmRNAinthelungtissuesinhypoxia+P NS groupweresignificantlylowerthanthoseinhypoxiagroup(P<O.05).CONCLUSION:P NSpossessesthepreventiveand therapeuticeffectonhypoxicpulmonaryhypertensionbydecreasingP——p38MAPKanddown——regulationofp38MAPK mRNAinthelungs, [KEYWORDS]Panaxnotoginoside;Pulmonaryarterialhypertension;Hypoxia;p38MAP K 低氧性肺动脉高压(hypoxicpulmonaryhyperten— sion,HPH)是慢性阻塞性肺部疾病(chronicobstruc. [收稿日期]2009—10—27[修回日期]2010—10—14 [基金项目]浙江省科技攻关资助项目(No.2006C33073) ?通讯作者Tel:0577—86689817;E—mail:wzwwt@tom.con tirepulmonarydisease,COPD)发展至肺心病的中心 环节,寻求理想的抑制肺动脉高压药物一直是防治 肺动脉高压,肺心病的关键.p38MAPK(p38mito- gen—activatedproteinkinase)是丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen—activatedproteinkinases,MAPKs)家族中 重要成员之一,p38MAPK的激活介导了多条信号转 导通路,并参与细胞生长,分化和凋亡等多种功能的 调节?'.有研究表明J,p38MAPK及其信号途径 在慢性低氧性肺动脉高压(hypoxiepulmonaryhyper. tension,HPH)中起着一定的作用.三七总皂苷(Pa— naxnotoginoside,PNS)具有扩张血管,减少氧自由基 的生成和特异性阻断血管平滑肌受体门控Ca?通 道的作用.本研究在慢性HPH大鼠模型上,观察 PNS对p38MAPK表达的影响,旨在进一步探讨PNS 对肺动脉高压的防治作用及其机制,为拓展其临床 新用途提供实验依据. 材料和方法 1动物分组与处理 健康雄性Sprague—Dawley(SD)大鼠30只(温 州医学院实验动物中心提供),体重200—220g,随 机分为对照组,低氧组和低氧+PNS组,每组10只, 置于同一实验室内,均自由饮水和摄食.低氧+PNS 组每日进舱前30min腹腔注射PNS注射液(50 mg?kg,?d..,昆明兴中制药厂生产,商品名为血 塞通注射液,批号为000508),其余各组大鼠腹腔注 射等量生理盐水.低氧组和低氧+PNS组大鼠于腹 腔注射后放置于常压低氧舱内,向舱内充氮气,根据 自动测氧仪显示结果调节O,浓度至9%一11%,舱 内CO,以钠石灰吸收,舱内水蒸气以无水氯化钙吸 收,每天放置8h,每周6d,共4周,3组动物饲养及 饮食条件相同 2血流动力学的测定 低氧4周后,大鼠腹腔注射5%水合氯醛(7mL/ kgBW)麻醉,仰卧固定于手术台上,行颈正中切口, 分离右颈外静脉和左颈总动脉.采用右心导管法自 颈外静脉插管至肺动脉,并行颈总动脉插管,经Pow— erLab生理记录仪分别测定平均肺动脉压(meanpul— monaryarterialpressure,mPAP)及平均颈动脉压 (meancarotidarterialpressm'e,mCAP). 3右心室肥大指数测定 麻醉后行颈动脉放血处死动物,迅速剪开胸腔 取出心肺,剪去右心房组织,沿室间隔边缘剪下右心 室,分别称取右室(rightventricle,RV)和左室加室间 隔(1eftventricle+septum,LV+S)的重量,并计算出 右心室/(左心室+室间隔)[rightventricle/leftyen— tricle+septum,RV/(IV+S)]的重量比,作为右室 ? 2439? 肥大的指标. 4免疫组织化学染色方法检测肺小血管壁P—p38 MAPK蛋白的表达 采用SABC法,参照试剂盒使用说明书操作.取 新鲜肺组织石蜡包块切片,切片脱蜡至水.以SABC 试剂盒(武汉博士德生物产品)进行免疫组化染 色,用Olympus显微照像,采用美国Image—ProPlus 5.0彩色图像分析系统测定阳性部位及背景的吸光 度值,以阳性部位的吸光度值减背景的吸光度值代 表阳性部位的吸光度(A)值. 5RT—PCR方法检测肺组织p38MAPKmRNA 表达 按试剂盒说明提取肺组织总RNA,紫外分光测 定A?/A蜘确定其纯度和量.取总RNA逆转录合成 cDNA(65oC1min,30oC5min,65?15min,98? 5min),反应体系为2lL.取逆转录产物进行PCR 反应(94?3min,94oC30s,55?30S,72oCl min,32个循环;72qC5min),反应体系为80.扩 增p38MAPK的引物为5'一1TrACGACCCGAG TGACGA一3'.5'一AGGGCTGCCAGGAGGAAT 一 3',片段长度为344bp;扩增内对照13一actin的引 物为5'一TCAGGTCATCACTATCGGCAAT一 3',5'一AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA一3', 片段长度为458bp. 6统计学处理 数据以均数?差(?s)表示.采用SPSS 12.0统计软件进行方差分析(ANOVA),t检验. 结果 1PNS对慢性HPH大鼠血流动力学的影响 低氧组mPAP显着高于对照组,低氧+PNS组 显着低于低氧组(P<0.05);同时,低氧组右心室重 量比RV/(LV+S)明显高于对照组,低氧+PNS组 明显低于低氧组(P<0.05);3组之间,mCAP无显着 差异(P>0.05),表1. 表1各组大鼠mPAP,mCAP,RV/LV+S的变化 Table1.ThechangesofmPAP.mCAPandRV/LV+Sinvari— OUSgroups(4-s.n=8) P<0.05vsnormalcontrolgroup:P<0.05shypoxia group? 2各组肺d~all管壁P—p38MAPK蛋白表达变化 对照组肺小动脉壁P—p38MAPK表达呈弱阳 性,低氧组P—p38MAPK表达明显增多,低氧+PNS 组P—p38MAPK表达较低氧组减弱(均P<0.05), 见图1,表2. 》 Figure1.TheexpressionofP—p38MAPKproteininpulmonaryarteriolewallofrats(IHC,×400).A:normalcontrolgroup;B:hypox? iagroup;C:hypoxia+PNSgroup 图1大鼠肺小动脉管壁P—p38MAPK蛋白的表达 表2各组大鼠肺小动脉壁P—p38MAPK及肺组织P—p38 MAPKmRNA的表达 Table2.TheexpressionofP—p38MAPKinthepulmonaryarte? ridesandp38MAPKmRNAinlungtissuesin3groups (露?s.n=8) GroupP—p38MAPKp38MAPK/~一aetinmRNA P<0.05normalcontrolgroup:P<0.O5似hypoxia group? 3各组大鼠肺组织p38MAPKmRNA相对含量的 变化 对照组大鼠肺组织有较弱的p38MAPKmRNA 表达,低氧组表达明显上调(P<0.05),低氧+PNS 组p38MAPKmRNA表达较低氧组显着降低(P< 0.05),见表2,图2. 500bp 250bp 100bp It-actin p38MAPK MI23456 Figure2.Theexpressionofp38MAPKmRNAinlungtissuesof rats.M:marker;Lanel.4:normalcontrolgroup; Lane2,5:hypoxiagroup;Lane3.6:hypoxia+PNS group? 圈2各组大鼠肺组织p38MAPKm_ll~A衰达 4肺小动脉壁P—p38MAPK蛋白表达与mPAP, Rv/LV+S及p38MAPKmRNA的相关性分析. 在各组低氧性肺动脉高压大鼠中,肺小动脉壁 P—p38MAPK蛋白均与mPAP,RV/(LV+S),p38 MAPKmRNA呈正相关(r分别为0.5800,0.5713和 0.6197.均P<0.01). 讨论 p38MAPK信号途径是MAPK家族中的重要组 成部分,它可因生理性应激,脂多糖,渗透性应激和 紫外线照射而激活l,慢性缺氧时p38MAPK系统 的改变可能是肺动脉压升高,右心室肥大的重要机 制.PNS是五加科人参属植物三七的主要有效活性 成分,含有多种单体皂苷,具有扩张血管,降低心肌 耗氧量,减轻心肌炎心肌损伤h4J,抑制血小板凝集, 延长凝血时间,降血脂,清除自由基,抗炎,抗氧化等 药理作用J,主要用于心脑血管系统疾病和中枢神 经系统疾病的治疗.PNS降低肺动脉压的作用是否 与p38MAPK系统有关,尚未见有报道. 本研究采用常压低氧法建立大鼠HPH模型,低 氧4周后,低氧组大鼠mPAP显着升高,出现肺小血 管重塑,提示形成了HPH;而且RV/(LV+S)增加, 进一步说明存在HPH并导致右心室肥厚.p38 MAPK是MAPK家族的一员,是生物体内重要的信 号系统之一.它是缺血,低氧,激素,生长因子及细 胞因子等各种细胞外刺激诱导基因表达,细胞增殖 分化,转化及凋亡等信息传递途径的交汇点和共同 通路].在体外培养的新生鼠心肌细胞上,缺氧/复 氧可同时激活ERK,p38MAPK和JNK这3类 酶引.Seko等发现缺氧可激活分裂原活化蛋白 -1._J 一t?,. 激酶激酶激酶,即有活性的Raf一1蛋白.Raf一1又 可相继激活分裂原活化蛋白激酶激酶,分裂原活化 蛋白激酶和S6激酶,MAPKs和S6激酶又可分别激 活分裂原活化蛋白和核糖体蛋白S6,MAP激酶和S6 激酶都可使体内转录因子如C—los,C—jun等磷酸化 而调节其活性,从而影响基因的表达.本实验研究 显示,p38MAPK蛋白及mRNA在正常对照组肺小动 脉壁和肺组织中有少许表达,缺氧4周时显着增加, 提示其可能参与了大鼠肺动脉高压形成的病理生理 过程. 据报道,PNS可预防慢性低氧性肺动脉高压的 形成?,本实验结果显示,低氧+PNS组与低氧组相 比,mPAP与RV/(LV+S)明显下调,提示PNS具有 降低慢性HPH和右心室肥大的作用,与以往的研究 相符.在本实验中首次发现,PNS可进一步降低低 氧大鼠P—p38MAPK蛋白及mRNA的水平.据此, 推测PNS降低肺动脉高压大鼠肺小动脉壁P—p38 MAPK蛋白表达,下调肺组织p38MAPKmRNA表 达,可能是其降低HPH大鼠肺动脉压的作用机制之 一 .综上所述,PNS具有降低HPH大鼠肺动脉压的 作用,该作用至少部分是通过调节p38MAPK系统 的表达来实现的,而其具体的调节机制尚有待进一 步探讨. [参考文献] [1]KanW,ZhaoKS,JiangY,eta1.Roleofp38mitogen— activatedproteinkinaseinsignaltransductionofinducible nitricoxidesynthaseexpression[J],Shock,2004,21(3): 281—287. ? 244l? [2]刘忠,李闪,朱建华,等.不同年龄高血压大鼠血管 平滑肌中ERK和MKP一1的表达[J].中国病理生理 杂志,2006,22(3):468—471. [3]申严,戴爱国.丝裂原活化蛋白激酶与_y谷氨酰半 胱氨酸合成酶在大鼠慢性阻塞性肺疾病肺组织中的表 达[J].中华结核和呼吸杂志,2005,28(4):276—277. [4]褚茂平,徐正,张晓隆,等.小鼠自身免疫性心肌炎心 肌ICAM一1的表达变化及三七总皂苷的干预作用 [J].温州医学院,2007,37(3):203—205. [5]OnoK,HanJ.Thep38signaltransductionpahtway:acti- vationandfunction[J].CellSignal,2000,12(1):1—13. [6]何晶.三七的药理作用及研究进展[J].天津药学, 2004,16(4):58—60. [7]YueTL,WangC,Gu儿,eta1.Inhibitionofextracellular signal—regulatedkinaseenhancesischemia/reoxygenation —- inducedapoptosisinculturedcardiacmyocytesandCX— aggeratesreperfusioninjuryinisolatedperfusedheart[J]. CircRes,2000,86(6):692—699. [8]YinJ,ChaufourX,McLachlanC,eta1.Apoptosisofvas— cularsmoothmusclecellsinducedbycholesterolandits oxides/nvitroandinvivo[J].Atherosclemsis,2000,148 (2):365—374. 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